Приложение 6.8.2. Метод оценки хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro

Приложение 6.8.2

Метод оценки хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 473 "In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test" (ОЭСР Руководство N 473 "Метод оценки хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro"). Принят 21 июля 1997 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в тесте оценки хромосомных аберраций в клетках млекопитающих in vitro. Тестирование in vitro, как правило, требует использования экзогенных источников метаболической активации. Системы метаболической активации in vitro не могут полностью имитировать условия метаболизма у млекопитающих in vivo. Таким образом, метод не дает прямой информации по мутагенному и канцерогенному потенциалу химического вещества в отношении млекопитающих. Цель метода - выявление факторов, которые индуцируют структурные аберрации хромосом в культивируемых клетках млекопитающих. Имеется два типа структурных аберраций хромосом: хроматидные и хромосомные. Подавляющее большинство химических мутагенов индуцирует аберрации хроматидного типа. В то же время возможно появление аберраций хромосомного типа. Возрастание полиплоидии может указывать на возможность индукции веществом численных нарушений хромосомного набора. Однако данный документ не рассматривает учет численных нарушений хромосом и данный метод обычно не используется для этой цели. Хромосомные мутации и связанные с ними события являются причиной ряда наследственных заболеваний человека. Имеются веские доказательства, что хромосомные мутации и связанные с ними события, вызывая изменения в онкогенах и генах супрессорах опухоли в соматических клетках, вовлечены в индукцию рака у человека и экспериментальных животных.

1.2. Метод оценки хромосомных аберраций in vitro проводят на перевиваемых клеточных линиях, клеточных штаммах или первичных культурах клеток. Используемые клетки отбирают на основе способности к росту в культуре, стабильности кариотипа, числа и разнообразия хромосом и спонтанного уровня хромосомных аберраций.

2. Общие положения

2.1. Тесты in vitro обычно требуют использования экзогенной системы метаболической активации. Такая система метаболической активации не может полностью соответствовать метаболизму вещества у млекопитающих in vivo. Следует избегать условий, которые могут привести к положительному результату, не отражающему собственную мутагенность исследуемого вещества, возникающему вследствие изменения рН, осмотической концентрации или высокого уровня цитотоксичности.

2.2. Тест используют для скрининга потенциальных мутагенов и канцерогенов для млекопитающих. Многие вещества, положительные в этом тесте, являются канцерогенами для млекопитающих. Однако нет точной корреляции между результатами в этом тесте и канцерогенностью для человека. Уровень корреляции зависит от класса химического соединения. Имеются канцерогенные вещества, которые не выявляются в данном тесте, потому что они действуют по иным механизмам, чем прямое повреждение ДНК.

3. Принцип метода

3.1. Экспозицию клеточных культур с изучаемым веществом проводят в вариантах без и в присутствии системы метаболической активации. Через определенное время после экспозиции исследуемым соединением в культуры вносят вещество, блокирующее клеточный цикл на стадии метафазы (например, или колхицин). Затем клетки фиксируют, красят и анализируют под микроскопом для обнаружения ХА.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Клетки

4.1.1. В экспериментах могут быть использованы различные клеточные линии и различные первичные культуры, включая клетки человека (например, фибробласты китайского хомячка, лимфоциты периферической крови человека и млекопитающих).

Среды и условия культивирования

4.1.2. Для культивирования следует использовать соответствующие культуральные среды и условия инкубации (посуда для культивирования, концентрация , температура и влажность). Клеточные линии и штаммы, на которых проводят исследования, следует постоянно проверять на стабильность модального числа хромосом и отсутствие контаминации микоплазмой. Их нельзя использовать при изменении числа хромосом или контаминации микоплазмой. Для клеток и условий их культивирования должна быть известна нормальная продолжительность клеточного цикла.

Подготовка культур

4.1.3. Клеточные линии и штаммы размножают из коллекции, рассевают в культуральной среде до плотности, при которой клетки не будут мешать друг другу до времени фиксации, и инкубируют при 37°С.

4.1.4. Лимфоциты: цельная кровь с антикоагулянтом (например, гепарином) или выделенные лимфоциты, полученные от здоровых доноров, вводят в культурную среду, содержащую митоген (например, фитогемагглютинин) и инкубируют при 37°С.

Метаболическая активация

4.1.5. Клетки экспонируют с изучаемым веществом как в присутствии, так и без соответствующей системы метаболической активации. Обычно используют кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9), приготовленную из печени грызунов, обработанных индуктором ферментов Aroclor 1254, или комбинацией фенобарбитала и . Постмитохондриальную фракцию обычно добавляют в объеме 1-10% от объема культуральной среды. Условия использования системы метаболической активации могут зависеть от химического класса изучаемого вещества. В некоторых случаях может быть уместным использование не одной, а нескольких концентраций постмитохондриальной фракции. Многие модификации, включая конструирование генноинженерных клеточных линий, экспрессирующих специфические ферменты активации, могут быть использованы для эндогенной активации. Выбор используемых клеточных линий должен быть оправдан с научной точки зрения (например, необходимостью присутствия изозима цитохрома Р450 для метаболизма испытуемого вещества).

Исследуемое вещество/подготовка

4.1.6. Твердые вещества должны быть растворены или суспендированы в соответствующих растворителях/разбавителях и, если необходимо, разведены до введения в культуру. Жидкие вещества могут быть введены в культуру непосредственно и/или в виде заранее приготовленного раствора. Следует использовать свежеприготовленные растворы исследуемого вещества, пока не будет доказана стабильность растворов вещества при хранении.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен вступать в химическую реакцию с испытуемым веществом, не должен снижать выживаемость клеток и активность смеси S9. Если вместо хорошо изученных, используются другие растворители/разбавители, их включение в эксперимент должно быть обосновано данными, указывающими на их совместимость с клетками и S9. Рекомендуется, если возможно, всегда в качестве растворителя/разбавителя использовать воду. При тестировании веществ, водные растворы которых нестабильны, следует использовать безводный органический растворитель. Вода может быть удалена при использовании молекулярного сита.

Изучаемые концентрации

4.2.2. К критериям, которые используют для определения максимальной концентрации вещества, относятся цитотоксичность, растворимость в культуральной среде, изменение рН и осмотическая концентрация.

4.2.3. Цитотоксичность следует определять как в присутствии, так и без метаболической активации в основном эксперименте. Ее индикаторами являются такие признаки целостности клеток и их роста, как степень слияния, количество жизнеспособных клеток или митотический индекс. Полезно определение цитотоксичности и растворимости в предварительном эксперименте.

4.2.4. Нужно исследовать, по крайней мере, три концентрации вещества, эффекты которых можно проанализировать. Если вещество обладает цитотоксическим действием, его следует изучать в таких концентрациях, которые покрывают диапазон от максимального до небольшого уровня токсичности или ее отсутствия. Обычно различия между концентрациями выбираются в диапазоне между 2 и . На момент фиксации максимальная концентрация должна показать значительное (более 50%) сокращение степени слияния, количества клеток или митотического индекса. Митотический индекс служит только косвенной (непрямой) мерой цитотоксических/цитостатических эффектов и зависит от времени после введения вещества в культуру. Однако митотический индекс приемлем для суспензионных культур, в которых другие измерения токсичности могут быть затруднены и трудноопределимы. Информацию о кинетике клеточного цикла, такую как среднее время генерации (СВГ), можно использовать в качестве дополнительной. Однако СВГ является средним значением для всей популяции и не всегда указывает на существование более медленно делящейся субпопуляции. Даже небольшое увеличение среднего времени генерации может быть связано с очень существенной задержкой времени оптимального выхода аберраций. Для веществ с относительно низкой цитотоксичностью максимальная концентрация в культуре должна составить 5 мкл/мл, 5 мг/мл или 0,01 М, выбирая из них ту, которая является самой низкой.

4.2.5. Для относительно нерастворимых веществ, которые не токсичны в концентрациях ниже предела растворимости, максимальную концентрацию следует брать выше предела растворимости в конечной культуральной среде в конце периода обработки. В некоторых случаях (когда токсичность проявляется только в более высокой, чем самая низкая нерастворимая концентрация) желательно исследовать более одной концентрации с видимой преципитацией. Это может быть полезно для оценки растворимости в начале и конце периода обработки, так как в тест-системе растворимость может меняться в процессе обработки, вследствие присутствия клеток, S9, сыворотки и т.д. Нерастворимость можно выявить невооруженным глазом. Преципитат не должен мешать анализу.

Контроли

4.2.6. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель или разбавитель) контроли в вариантах с метаболической активацией и без нее должны быть в каждом эксперименте. В варианте с метаболической активацией вещество положительного контроля должно проявлять мутагенный эффект после метаболической активации.

4.2.7. В качестве положительного следует применять кластоген в концентрации, при которой имеется воспроизводимое и значимое повышение эффекта над контролем, чтобы охарактеризовать чувствительность тест-системы. Концентрации положительного контроля следует подбирать так, чтобы был четкий эффект, но в то же время его уровень не позволял исследователю определить зашифрованный препарат. Примеры веществ положительного контроля приведены ниже.

4.2.8. В качестве положительного контроля могут быть использованы другие вещества. Если возможно, в качестве положительного контроля используют вещество по химическому классу сходное с известным положительным контролем.

Условия метаболической активации	Вещество и номер CAS
Отсутствие экзогенной метаболической активации	Метилметансульфонат [номер CAS 66-27-3]
	Этилметансульфонат [номер CAS 62-50-0]
	Этилнитрозомочевина [номер CAS 759-73-9]
	Митомицин С [номер CAS 50-07-7]
	N-нитрохинолин-N-оксид [номер CAS 56-57-5]
Наличие экзогенной метаболической активации	Бенз(а)пирен [номер CAS 50-32-8]
	Циклофосфамид (моногидрат) [номер CAS 50-18-0 (номер СAS 6055-19-2)]

4.2.9. Отрицательный контроль, включающий введение только растворителя/разбавителя в культуральную среду, обработку клеток в том же режиме, как и в вариантах с исследуемым веществом, ставиться для каждого времени фиксации. Дополнительно следует ставить контроль без обработки, пока исторический контроль лаборатории не покажет отсутствие вредных или мутагенных эффектов, индуцированных выбранным растворителем.

4.3. Проведение эксперимента

Обработка культуры исследуемым веществом

4.3.1. Пролиферирующие клетки обрабатывают исследуемым веществом в присутствии системы метаболической активации и без нее. Обработку лимфоцитов проводят через 48 ч после стимуляции митогеном.

4.3.2. Для каждой концентрации в норме ставят две культуры. То же настоятельно рекомендуется для отрицательного и положительного контролей. Когда исторические данные показывают минимальные вариации результатов между двумя культурами, возможно использование в эксперименте только одной культуры с каждой концентрацией.

4.3.3. Газообразные или летучие вещества тестируют соответствующими методами, например, в запечатанных культуральных сосудах.

Время фиксации

4.3.4. В первом опыте клетки экспонируют с исследуемым веществом в условиях с метаболической активацией и без нее в течение 3-6 ч и фиксируют через промежуток времени, эквивалентный приблизительно 1,5-кратной продолжительности клеточного цикла после начала воздействия веществом. Если получен отрицательный результат в вариантах с метаболической активацией и без нее, следует провести опыт с метаболической активацией, увеличив длительность воздействия до времени фиксации, эквивалентного 1,5-кратной продолжительности клеточного цикла. Некоторые из химических веществ могут быть легче выявлены при длительности времени воздействия/фиксации более, чем 1,5-кратной продолжительности клеточного цикла. В тех случаях, когда подтверждение отрицательного результата не считается необходимым, следует дать обоснование.

Приготовление препаратов хромосом

4.3.5. Обычно за 1-3 ч до фиксации в культуру клеток вводят или колхицин. Каждую культуру клеток фиксируют отдельно для приготовления препаратов метафазных хромосом. Клетки подвергают гипотонической обработке, фиксируют и окрашивают.

Анализ

4.3.6. Все стекла, включая положительный и отрицательный контроль, перед микроскопическим анализом должны быть зашифрованы. Поскольку фиксация часто приводит к появлению метафаз с потерей хромосом, анализируемые метафазы должны содержать число центромер в пределах от модального числа для исследуемого типа клеток. Следует анализировать минимум 200 хорошо разбросанных метафаз на концентрацию и контроль, равно деля это количество между 2 повторами, если они ставятся. Это число может быть снижено, если наблюдается большое число аберраций.

4.3.7. Хотя основная цель теста - выявление структурных хромосомных аберраций, важно учитывать также полиплоидию и эндоредупликацию, если эти события имеются.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Экспериментальной единицей является клетка. Поэтому оценивают процент клеток со структурными аберрациями хромосом. Учитывают число и частоту разных типов структурных аберраций хромосом в экспериментальных и контрольных культурах. Пробелы регистрируют отдельно и их обычно не включают в общую частоту аберраций.

5.1.2. Следует также проводить оценку цитотоксичности во всех экспериментальных и контрольных культурах.

5.1.3. Представляют данные по каждой культуре. Все данные суммируют в табличной форме.

5.1.4. Нет требований к верификации четко положительного результата. Противоречивые и сомнительные результаты следует проверять в дальнейших экспериментах, используя преимущественно модификацию экспериментальных условий. Модификацию параметров исследования, степень изменения установленных условий следует проводить в последующих экспериментах. Параметры исследования, которые могут быть модифицированы, включают диапазон концентраций, условия метаболической активации.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.5. Имеется несколько критериев определения положительного результата: зависимое от концентрации повышение числа клеток с аберрациями хромосом или воспроизводимое повышение числа клеток с аберрациями хромосом. Биологическая обоснованность результата должна приниматься во внимание в первую очередь. Для оценки результатов можно использовать статистические методы в качестве дополнительных. Статистическая значимость не является единственным критерием для доказательства положительного ответа.

5.1.6. Повышение частоты полиплоидных клеток может показывать, что вещество ингибирует процесс митоза и индуцирует численные хромосомные аномалии. Повышение числа клеток с эндоредупликацией хромосом может указывать, что вещество ингибирует прогрессию клеточного цикла.

5.1.7. Вещества, результаты исследования которых не соответствуют вышеприведенным критериям, считаются немутагенами в данной тест-системе.

5.1.8. Хотя в большинстве экспериментов получаются четко положительные или отрицательные результаты, в редких случаях полученные данные не позволяют сделать однозначное заключение об активности исследуемого вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными независимо от числа проведенных повторов.

5.1.9. Положительные результаты в тесте на хромосомные аберрации in vitro, показывают, что вещество индуцирует структурные аберрации хромосом в культивируемых соматических клетках млекопитающих. Отрицательные результаты указывают, что при данных условиях эксперимента вещество не индуцирует хромосомные аберрации в культивируемых соматических клетках млекопитающих.

5.2. Отчет

Отчет должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен;

- физическую природу и чистоту;

- физико-химические параметры, имеющие значение для данного исследования;

- стабильность веществ (если известна).

Растворитель/разбавитель:

- обоснование выбора растворителя/разбавителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе/разбавителе, если известны.

Клетки:

- тип и источник клеток;

- особенности кариотипа и пригодность использованного типа клеток;

- отсутствие микоплазмы, если определяли;

- информация о длительности клеточного цикла;

- пол донора, использовали для культивирования цельную кровь или выделяли лимфоциты, митоген;

- число пассажей, если использовали;

- методы поддержания клеточных культур, если использовали;

- модальное число хромосом.

Условия эксперимента:

- препарат, использованный для метафазного блока, концентрация и длительность экспозиции;

- обоснование выбора концентраций и числа клеточных культур, например, данные по цитотоксичности и ограничения по растворимости, если имеются;

- состав среды, концентрация ;

- концентрации исследуемого вещества;

- объем растворителя и количество добавленного исследуемого вещества;

- температура инкубации;

- длительность инкубации;

- длительность обработки культуры;

- клеточная плотность во время обработки (если оценивали);

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости;

- положительные и отрицательные контроли;

- методика приготовления препаратов;

- критерии учета аберраций хромосом;

- число проанализированных метафаз;

- методы оценки токсичности;

- критерии оценки результата как положительный, отрицательный или противоречивый.

Результаты:

- признаки токсичности, например: рост клеток, данные по клеточному циклу, числу клеток, митотическому индексу;

- признаки преципитации;

- данные по рН и осмотической концентрации во время обработки исследуемым веществом, если определяли;

- определение аберраций, включая пробелы;

- число клеток с хромосомными аберрациями, типы хромосомных аберраций для каждой экспериментальной и контрольной культуры;

- изменения плоидности, если есть;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- статистический анализ, если проводили;

- данные отрицательного (растворитель/разбавитель) и положительного контроля;

- исторические данные по отрицательному (растворитель/разбавитель) и положительному контролю с указанием пределов колебаний, среднего значения и стандартного отклонения.

Обсуждение результатов.

Заключение.