Приложение 6.5.2. Оценка кожной сенсибилизации по реакции региональных лимфоузлов

Приложение 6.5.2

Оценка кожной сенсибилизации по реакции региональных лимфоузлов

Идентичен международному документу OECD TG N 429 "Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay" (ОЭСР Руководство N 429 "Кожная сенсибилизация: исследование реакции региональных лимфоузлов"). Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о способности исследуемого вещества вызывать кожную сенсибилизацию в тесте in vivo на мышах путем радиоизотопного анализа скорости пролиферации лимфоцитов региональных лимфоузлов. Полученная информация может быть использована для классифицикации веществ в соответствии с СГС по данному виду токсичности.

1.2. До проведения эксперимента должна быть рассмотрена вся доступная информация об исследуемом веществе. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro; токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация является необходимой для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

2. Общие положения

2.1. Метод оценки кожной сенсибилизации мышей по реакции региональных лимфоузлов (Local Lymph Node Assay, LLNA) предназначен для выявления химических веществ, обладающих способностью вызывать кожную сенсибилизацию.

2.2. Метод LLNA является альтернативным по отношению к исторически более раннему методу оценки кожной сенсибилизации в опытах на морских свинках (МР 406, "Испытания по оценке кожной сенсибилизации") и имеет перед последним ряд преимуществ - возможность сократить количество животных, уменьшить проявления боли и дистресса, получить более точную количественную оценку эффекта.

2.3. Метод LLNA основан на измерении скорости пролиферации лимфоцитов в лимфоузлах, дренирующих участок накожного нанесения тестируемого вещества. Скорость пролиферации лимфоцитов, выделенных из лимфоузлов, оценивается методом радиоизотопного анализа.

2.4. Критериальным показателем в тесте LLNA является значение индекса стимуляции (ИС), измеряемого как отношение скорости пролиферации лимфоцитов в опытной и контрольной группах мышей.

3. Принцип метода

3.1. Первый вариант Руководства ОЭСР по оценке кожной сенсибилизации у мышей путем изучения реакции региональных лимфоузлов (the Local Lymph Node Assay, LLNA) был принят в 2002 году [1], второй (переработанный) вариант - в 2010 году.

3.2. Основной принцип, лежащий в основе LLNA, заключается в том, что сенсибилизаторы обладают способностью ускорять пролиферацию лимфоцитов в тех лимфатических узлах, которые дренируют место нанесения исследуемого вещества. Скорость пролиферации лимфоцитов при этом пропорциональна дозе и мощности нанесенного на кожу аллергена, что обеспечивает возможность количественно оценить способность вещества вызывать сенсибилизацию. Скорость пролиферации лимфоцитов оценивают путем сравнения средних значений пролиферации в каждой опытной группе животных со средним значением пролиферации в контрольной группе (КГ), подвергнутой нанесению растворителя. Для этого определяют отношение среднего значения пролиферации лимфоцитов в каждой экспериментальной группе животных к среднему значению пролиферации в соответствующей КГ, называемое Индексом Стимуляции (ИС); критерием для отнесения тестируемого вещества к классу потенциально способных вызывать кожную сенсибилизацию является значение . Методы измерения количества пролиферирующих клеток в околоушных лимфоузлах, дренирующих участок нанесения тестируемого препарата, описанные в данном документе, основаны на использовании радиоизотопного анализа in vivo. Однако могут применяться и другие способы оценки количества пролиферирующих клеток, при условии полного удовлетворения требованиям Стандартов соответствия (прилож. 6.5.2.1).

3.3. Метод LLNA является альтернативным по отношению к исторически более ранним методам оценки кожной сенсибилизации в опытах на морских свинках (МР 406, "Испытания по оценке кожной сенсибилизации"), в частности в тесте максимизации на морских свинках и тесте Бюхлера. С точки зрения гуманного отношения к экспериментальным животным LLNA имеет преимущества над МР 406. Это не означает, что метод LLNA должен использоваться во всех случаях вместо тестирования на морских свинках (МР 406), скорее эти методы равнозначны и могут быть использованы как альтернативные, в которых положительные и отрицательные результаты, как правило, не требуют дальнейшего подтверждения.

3.4. Метод LLNA изучает фазу индукции кожной сенсибилизации и позволяет получить количественные данные, необходимые для оценки зависимости доза-эффект. Следует отметить, что слабые/умеренные сенсибилизаторы, которые рекомендуются в качестве подходящего положительного контроля (ПК) в тестах на морских свинках (OECD TG 406), пригодны и для использования в LLNA.

3.5. В данном документе описывается также редуцированный вариант LLNA (rLLNA), позволяющий сократить расход животных на 40%. Метод rLLNA может быть использован в тех случаях, когда необходимо официально подтвердить имеющийся прогноз об отсутствии у данного химического вещества свособности к кожной сенсибилизации с соблюдением всех деталей протокола LLNA. Перед применением метода rLLNA следует предоставить ясную мотивацию и научное обоснование для его использования. Если, вопреки ожиданиям, в rLLNA будет получен положительный или сомнительный результат, потребуется дополнительное тестирование для интерпретации или выяснения причин обнаруженного эффекта. Метод rLLNA не должен использоваться для определения степени опасности испытываемого вещества в тесте кожной сенсибилизации, когда требуется информация о зависимости доза-эффект, в частности при классификации в соответствии с СГС.

3.6. Перед проведением исследования в тесте LLNA испытательная лаборатория должна изучить все имеющиеся сведения о тестируемых веществах. Эти сведения должны включать информацию о подлинности и химической структуре исследуемого вещества, его физико-химических свойствах, а также результаты любых других тестов на токсичность исследуемого вещества in vitro или in vivo, включая токсикологические данные по структурно близким веществам. Эта информация должна быть рассмотрена с целью определения, подходит ли метод LLNA для тестирования испытываемого вещества и для подбора диапазона доз.

3.7. LLNA является методом in vivo и, как следствие, не исключает использование животных в оценке аллергического контактного раздражения. Однако использование данного метода дает возможность уменьшить количество животных, требующихся для тестирования. Кроме того, LLNA предлагает существенное улучшение условий (уменьшение боли и дистресса) для животных, использующихся при оценке контактной аллергической сенсибилизации. Метод LLNA основан на изучении иммунологических реакций, стимулируемых химическими веществами в фазе индукции развития контактного раздражения. В отличие от тестов на морских свинках (МР 406), LLNA не требует регистрации кожных реакций гиперчувствительности, вызванных нанесением вещества. Кроме того, LLNA не требует использования адъювантов, как это имеет место в тесте максимизации на морских свинках. Таким образом, LLNA уменьшает болевые ощущения и проявления дистресса у лабораторных животных.

3.8. Несмотря на преимущества LLNA над МР 406, следует признать, что есть определенные ограничения, которые могут потребовать применения МР 406. В частности, некоторые металлы дают в LLNA ложноотрицательные эффекты, а некоторые кожные ирританты - например некоторые разновидности сурфактантов - ложноположительные; ограничения могут быть также связаны с растворимостью тестируемого вещества. Кроме того, необходимость использования тестов на морских свинках (МР 406) может возникнуть при тестировании определенных типов химических веществ или веществ, содержащих определенные функциональные группы, если известно, что они могут вызывать побочные эффекты, искажающие результаты LLNA. Далее, анализ имеющейся на настоящий момент базы данных по результатам параллельного использования LLNA и тестов на морских свинках, проводившегося в основном для пестицидных препаратов, показывает, что метод LLNA чаще дает положительные эффекты для данной категории химических веществ, чем тесты на морских свинках. Тем не менее при тестировании таких препаратов можно включать в опыт в качестве положительного контроля сходные вещества с известным эффектом, чтобы убедиться в адекватности результатов, получаемых с помощью метода LLNA. Помимо этих выявленных ограничений, метод LLNA может применяться для тестирования любых химических веществ, кроме тех, для которых уже имеются данные, свидетельствующие об их потенциальной возможности искажать результаты LLNA.

4. Описание метода

4.1. Подготовка к опыту

4.1.1. Выбор видов животных.

Для проведения данного метода используются мыши. Используются молодые половозрелые, нерожавшие и небеременные самки мышей линий СВА/Са или СВА/J. Возраст животных в начале исследования должен быть в диапазоне 8-12 недель, различия в весе животных должны быть минимальны и не превышать 20% от их среднего веса. Альтернативно могут использоваться самки других линий мышей, а также самцы мышей, если имеется достаточно данных для доказательства отсутствия существенных различий в результатах метода LLNA при использовании данной линии или пола мышей.

4.1.2. Условия содержания и питания животных.

Мыши должны размещаться по клеткам в соответствии с разделением на экспериментальные группы, если не предусматривается адекватное научное обоснование для индивидуального размещения животных. Температура в помещении, предназначенном для экспериментов на животных, должна составлять . Относительная влажность воздуха должна быть не менее 30 и не более 70% (последнее - исключая моменты влажной уборки помещения), оптимальный диапазон влажности - 50-60%. Освещение должно быть искусственным, с чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Для кормления могут использоваться обычные лабораторные диеты с неограниченным доступом к питьевой воде.

4.1.3. Подготовка животных.

Животных отбирают случайным образом, маркируют для индивидуальной идентификации (любым способом, не затрагивающим область ушей) и содержат в клетках в течение, по крайней мере, пяти дней до начала введения тестируемого вещества, чтобы обеспечить их акклиматизацию к лабораторным условиям. До начала воздействия всех животных осматривают на предмет отсутствия видимых кожных повреждений.

4.1.4. Подготовка дозированных растворов.

Перед нанесением на уши мышей твердые исследуемые вещества следует растворить или суспендировать в подходящих растворителях/базовых жидкостях и сделать необходимые разведения, если это нужно. Жидкие исследуемые вещества можно наносить неразбавленными; их разбавление растворителем производится только для получения рабочих растворов нужных концентраций. Нерастворимые вещества, которые часто используются в медицинских аппаратах, перед нанесением на уши мышей должны быть подвергнуты достаточно длительной экстракции в подходящем растворителе с целью выделения всех способных экстрагироваться компонентов. Растворы исследуемых препаратов следует готовить ежедневно - кроме тех случаев, когда известна их стабильность и она допускает хранение растворов в течение определенного времени.

Контроль качества

4.1.5. Положительные контроли (ПК) используются для демонстрации надлежащего качества проведения анализа; с этой целью используются вещества с хорошо известной способностью к кожной сенсибилизации, позволяющие убедиться в адекватных и воспроизводимых результатах используемой тест-системы. Рекомендуется включать ПК в каждый проводимый эксперимент, поскольку это демонстрирует компетентность лаборатории и ее способность тщательно проводить исследования, а также позволяет оценивать внутри- и межлабораторную воспроизводимость и сравнимость результатов данного теста. Использования ПК в каждом эксперименте требуют также некоторые контролирующие органы, поэтому заказчикам рекомендуется консультироваться по поводу проведения теста LLNA в соответствующих ведомствах. Далее, постоянное использование параллельных ПК дает возможность избежать потребности в дополнительном тестировании на животных, чтобы решить те проблемы, которые могут возникать при периодическом (время от времени) использовании ПК. Положительный контроль должен дать положительный эффект в методе LLNA на том уровне экспозиции, на котором ожидается увеличение ИС > 3 по сравнению с группой отрицательного контроля (ОК). Дозу ПК следует выбирать так, чтобы она не вызывала чрезмерной реакции воспаления кожи ушей или реакций системной токсичности; положительный эффект ПК должен быть воспроизводимым, но не избыточным (ИС должен быть не больше 20). Предпочтительными веществами для использования в качестве ПК являются 25%-й раствор гексилкоричного альдегида (CAS N 101-86-0) в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1, v/v) и 5%-й раствор меркаптобензотиазола (CAS N 149-30-4) в NN-диметилформамиде (см. прилож. 6.5.2.1, таблица). Возможны обстоятельства, при которых, с учетом достаточной обоснованности, в качестве ПК могут использоваться и другие вещества, удовлетворяющие вышеупомянутым критериям.

4.1.6. Несмотря на то, что ПК рекомендуется использовать в каждом опыте, возможны интервалы (не реже одного раза в полгода), в частности для лабораторий, которые используют метод LLNA регулярно (не реже чем раз в месяц) и имеют солидную базу экспериментальных данных с включением ПК, демонстрирующую способность лаборатории получать воспроизводимые и точные результаты. Достаточность профессиональных навыков для проведения LLNA может быть успешно продемонстрирована при наличии минимум 10 отдельных опытов с использованием ПК, проводившихся не реже, чем один раз в год, и дававших ожидаемые по выраженности положительные эффекты на введение ПК.

4.1.7. Всегда следует включать параллельно группу ПК, если возникают какие-либо изменения в процедуре проведения LLNA (например, замена обученного персонала, смена поставщиков материалов, реагентов и лабораторных животных, замена используемого оборудования), и такие изменения должны быть зарегистрированы в отчете. Следует рассмотреть влияние проводимых изменений на соответствие данных ранее полученным и оценить необходимость формирования новой базы данных для достижения непротиворечивости в документации результатов ПК.

4.1.8. Исследователи должны понимать, что решение применять ПК на периодической основе вместо постоянного параллельного использования сказывается на уверенности в том, что новые вещества, тестировавшиеся в промежутке между опытами с включением ПК и давшие в них отрицательный результат, действительно не обладают способностью к кожной сенсибилизации. В частности, если при периодическом использовании ПК вдруг обнаружится сбой системы в виде ложноотрицательного эффекта в группе животных ПК, под сомнением окажутся не только результаты данного эксперимента, но и результаты всех остальных, проведенных в промежутке между данным экспериментом и последним из тех, в которых ПК давал ожидаемый положительный эффект. Вероятность таких последствий должна тщательно оцениваться при решении вопроса о включении ПК параллельно с каждым опытом или только периодически. Следует также обсудить возможность использования меньшего количества животных в параллельной группе ПК, если это оправдано с научной точки зрения и если лаборатория докажет, основываясь на своей базе данных, что возможно использование меньшего количества мышей.

4.1.9. Несмотря на то что препараты, использующиеся в качестве ПК, должны наноситься в растворителе с известным ответным эффектом (например, ацетон: оливковое масло; 4:1 v/v), возможны ситуации, в которых будет также необходимо провести исследование на нестандартном растворителе (клинически/химически соответствующий препарат). Если вещество положительного контроля и тестируемое вещество наносятся в разных растворителях, следует включить в опыт отдельный контроль на растворитель ПК.

4.1.10. В случаях, когда оцениваются исследуемые вещества определенного химического класса или диапазона ответных реакций, можно также использовать "реперные" вещества того же класса с известной активностью в LLNA, которые будут доказывать, что метод LLNA адекватен для выявления потенциальной кожной сенсибилизации к исследуемым веществам данного класса. Вещества, предназначенные для "реперного" тестирования, должны иметь следующие свойства:

- структурное и функциональное подобие классу исследуемого вещества;

- известные физические/химические характеристики;

- дополнительные данные по активности в тесте LLNA;

- дополнительные данные по другим тестам на животных и/или на человеке.

4.2. Процедура исследования

Количество животных и выбор доз

4.2.1. В каждую экспериментальную группу включают, как минимум, четырех животных, всего тестируют, как минимум, три концентрации исследуемого вещества плюс параллельные группы негативного контроля (НК) для тестирования растворителя исследуемого вещества и положительного контроля (ПК); последняя может быть включена в данное исследование или данные берутся из недавно проведенного исследования, в зависимости от политики лаборатории по данному вопросу. Следует обсудить вопрос о количестве доз ПК, особенно при периодическом использовании ПК. Уход и все манипуляции с животными в контрольных группах должны быть идентичны тем, которые используются для экспериментальных групп, за исключением введения самого тестируемого вещества.

4.2.2. Выбор доз тестируемого вещества и растворителя должен быть обоснован. Последовательные дозы обычно выбираются из подходящего ряда концентраций, например 100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5% и т.д. Выбор используемого ряда концентраций следует сопровождать адекватным научным объяснением. Следует предварительно изучить всю доступную информацию по токсичности данного вещества (например острой токсичности и способности вызывать раздражение кожи), его структуре и физико-химическим свойствам, а также аналогичные характеристики близких по структуре веществ; на основании анализа этих данных выбирают три концентрации, так чтобы самая высокая концентрация вызывала как можно более выраженный эффект, но при этом не обладала системной токсичностью и/или не вызывала чрезмерного раздражения кожи на месте нанесения. При отсутствии такой информации может возникнуть необходимость в проведении предварительного пробного опыта.

4.2.3. Растворитель не должен искажать результаты исследования или косвенно влиять на них; следует выбирать растворитель по критериям максимальной растворимости в нем тестируемого вещества, с тем чтобы получить наиболее высокую исходную концентрацию; в то же время для проведения данного теста можно использовать как растворы веществ, так и их суспензии. В общем случае могут быть рекомендованы следующие растворители: смесь ацетона с оливковым маслом (4:1, v/v), N,N-диметилформамид, метилэтилкетон, пропиленгликоль и диметилсульфоксид, а также и другие растворители, если для этого имеется достаточное научное обоснование. В определенных ситуациях может оказаться необходимым ставить дополнительные контроли для оценки эффектов клинически значимых растворителей или компонентов коммерческих препаратов, в составе которых тестируемое вещество поступает в продажу. Особое внимание следует уделить тому, чтобы водорастворимые вещества наносились на кожу в растворителе, хорошо смачивающем кожные покровы и тем самым не позволяющем тестируемому раствору быстро скатываться с поверхности кожи; для этого в растворы включают подходящие компоненты (напр., ПАВ L92 в концентрации 1%). По вышеописанным причинам следует избегать использования простых водных растворов для нанесения на кожу.

4.2.4. Преимуществом данного метода является возможность проведения внутреннего контроля, для чего сравнивают состояние лимфоузлов одной и той же мыши на стороне нанесения препарата и на противоположной стороне; это позволяет оценить внутригрупповую вариабельность эффекта у отдельных животных и статистическую значимость различий между тестируемым веществом и растворителем. Кроме того, анализ внутригрупповой вариабельности индивидуальных данных дает основания для объективной оценки возможности сокращения числа мышей в группе ПК. Далее, в некоторых странах органы надзора требуют предоставления индивидуальных данных по отдельным животным, а в других странах принимаются и усредненные данные по каждой экспериментальной группе, что дает возможность исследователям выбрать способ представления результатов тестирования в виде индивидуальных или усредненных данных.

Предварительные исследования

4.2.5. При отсутствии информации, позволяющей рассчитать максимальную дозу тестируемого вещества, следует провести предварительное исследование для выявления диапазона доз, подходящего для тестирования методом LLNA. Цель предварительного исследования состоит в получении информации для выбора максимальной дозы тестируемого вещества при его использовании в основном исследовании LLNA, т.е. в получении данных о системном и кожно-раздражающем эффектах изучаемого препарата. Максимальным уровнем исследуемой дозы следует считать 100% исследуемого вещества для жидкостей или максимально возможную концентрацию для твердых частиц или суспензий.

4.2.6. Предварительное исследование проводится при условиях, идентичных условиям основного исследования LLNA, но оценка скорости пролиферации клеток лимфоузлов не проводится, и количество животных в группе может быть меньшим. Рекомендуется использовать группы по одному или по два животных на каждую дозу. Все мыши должны ежедневно осматриваться на предмет выявления любых клинических проявлений системной токсичности или местного раздражения на участке аппликации вещества. Массу тела регистрируют перед началом эксперимента и перед его завершением (День 6). Проводят наблюдение за обоими ушами каждой мыши, оценивая наличие эритемы в баллах с помощью таблицы. Замеры толщины уха получают, используя калиброметр (например: электронный микрометр или стрелочный калиброметр Пикока), в День 1 (перед нанесением вещества), День 3 (спустя приблизительно 48 часов после первой дозы) и День 6. Кроме того, в День 6 толщину ушей можно дополнительно оценить путем взвешивания стандартного по площади образца ткани ушной раковины, полученного с помощью перфоратора после гуманного умерщвления животных. Раздражение кожи на месте аппликации вещества оценивается как чрезмерное при наличии эритемы с выраженностью в 3 и более баллов по шкале таблицы и/или при увеличении толщины уха на 25% и более по сравнению с первоначальной в любой день осмотра животных. В качестве максимальной дозы для основного исследования LLNA выбирают максимальную из тех доз предварительного исследования, которые не вызывали признаков системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи.

Таблица

Шкала оценки эритемной реакции

Наблюдение	Баллы
Нет эритемы	0
Очень слабая эритема (едва заметная)	1
Четко выраженная эритема	2
Эритема от умеренной до тяжелой	3
От тяжелой эритемы (свекольный цвет кожи) до образования язв, покрытых струпом, мешающим проводить классификацию эритемы	4

4.2.7. В дополнение к увеличению толщины уха на 25% и более по сравнению с первоначальной для идентификации веществ-ирритантов в LLNA также используется статистически значимое увеличение среднего значения толщины уха в группе экспериментальных мышей по сравнению с аналогичной величиной в группе контрольных мышей. Однако, если различия этих величин статистически достоверны, но составляют менее 25%, они не могут быть квалифицированы как свидетельство избыточного раздражения ткани уха данной дозой тестируемого вещества.

4.2.8. Следующие клинические наблюдения могут свидетельствовать о наличии системной токсичности при их использовании в качестве элемента интегральной оценки для расчета максимальной дозы в основном методе LLNA: изменения в функции нервной системы (например, взъерошивание шерсти, атаксия, тремор и конвульсии); изменения в поведении (например, агрессивность, изменения в груминговой активности, заметные изменения в уровне активности); изменения дыхательной активности (изменения в частоте и интенсивности дыхания, такие как затрудненное дыхание, одышка и хрипы) и изменения в потреблении пищи и воды. Кроме того, следует регистрировать: признаки летаргии и/или апатии; любые клинические признаки, которые проявлялись как более чем эпизоды незначительной или мгновенной боли и дистресса; снижение массы тела более чем на 5% за период от Дня 1 до Дня 6; гибель животных. Умирающие животные или животные, очевидно страдающие от боли или показывающие признаки серьезного и устойчивого дистресса, должны гуманно умерщвляться.

План основного эксперимента

4.2.9. План эксперимента следующий:

- День 1:

Определение и регистрация веса каждого животного и их визуальный осмотр. Проводят аппликацию 25 мкл соответствующего разведения исследуемого вещества, одного растворителя или ПК (если он проводится параллельно в каждом эксперименте; в противном случае берут данные последнего опыта с использованием ПК), на тыльную сторону каждого уха.

- Дни 2 и 3:

Повторить процедуру аппликации, выполненную в День 1.

- Дни 4 и 5:

Аппликаций не проводят.

- День 6:

Регистрируют вес каждого животного. Вводят в хвостовую вену всех мышей экспериментальных и контрольных групп по 250 мкл стерильного забуференного физиологического раствора (PBS), содержащего 20 микроКюри (7,4х105 Беккереля) меченого тритием 3Н-метилтимидина. Альтернативный вариант: вводят в хвостовую вену всех мышей по 250 мкл стерильного PBS, содержащего 2 микроКюри (7,4х104 Беккереля) 125I-йодо-дезоксиуридина и 10-5 М флюоро-дезоксиуридина. Через 5 часов производят гуманный забой животных. Извлекают дренирующие околоушные лимфоузлы и помещают их PBS от каждого животного отдельно (индивидуальный подход к животным); иной вариант: извлечь и поместить в PBS лимфоузлы от мышей каждой экспериментальной группы (объединенный подход к экспериментальной группе). Детали и диаграммы идентификации лимфоузлов и их препарирования могут быть найдены в литературе. В протокол исследования могут быть также включены дополнительные параметры контроля местных изменений кожи уха на месте аппликации, такие как баллы проявления эритемы уха или данные по толщине ушей (измеренной с помощью калибратора толщины или определения веса стандартных кусочков уха, полученных при некропсии с помощью перфоратора для взятия проб тканей ушной раковины).

Подготовка клеточной взвеси

4.2.10. Суспензию отдельных клеток лимфоузлов (КЛУ) после их билатерального извлечения (на основе индивидуального сбора материала от каждой мыши или при альтернативном подходе, объединяя лимфоузлы всех мышей данной группы) получают мягкой механической дезагрегацией, продавливая извлеченные лимфоузлы через сетку из нержавеющей стали с ячейками около 200 микрон или с помощью иных подходящих приемов. Полученные КЛУ дважды отмывают избытком PBS и преципитируют ДНК 5%-й трихлоруксусной кислотой (ТХУ) при 40°С в течение 18 часов. Осадок либо повторно суспендируется в 1 мл ТХУ и переносится в сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл сцинтилляционной жидкости для подсчета метки трития 3Н, либо сразу переносится в гамма-радиометрическую камеру для подсчета изотопа 125I.

Определение клеточной пролиферации (включенной радиоактивности)

4.2.11. Включение меченого 3Н-метилтимидина измеряют сцинтилляционным в распадах в минуту (РМ), включение меченого 125I-йодоксиуридина - по 125I также в РМ. В зависимости от используемого подхода включенная радиоактивность выражается как количество распадов в минуту на мышь (при индивидуальном подходе к животным) или как количество распадов в минуту на всю экспериментальную группу мышей (при объединении биоматериала от всех мышей данной экспериментальной группы).

Редуцированный метод LLNA

4.2.12. В определенных ситуациях, когда возникает потребность подтвердить отрицательный прогноз о потенциальной способности вещества вызывать кожную сенсибилизацию для нормирования данного вещества, можно применять редуцированный протокол rLLNA с использованием меньшего количества животных, при условии соблюдения всех других деталей протокола LLNA. Перед использованием метода rLLNA следует представить четкое обоснование и научное объяснение данного выбора. При получении положительного или сомнительного результата может потребоваться дополнительное исследование для объяснения или уточнения обнаруженного эффекта.

4.2.13. Сокращение количества изучаемых доз вещества и, соответственно, количества экспериментальных групп животных - единственное различие между протоколами LLNA и rLLNA; метод rLLNA не дает информации о зависимости доза-эффект. Поэтому метод rLLNA не следует использовать, если требуется информация о дозовой зависимости эффекта. Как и в полном варианте LLNA с использованием нескольких доз, концентрация вещества в редуцированном протоколе rLLNA должна быть максимальной из тех, которые не вызывают выраженной системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи мышей.

Наблюдения

Клинические наблюдения

4.2.14. Каждую мышь следует тщательно осматривать по крайней мере раз в день для выявления любых клинических признаков как местного раздражения на участке аппликации вещества, так и системной токсичности. Все наблюдения должны систематически регистрироваться и включать записи наблюдений за каждой мышью по отдельности. В план мониторинга следует включать критерии быстрой идентификации мышей с выявленными симптомами системной токсичности, чрезмерного местного раздражения изъязвления кожи для последующей эвтаназии.

Масса тела

4.2.15. Следует измерять индивидуальные массы тела животных в начале эксперимента и перед запланированным гуманным умерщвлением.

5. Анализ и интерпретация данных

5.1. Результаты опыта должны быть представлены в виде индекса стимуляции (ИС) для каждой экспериментальной группы. Используя индивидуальный подход к животным, значение ИС получают путем деления среднего значения РМ на одну мышь в каждой экспериментальной группе, включая группу ПК, на среднее значение РМ на одну мышь в группе контроля растворителя (VC). В этом случае среднее значение ИС для групп контроля растворителя (VC) подсчитывают как среднее арифметическое данных по отдельным мышам внутри этой группы. При использовании объединенного подхода к биоматериалу животных внутри экспериментальных групп ИС определяют путем деления данных по включению радиоактивной метки для каждой экспериментальной группы на соответствующие (усредненные уже при сборе биоматериала) данные по включению радиоактивной метки для группы контроля на растворитель; при этом сразу получают среднее значение ИС.

5.2. Результат тестирования оценивают как положительный при значении . В случае пограничных значений ИС для трактовки результатов можно также учитывать выраженность зависимости доза-ответ, статистическую значимость и непротиворечивость эффектов в группах положительного (ПК) и отрицательного (VC) контроля.

5.3. Если имеется необходимость уточнить полученные результаты, следует проанализировать различные свойства тестируемого вещества, включая наличие у него структурного сходства с известными кожными сенсибилизаторами, вызывает ли оно чрезмерное местное раздражение кожи у мышей и какой характер имеет зависимость доза-ответ. Эти и другие соображения подробно рассмотрены в работе.

5.4. Используя индивидуальный подход к сбору биоматериала от животных, можно провести статистический анализ полученных данных на наличие и выраженность зависимости доза-ответ. Для этого можно использовать любой статистический тест на наличие связи между переменными, а также подходящие методы сравнения межгрупповых различий (например, метод попарного сравнения экспериментальных данных для опытной группы с соответствующими данными для группы контроля на растворитель). Например, при статистическом анализе можно использовать метод линейной регрессии или тест Уильяма для оценки тренда зависимости доза-ответ и тест Даннетта для попарных сравнений. При выборе подходящего метода статистического анализа исследователь должен учесть возможное неравенство дисперсий изучаемой переменной внутри отдельных сравниваемых групп и другие сходные проблемы, которые могут потребовать преобразования данных или непараметрического статистического анализа. При наличии экспериментальных точек, далеко отстоящих от соответствующих значений данной величины у других мышей данной группы (иногда называемых "выбросами"), приходится проводить статистический анализ дважды - с выпадающими точками и без них.

6. Подготовка отчета

6.1. Данные должны быть представлены в форме таблицы. При использовании индивидуального подхода к животным следует привести индивидуальные значения РПМ для каждого животного, средние значения РПМ в каждой группе мышей с соответствующим значением ошибки его определения (например: стандартное отклонение или среднеквадратическая ошибка среднего значения отклонения, стандартная погрешность средней величины) и средние величины СИ для каждой опытной группы по отношению к группе контроля растворителя. При использовании объединенного подхода к сбору экспериментального материала следует привести полученные средние значения или медианы величин РПМ и СИ для каждой опытной группы по отношению к группе контроля растворителя.

Протокол эксперимента

6.2. Протокол эксперимента должен содержать следующую информацию:

Испытываемое вещество и его контроль:

- данные идентификации (например, номер CAS, если имеется; источник; степень чистоты; известные примеси; номер партии);

- физические и физико-химические свойства (такие как летучесть, стабильность, растворимость);

- если это сложная смесь, то указать состав и относительные проценты компонентов.

Растворитель/носитель:

- данные идентификации (степень чистоты; концентрация, если целесообразно; используемый объем);

- обоснование выбора растворителя.

Проверка животных:

- источник поступления мышей линии СВА;

- микробиологический статус животных, если известно;

- количество и возраст животных;

- источник поступления животных, условия содержания, диета и т.д.

Условия эксперимента:

- детали подготовки и нанесения тестируемого вещества;

- обоснование выбора дозы (включая результаты предварительных экспериментов, если проводились);

- концентрации тестируемого вещества и растворителя и общее количество вводимого тестируемого вещества;

- детали качества пищи и воды (включая тип/источник диеты, источник поступления воды);

- детали схемы проведения эксперимента и получения биологического материала;

- методы оценки токсичности;

- критерии интерпретации результатов исследования как положительных или отрицательных;

- детали любых отклонений от стандартного протокола и объяснения того, как данное отклонение повлияло на схему исследования и результаты.

Контроль качества:

- резюме результатов последнего из проводившихся контроля качества, включая информацию относительно тестируемого вещества, использовавшихся концентраций и растворителя;

- параллельный и/или исторический ПК и параллельные данные НК для данной лаборатории;

- если параллельный ПК не был включен, наличие данных и лабораторных протоколов для последнего из периодических ПК и протоколов, детализирующих данные исторического ПК, который служит для данной лаборатории обоснованием для отказа от осуществления параллельного ПК.

Результаты:

- индивидуальные значения веса мышей перед началом опыта и перед плановым забоем, а также средние значения и соответствующие ошибки этих величин (например, стандартное отклонение или среднеквадратическая ошибка среднего значения) для каждой экспериментальной группы;

- динамика начала проявления и симптомов токсичности, включая кожное раздражение на участке аппликации вещества, если таковые имеются, для каждого животного;

- таблица значений РПМ и СИ для каждой мыши (при индивидуальном подходе к животным) или соответствующих средних значений/медиан (при объединенном подходе к экспериментальной группе) для каждой экспериментальной группы;

- среднее значение и соответствующая ошибка (например, стандартное отклонение или среднеквадратическая ошибка среднего значения) величины РПМ для каждой экспериментальной группы и результаты анализа резко отклоняющихся значений внутри каждой экспериментальной группы при использовании индивидуального подхода к животным;

- вычисленное значение СИ и надлежащей меры его вариабельности, учитывающей вариабельность эффектов как в экспериментальных группах, так и в группах контроля, при использовании индивидуального подхода к животным;

- зависимость доза-ответ;

- статистический анализ этой зависимости (при необходимости).

Обсуждение результатов:

- краткий комментарий к полученным результатам, включая характер зависимости доза-эффект и при необходимости ее статистический анализ, с заключением относительно того, следует ли тестируемое вещество считать кожным сенсибилизатором.