Приложение 6.1.7. Оценка острого раздражения/разъедания (коррозии) кожи

Приложение 6.1.7

Оценка острого раздражения/разъедания (коррозии) кожи

Идентичен международному документу OECD TG N 404 "Acute Dermal Irrita-tion/Corrosion" (ОЭСР Руководство N 404 "Острое раздражающее/разъедающее действие на кожу"). Принят 24 апреля 2002 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к выполнению стратегии поэтапных исследований раздражающего/разъедающего (коррозионного) воздействия вещества. Стратегия разработана и рекомендована ОЭСР для проведения испытаний согласно Согласованной на глобальном уровне системе классификации опасности и маркировки химической продукции (СГС). Рекомендуется руководствоваться стратегией испытания перед тем, как начать исследования in vivo. Новые вещества рекомендуется исследовать поэтапно с целью развития научной базы данных о раздражающих/разъедающих (коррозионных) свойствах вещества. Для существующих веществ, информации о которых недостаточно, стратегию необходимо использовать с целью восполнения недостаточных данных. Использование различных тестовых стратегий или процедур, как и принятие решений об исключении ряда их из поэтапного тестирования, должно быть оправданно.

1.2. Если невозможно определить раздражение/разъедание (коррозию) кожи путем анализа доступной информации, в соответствии с последовательной стратегией тестирования, целесообразно провести исследование in vivo.

2. Общие положения

2.1. Метод позволяет оценить всю имеющуюся информацию об исследуемом веществе с целью избежать ненужных экспериментов на подопытных животных. Данный метод рекомендует провести сбор и анализ всей известной информации об испытываемом веществе перед тем, как начать исследование in vivo разъедающего/раздражающего воздействия вещества. Недостающие данные могут быть получены в ходе последовательных исследований. Стратегия тестирования включает последовательное выполнение подтвержденных и распространенных исследований in vitro. В дополнение, где уместно, рекомендуется последовательное, а не одномоментное нанесение трех повязок с испытываемым веществом на животное в предварительных испытаниях in vivo.

2.2. Как в интересах науки, так и с целью защиты животных исследования in vivo не должны предприниматься до тех пор, пока не собраны, не рассмотрены и не взвешены все доступные данные о раздражающих/разъедающих свойствах вещества. Подобные данные включают в себя уже известные исследования на человеке и/или лабораторных животных, информацию о разъедающем/раздражающем воздействии одного или более структурно схожих веществ или смесей таких веществ, также включают в себя информацию о кислотных и щелочных свойствах испытываемого вещества и вытекают из проверенных и верифицированных данных в исследованиях in vitro или ex vivo. Этот анализ направлен на снижение потребности в исследованиях in vivo раздражающего/разъедающего (коррозионного) воздействия испытываемого вещества, уже получивших достаточное освещение по результатам других исследований.

3. Последовательная стратегия проведения исследования по изучению раздражающего и/или разъедающего (коррозионного) действия на кожу

3.1. Основные положения

3.1.1. В интересах науки и благополучия животных очень важно избегать ненужного использования животных и минимизировать любые испытания, которые могут привести к тяжелым последствиям у животных. Вся информация о потенциальной способности вещества вызывать разъедание (коррозию) или раздражение кожи должна быть оценена до проведения испытания in vivo. В свою очередь, уже могут существовать достаточные основания для того, чтобы классифицировать вещество как способное вызывать разъедание (коррозию) или раздражение без необходимости проводить опыты на лабораторных животных. Таким образом, используя анализ совокупности имеющихся данных и последовательную стратегию проведения испытаний можно снизить необходимость проведения испытаний in vivo, особенно, если вещество, вероятно, вызывает тяжелые реакции.

3.1.2. Анализ совокупности имеющихся данных обязательно рекомендуется проводить для оценки существующей информации о кожном раздражении или разъедании (коррозии), вызываемых веществом, чтобы определить, есть ли необходимость в проведении дополнительных исследований, отличных от кожных испытаний in vivo, для выявления таких потенциальных свойств. Когда дальнейшие испытания необходимы, рекомендуется применять последовательную стратегию проведения испытаний для получения значимых экспериментальных данных. Для веществ, для которых исследования ранее не проводились, последовательная стратегия должна быть использована при определении данных, необходимых для выявления его разъедающих (коррозионных) или раздражающих свойств. Стратегия испытаний была разработана ОЭСР и позднее была подтверждена и распространена в системе СГС.

3.1.3. Хотя последовательная стратегия не является составной частью метода, она представляет собой рекомендуемый подход для определения разъедающих (коррозионных) или раздражающих свойств вещества. Подход включает в себя как надлежащую лабораторную практику (GLP), так и этические предпосылки для проведения испытания in vivo на кожную коррозию или раздражение. Метод проведения исследования является руководством для проведения испытания in vivo и содержит факторы, которые необходимо учитывать до начала проведения такого испытания. Стратегия представляет собой подход для оценки существующих данных о разъедающих (коррозионных) или раздражающих свойствах исследуемого вещества и соответствующий подход получения подобных данных для веществ, для которых необходимы дополнительные испытания или для которых испытания не проводились ранее. Также в особых случаях для определения разъедания (коррозии) или раздражения кожи рекомендуется проведение подтвержденных и общепризнанных испытаний in vitro или ex vivo.

3.2. Описание стратегии проведения испытаний и оценки существующих данных

3.2.1. Для определения необходимости проведения кожного испытания in vivo перед проведением подобного испытания, как части последовательной стратегии, вся доступная информация должна быть рассмотрена и оценена (приложение). Несмотря на то, что существенная информация может быть получена при оценке одиночных параметров (например, экстремально высокого значения pH), вся существующая информация должна быть рассмотрена в совокупности. Все существенные данные о воздействиях исследуемого вещества или его аналогов должны быть оценены при принятии решения на основании совокупности имеющихся данных, а логическое обоснование такого решения должно быть представлено. Основной упор до проведения испытаний in vitro или ex vivo должен быть сделан на данные о воздействии вещества на человека и животных. Кожных испытаний разъедающих (коррозионных) свойств in vivo по возможности следует избегать.

3.3. Факторы стратегии испытаний

Оценка существующих данных о воздействии на человека и животных (шаг 1).

3.3.1. Прежде всего должны быть рассмотрены существующие данные о воздействии на человека (например, клинические или профессиональные испытания, истории клинических случаев) и животных (например, одиночные или повторяющиеся испытания на кожную токсичность), поскольку они обеспечивают информацию, непосредственно относящуюся к воздействиям на кожу. Для веществ с известным разъедающим (коррозионным) или раздражающим действием и тех, для которых существуют ясные доказательства отсутствия подобного действия, нет необходимости в проведении испытания in vivo.

Анализ взаимосвязи структура-активность (SAR) (шаг 2).

3.3.2. Если возможно, должны быть рассмотрены результаты испытаний веществ со схожей структурой. Если существуют данные о том, что подобные вещества или их смесь оказывают на человека и животных разъедающее (коррозионное) или раздражающее действие, можно предположить, что исследуемое вещество будет также оказывать подобное воздействие. В этих случаях проведения испытаний для таких веществ может не потребоваться. Отрицательные результаты исследований веществ со схожей структурой или их смеси не представляют собой достаточного доказательства отсутствия разъедающего (коррозионного) или раздражающего действия вещества в рамках последовательной стратегии. Подтвержденные или общепризнанные подходы SAR должны использоваться для выявления как разъедающих (коррозионных), так и раздражающих свойств.

Физико-химические свойства и химическая реакционная способность (шаг 3).

3.3.3. Вещества, имеющие экстремальные значения pH, такие как и , могут вызывать сильные местные реакции. Если экстремальное значение pH является основой для отнесения вещества к едким разъедающим (коррозионным) для кожи, также должны учитываться его кислотные/щелочные свойства (буферная емкость). Если же буферная емкость показывает, что вещество может быть не разъедающим (не коррозионным) для кожи, то для подтверждения этого необходимо провести дальнейшие исследования, предпочтительно с использованием подтвержденных или общепризнанных in vitro или ex vivo тестов (см. шаг 5 и 6).

Кожная токсичность (шаг 4).

3.3.4. Если доказано, что вещество является токсичным при поступлении через кожу, in vivo испытания по изучению разъедающих (коррозионных) и раздражающих свойств могут быть неосуществимы, поскольку количество вещества, которое обычно наносится на кожу, может сильно превышать токсичную дозу и, соответственно, привести к смерти или тяжелым поражениям животных. К тому же, если исследования на кожную токсичность с использованием кроликов-альбиносов уже были проведены с предельной дозой 2 000 мг на кг массы животного или более, и разъедание (коррозия) или раздражение кожи не были обнаружены, дополнительные исследования по изучению разъедания (коррозии) или раздражения кожи могут не понадобиться. Некоторые выводы должны быть сделаны и при оценке острой кожной токсичности, выявленной в предыдущих исследованиях. Например, полученная информация о кожных поражениях может быть неполной. Тесты и наблюдения могли проводиться на видах, отличных от кроликов, и такие виды могли сильно отличаться по своим чувствительным реакциям. Также форма исследуемого вещества, нанесенного на животное, могла быть неподходящей для оценки кожного раздражения и коррозии (например, раствор веществ для испытаний кожной токсичности). Однако в тех случаях, когда хорошо подготовленные испытания на кожную токсичность были проведены на кроликах, отрицательные результаты могут считаться достаточным доказательством того, что вещество не является разъедающим (коррозионным) или раздражающим.

Результаты in vitro или ex vivo испытаний (шаг 5 и 6).

3.3.5. Вещества, проявившие разъедающие (коррозионные) или сильные раздражающие свойства в подтвержденных и общепринятых in vitro или ex vivo испытаниях, проведенных для оценки этих специфических свойств, нет необходимости тестировать на животных. Можно предположить, что такие вещества будут оказывать такое же тяжелое воздействие и in vivo.

In vivo испытания на кроликах (шаг 7 и 8).

3.3.6. В случае, если на основании анализа имеющихся данных принято решение проводить испытания in vivo, испытания должны начинаться с исследования на одном животном. Если результаты испытания показывают, что вещество оказывает разъедающее (коррозионное) действие на кожу, дальнейшие испытания проводиться не должны. Если в исходном тесте не наблюдаются разъедающие (коррозионные) свойства, отрицательная реакция или раздражающие свойства должны быть подтверждены с использованием двух дополнительных животных с периодом экспозиции 4 часа. Если раздражающий эффект наблюдается в исходном исследовании, то подтверждающий тест может проводиться последовательно или путем исследования двух животных одновременно.

4. Принцип тестового метода

4.1. Доза испытываемого вещества наносится на кожу подопытного животного однократно; необработанная кожа будет служить для сравнения (контроля). Степень раздражения/разъедания (коррозии) фиксируется в определенные промежутки времени и затем последовательно описывается с целью всесторонней оценки воздействия вещества. Продолжительность исследования должна быть достаточной для оценки процесса обратимости или необратимости наблюдаемых результатов.

4.2. Животных, продолжительно демонстрирующих выраженное физическое недомогание и/или острую боль, следует умертвить гуманным способом вне зависимости от этапа испытания, вещество оценивается соответственно.

5. Описание тестового метода

5.1. Подготовка

Отбор вида животных

5.1.1. Предпочтение отдается кроликам-альбиносам, используются молодые здоровые особи. Для использования других видов животных необходимо привести обоснование.

5.1.2. Приблизительно за 24 часа до начала испытания мех должен быть тщательно выстрижен со спинной части тела животного. При удалении меха необходимо быть осторожным, чтобы не повредить кожу животного. В испытании участвуют особи только со здоровой неповрежденной кожей.

5.1.3. Некоторые виды кроликов имеют плотные клочки шерсти, которые в определенное время года торчат больше. На такие области нельзя накладывать вещество.

Условия содержания и кормления

5.1.4. Каждое животное должно содержаться отдельно. Температура в экспериментальном помещении, где содержится подопытное животное, должна составлять для кроликов. Относительная влажность помещения должна составлять 50-60%, ее минимальный уровень не должен быть ниже 30%, максимальный - превышать 70%, за исключением случаев, когда производится уборка. Освещение искусственное, сменяется в следующей последовательности: 12 часов - светло, 12 часов - темно. Для кормления может использоваться обычная лабораторная диета, питьевая вода - в неограниченном количестве.

5.2. Процедура исследования

Наложение исследуемого вещества

5.2.1. Исследуемое вещество должно быть наложено на небольшой участок (приблизительно 6 ) кожи и покрыто марлевой повязкой, закрепленной не вызывающей раздражения лентой. В случае если прямое наложение невозможно (например, с жидкостями или некоторыми пастами), вещество необходимо прежде нанести на марлевую повязку и затем приложить к коже. Повязка не должна сдавливать, должна крепиться посредством подходящего материала на протяжении всего периода воздействия вещества. Если испытываемое вещество нанесено на марлевую повязку, необходимо проследить, чтобы оно было равномерно распределено и плотно контактировало с кожей. Необходимо предупредить возможность животного дотянуться до повязки и проглотить или вдохнуть вещество.

5.2.2. При проведении исследований жидкостей их обычно не разводят. Если испытывается твердое вещество (оно может быть размельчено, при возможности), его необходимо увлажнить небольшим количеством воды (при необходимости, другим разбавителем), чтобы обеспечить надежное прилегание к коже. Если используется разбавитель, не являющийся водой, его потенциальное воздействие на раздражение кожи от испытываемого вещества должно быть минимальным.

5.2.3. По окончании периода воздействия (обычно длится 4 часа) остатки испытываемого вещества должны быть удалены водой или подходящим растворителем, не задевая следы реакции на раздражение и не повреждая целостность эпидермиса.

Уровень дозы

5.2.4. На испытуемый участок кожи (тест-сайт) наносят твердое вещество или пасту в дозе 0,5 г, если испытуемое вещество является жидкостью, то доза составляет 0,5 мл.

Предварительные исследования (исследование in vivo дермального раздражения/разъедания (коррозии) кожи, в котором используется одно животное)

5.2.5. В соответствии с последовательной стратегией настоятельно рекомендуется проводить предварительные исследования на одном животном, поскольку вещество может обладать свойством разъедать кожу.

5.2.6. Когда вещество признается разъедающим (коррозионным) на основании совокупного анализа результатов, дальнейших испытаний на животных не требуется. Для большинства веществ, предположительно вызывающих разъедание (коррозию), как правило, нет необходимости в дальнейших испытаниях in vivo. Однако в тех случаях, когда из-за недостатка подтверждений существуют основания для получения дополнительных данных, могут быть проведены некоторые испытания на животных с использованием следующего подхода: на животное последовательно наносятся до трех тестовых проб. Первая проба удаляется по истечении трех минут. Если не наблюдается заметных кожных реакций, наносится вторая проба, которая удаляется через один час. Если наблюдения на этой стадии показывают, что экспозицию можно безболезненно продлить до четырех часов, наносится третья проба, которая удаляется после четырех часов, а реакцию воздействия оценивают. Если разъедающий (коррозионный) эффект наблюдается на какой-либо из трех последовательных стадий, эксперимент немедленно прекращают. Когда коррозионный эффект не наблюдается после удаления последней пробы, животное наблюдается в течение 14 дней, если коррозия не развивается на более ранней временной стадии.

5.2.7. В тех случаях, когда исследуемое вещество предположительно не вызывает разъедание (коррозию), но может вызвать раздражение, на животное на четыре часа должна быть нанесена однократная проба.

Подтверждающий тест (исследование in vivo раздражения кожи дополнительных животных)

5.2.8. Если разъедающий (коррозионный) эффект не наблюдается в начальном испытании, раздражение или негативная реакция должны быть подтверждены с использованием до двух дополнительных животных, по одному животному на каждую пробу, с периодом экспозиции, равным 4 часам. Если раздражение наблюдается в начальном тесте, то подтверждающие тесты могут быть проведены последовательно или путем одновременного исследования двух дополнительных животных. В исключительном случае, когда начальный тест не проводится, два или три животных могут быть обработаны однократной пробой, которая удаляется через четыре часа. Если при исследовании двух животных в обоих случаях наблюдается одна и та же реакция, никаких дальнейших испытаний не требуется. В противном случае тестируется также третье животное. Для оценки сомнительных реакций могут потребоваться дополнительные животные.

5.3. Наблюдение

Период наблюдения

5.3.1. Продолжительность периода наблюдений должна быть достаточной для того, чтобы в полной мере оценить обратимость наблюдаемых эффектов. Однако эксперимент должен быть прекращен в случае, если у животного наблюдаются продолжительные признаки тяжелой боли или недомогания. Для определения обратимости реакций животное должно наблюдаться в течение 14 дней после удаления пробы. При обнаружении обратимости в течение 14 дней эксперимент должен быть прекращен.

Клинические наблюдения и классификация кожных реакций

5.3.2. Все животные должны быть проверены на признаки эритемы и отека, а реакции - отмечаться на 60-й минуте, а затем на 24, 48 и 72 часах после удаления пробы. В начальном тесте на одном животном тестируемое место также проверяется сразу после удаления пробы. Кожные реакции оценивают и классифицируют в соответствии с таблицей "Классификация кожных реакций". Если обнаруживается повреждение кожи, которое по прошествии 72 часов нельзя идентифицировать как раздражение или разъедание (коррозию), для определения обратимости данного эффекта, возможно, понадобятся наблюдения вплоть до 14 дней. Помимо реакции раздражения должны быть полностью описаны и зарегистрированы все местные токсические эффекты, такие как обезжиривание кожи или любые систематические неблагоприятные эффекты (например, влияние на клинические признаки токсичности и изменение массы тела). Для прояснения сомнительных результатов должно приниматься во внимание гистопатологическое обследование.

Таблица

Классификация кожных реакций

N п/п	Образование эритемы и отека	Уровень классификации
1	Отсутствие эритемы	0
2	Слабая эритема (едва заметная, розоватый тон)	1
3	Умеренно выраженная эритема (розовато-красный тон)	2
4	Выраженная эритема (красный тон)	3
5	Резко выраженная эритема (говяжья краснота) - образование ожога, препятствующего классификации эритемы (ярко-красный тон)	4
Возможный максимум		4
1	Отсутствие отека	0
2	Слабый отек (едва заметный)	1
3	Умеренный отек (область отека хорошо различима за счет определенной припухлости)	2
4	Выраженный отек (припухлость примерно на 1 мм)	3
5	Резко выраженный отек (припухлость более 1 мм и выход отека за границы области экспозиции)	4
Возможный максимум		4

5.3.3. Градация кожных реакций неизбежно является субъективной. Для обеспечения единообразия при классификации кожных реакций, содействия испытательным лабораториям и тем, кто проводит и интерпретирует наблюдения, персонал, проводящий испытания, должен быть хорошо обучен используемой системе оценок (таблица). Также могут оказаться полезными иллюстрированные пособия по классификации раздражений кожи и других повреждений.

Для прояснения сомнительных результатов может быть проведено гистопатологическое исследование.

6. Данные

6.1. Представление результатов

6.1.1. Результаты исследования должны быть сведены в таблицу в тестовом отчете и соответствовать всем пунктам, приведенным в разделе [9].

6.2. Оценка результатов

6.2.1. Кожно-раздражающие реакции должны быть оценены с учетом природы и тяжести поражений, а также их обратимости или недостаточной обратимости. Индивидуальная реакция не является абсолютным стандартом проявления раздражающих свойств вещества, поэтому также должны быть оценены и другие эффекты от воздействия тестируемого материала. Вместо этого индивидуальные реакции должны рассматриваться как опорные значения, которые необходимо оценивать в сочетании со всеми другими наблюдениями, полученными в данном исследовании.

6.2.2. Обратимость кожных поражений должна рассматриваться, исходя из оценки реакции раздражения. Когда реакции кожи, такие как алопеция, гиперкератоз, гиперплазия и шелушение сохраняются до конца 14-дневного срока наблюдения, исследуемое вещество должно быть признано раздражающим.

7. Отчет

Отчет о проведении испытания должен содержать следующую информацию.

Логическое обоснование проведения испытания in vivo: анализ совокупности существующих данных, включая результаты последовательной стратегии проведения испытания:

- описание значимых данных предварительного исследования;

- данные, полученные на каждой стадии стратегии проведения испытания;

- описание проведенных испытаний in vivo, включая детальное описание процедур и результаты, полученные для исследуемых/схожих веществ;

- анализ совокупности существующих данных для проведения испытания in vivo.

Вещество:

- идентификационные данные (например, номер CAS, источник, степень чистоты, известные примеси, номер партии);

- физическое состояние и физико-химические свойства (например, pH, летучесть, растворимость, устойчивость);

- если это смесь, то состав и соответствующее процентное содержание компонентов.

Растворитель:

- идентификационные данные, концентрация (при необходимости), используемый объем;

- обоснование выбора растворителя.

Экспериментальные животные:

- используемый вид/группа животных, в случае если это не кролики-альбиносы, обоснование использования животных;

- количество животных каждого пола;

- масса тела каждого животного в начале и конце испытания;

- возраст в начале испытания;

- источник животных, условия содержания, диета и т.д.

Условия проведения испытания:

- техника подготовки места нанесения пробы;

- техника подготовки и нанесения пластыря;

- техника подготовки исследуемого вещества, его нанесения и удаления.

Результаты:

- сбор и занесение в таблицу данных о проявлении у каждого животного раздражающих/разъедающих (коррозионных) реакций на каждой выявленной временной отметке;

- описание всех выявленных поражений;

- описание природы и степени выявленных реакций раздражения или разъедания (коррозии), а также любых гистопатологических наблюдений;

- описание других негативных местных (например, обезжиривание кожи) и соматических реакций, помимо кожного раздражения или разъедания (коррозии);

- обсуждение результатов.