Приложение 6.7.6. Оценка репродуктивной токсичности на одном поколении

Приложение 6.7.6

Оценка репродуктивной токсичности на одном поколении

Идентичен международному документу OECD TG N 415 "One-Generation Reproduction Toxicity Study" (ОЭСР Руководство N 415 "Испытания по оценке репродуктивной токсичности на одном поколении"). Принят 26 мая 1983 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования по оценке репродуктивной токсичности предназначен для получения информации о воздействии испытуемого вещества на репродуктивную функцию самцов и самок: функцию гонад, эстральный цикл, поведение во время спаривания, зачатие, роды, лактацию и отлучение от материнского питания.

1.2. Данный метод не универсален и может потребовать изменений при изучении веществ, вводимых ингаляционным путем.

1.3. Исследование призвано дать предварительную информацию о токсических эффектах испытуемого вещества на эмбриональное развитие, таких как неонатальные заболевания, смертность, поведение и тератогенез.

2. Общие положения

2.1. Изучение репродуктивной токсичности является обязательным элементом токсикологической оценки химических веществ.

2.2. Данный вид исследований позволяет получить предварительную информацию о воздействии вещества на эмбриональное развитие.

2.3. Целью данного метода является изучение влияния химических соединений на функцию гонад, эстральный цикл, поведение во время спаривания, зачатие, лактацию и отлучение от материнского питания.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Испытуемое вещество вводится нескольким группам самок и самцов.

3.1.2. Самцам доза вводится на протяжении развития и, по меньшей мере, одного полного сперматогенного цикла (около 56 дней у мышей и 70 дней у крыс) с целью выявления любых изменений, вызванных воздействием вещества на стадии сперматогенеза.

3.1.3. Самкам материнского поколения (Р) доза вводится, по меньшей мере, на протяжении двух полных эстральных циклов с целью выявления любых изменений, вызванных воздействием вещества на эстральной стадии.

3.1.4. Животные затем спариваются. Испытываемое вещество вводится животным обоего пола на протяжении периода спаривания и затем только самкам в течение периода беременности и кормления. Введение вещества ингаляционно должно быть научно обосновано.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Предпочтительны крысы или мыши. Необходимо использовать здоровых животных, прежде не участвовавших в экспериментах. Не должны использоваться линии с низкой плодовитостью. Для исследования важны: вид, линия, пол, масса и/или возраст подопытных животных.

Подготовка

3.2.2. Перед испытанием животные произвольно распределяются в экспериментальную и контрольную группы. Животные проходят адаптацию к экспериментальным условиям и условиям питания на протяжении пяти дней до начала эксперимента. Рекомендуется введение вещества с пищей или питьевой водой. Также допустимы другие пути введения вещества. Все животные должны дозироваться одним путем в течение всего эксперимента. Если используется среда или другие вспомогательные вещества для приготовления дозы, они не должны вызывать токсический эффект. Дозирование совершается семь дней в неделю.

Содержание

3.2.3. Температура в лабораторном помещении должна составлять для грызунов и кроликов. Несмотря на то что относительная влажность должна быть как минимум 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки помещения, оптимальное значение составляет 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды.

3.2.4. Процедуры спаривания должны проводиться в клетках, подходящих для этой цели. Несмотря на то что индивидуальное содержание оплодотворенных животных является предпочтительным, содержание небольшими группами также приемлемо.

3.3. Процедура испытания

Количество и пол животных

3.3.1. Каждая экспериментальная и контрольная группа должна содержать достаточное количество животных, чтобы получить не менее 20 беременных самок, близких к родам или рожающих.

3.3.2. Целью является производство достаточного количества беременных самок и потомства для оценки влияния вещества на фертильность, беременность, материнское поведение животных поколения Р, рост и развитие потомства линии в период от оплодотворения яйцеклетки до отнятия от груди.

3.3.3. Предварительные данные об изучаемом веществе:

- твердое, жидкое, газо- или парообразное агрегатное состояние;

- химическая идентификация;

- чистота (примеси) испытуемого вещества;

- характеристики растворимости;

- точка плавления/кипения (если необходимо);

- рН (если необходимо).

Уровень доз

3.3.4. Используются, как минимум, три экспериментальные и одна контрольная группы. Если для приготовления доз используется растворитель или другая среда, контрольная группа должна получить раствор в наибольшем объеме. Если испытуемое вещество вызывает уменьшение потребления пищи или его утилизацию, может быть признано необходимым использование парной контрольной группы. В идеале самый высокий уровень дозы, если только действие не ограничено физико-химическими свойствами испытуемого вещества или его биологическим воздействием, должен вызывать у родителей-животных (Р) признаки интоксикации, но не гибель. Средняя доза должна вызывать минимальный токсический эффект, вызванный действием токсического вещества; и низкий уровень дозы не должен вызывать видимых эффектов у родителей приплода.

3.3.5. Если вещество вводится через желудочный зонд или капсулу, то доза для каждого животного должна устанавливаться в зависимости от массы его тела и установленной недельной динамики массы тела. При желании для самок на протяжении периода беременности дозировка может быть установлена в зависимости от массы тела в 0-й или 5-й день беременности.

Испытание максимальной дозы

3.3.6. В случае если используется вещество с низкой токсичностью и уровень дозы не менее 1 000 мг/кг массы тела не вызывает неблагоприятных эффектов в деятельности репродуктивной системы, дальнейшие исследования этой дозы могут быть признаны необязательными. Если предварительное исследование с самым высоким уровнем дозы вызывает выраженные признаки материнской токсичности и не вызывает наблюдаемых эффектов на фертильность, исследования с другими уровнями доз могут быть признаны необязательными.

3.4. Схема эксперимента

3.4.1. Самцам поколения родителей (Р) в возрасте пять-девять недель вводят дозу ежедневно, после адаптационного периода продолжительностью не менее пяти дней. Крысы дозируются на протяжении 10 недель до периода спаривания (для мышей период дозировки - 8 недель). Самцы должны быть умерщвлены и осмотрены либо по окончании периода спаривания, либо они могут продолжать находиться на экспериментальной диете для возможного рождения второго приплода, затем должны быть умерщвлены и осмотрены до окончания исследования.

3.4.2. Самок поколения родителей (Р) дозировать начинают не менее чем через пять дней после адаптации и продолжают дозировать на протяжении двух недель до спаривания. Самкам поколения родителей (Р) вводят дозу ежедневно на протяжении трехнедельного периода спаривания, беременности и затем до периода завершения кормления потомства .

3.4.3. Особое внимание необходимо уделить изменениям режима введения доз, основанных на доступных данных об испытуемом веществе, например, индукции метаболизма или бионакопления.

3.5. Процедура спаривания

3.5.1. В исследованиях репродуктивной токсичности используется спаривание в соотношении 1:1 (один самец к одной самке) или 1:2 (один самец к двум самкам).

3.5.2. При спаривании в соотношении 1:1 самку необходимо поместить с одним самцом до наступления беременности или до истечения трех недель. Каждое утро самок осматривают на предмет наличия спермы или вагинальной пробки. Нулевым днем беременности считается день появления вагинальной пробки или спермы.

3.5.3. В случае неудачного спаривания пара должна быть осмотрена с целью выявления причины видимой нефертильности. В осмотр могут быть включены такие процедуры, как дополнительное спаривание с самцами или самками, доказавшими свою способность оплодотворять и оплодотворяться, микроскопическое исследование репродуктивных органов, наблюдения за эстральным циклом или за сперматогенезом.

3.6. Размер приплода

3.6.1. Животным обеспечивается возможность полноценных родов и кормления потомства до момента отнятия от груди без стандартизации потомства.

3.6.2. Если стандартизация размера помета выполняется, рекомендуется выполнение последующих процедур. На 4-й день после рождения размер каждого помета может быть отрегулирован уничтожением лишних детенышей. При выборе следует руководствоваться стремлением сохранить в приплоде четырех самцов и четырех самок.

3.6.3. Всякий раз, когда количество детенышей - самцов или самок - не позволяет сформировать их в соотношении четыре самца/четыре самки, их можно урегулировать частично (например, пять самцов и три самки). Не регулируется размер приплода численностью менее 8 детенышей.

3.7. Наблюдения

3.7.1. На протяжении испытания каждое животное должно наблюдаться не реже чем раз в день. Соответствующие изменения в поведении, признаки трудных или длительных родов и все признаки токсичности, включая гибель, должны быть зафиксированы. На протяжении периода перед спариванием и спаривания объем потребляемой пищи замеряется ежедневно. После родов и на протяжении периода лактации объем потребляемой пищи (и воды, если испытуемое вещество вводится с питьевой водой) должен измеряться в день взвешивания приплода. Р-самцы и самки должны взвешиваться в первый день введения доз, затем еженедельно. Данные наблюдения должны фиксироваться отдельно по каждой взрослой особи.

3.7.2. Срок беременности должен быть подсчитан, начиная с нулевого дня (0) наступления беременности. Для каждого приплода как можно скорее после рождения необходимо установить число и пол детенышей, рожденность мертвым или живым, наличие значительных аномалий. Мертвые и умерщвленные на 4-й день детеныши должны быть зафиксированы и изучены на предмет выявления пороков. Живые детеныши должны быть подсчитаны, потомки взвешены наутро после рождения, на 4-й и 7-й день после рождения, и затем еженедельно до окончания эксперимента, когда животных необходимо взвесить индивидуально.

3.7.3. Необходимо фиксировать физические или поведенческие аномалии, наблюдаемые у самок или потомства.

4. Патология

4.1. Вскрытие

4.1.1. На момент умерщвления или гибели во время эксперимента животные поколения Р должны быть исследованы макроскопически на предмет изучения структурных патологий или изменений, особое внимание при этом должно уделяться органам репродуктивной системы. Погибшие или агонизирующие детеныши должны быть осмотрены на предмет обнаружения пороков.

4.2. Гистопатология

4.2.1. Микроскопическому исследованию подвергаются яичники, матка, шейка матки, вагина, тестикулы, придатки яичников, семенной пузырек, простата, свертывающая железа, гипофиз и орган(ы)-мишень(и) всех животных потомства родителей (Р). Если перечисленные органы не были исследованы в опытах с многократными дозами, они должны быть изучены микроскопически в группах с высокой дозой и в контрольной группе, а также у животных, погибших во время эксперимента.

4.2.2. Если у этих животных наблюдаются органы с патологиями, эти органы должны быть осмотрены у всех животных Р. В этом случае все ткани со значительными патологиями необходимо подвергнуть микроскопическому исследованию. Как предлагается при процедурах спаривания, репродуктивные органы с ожидаемой бесплодностью могут также подвергнуться микроскопическому исследованию.

5. Данные и отчет

5.1. Данные об испытании

5.1.1. Данные должны быть сведены в таблицы с указанием количества животных на начало эксперимента в каждой группе, числа фертильных самцов, числа беременных самок, типов изменений и процентного соотношения животных, демонстрирующих каждый тип изменений.

5.1.2. По возможности численные результаты должны быть обработаны статистическим методом. Может использоваться любой общепринятый метод статистической обработки данных.

5.2. Отчет об испытании

Отчет об испытании должен включать следующие данные:

- используемые виды/линии;

- токсические реакции с указанием пола и дозы, включая фертильность, беременность и жизнестойкость;

- время гибели во время эксперимента; если животное выжило, время запланированного умерщвления или факт умерщвления по окончании эксперимента;

- таблицы, демонстрирующие массу каждого потомка, значения: средней массы новорожденных и индивидуальной массы новорожденных на окончание испытания;

- токсические или другие эффекты на репродуктивную функцию, потомство и пост- натальное развитие;

- даты наблюдения за каждым аномальным случаем и его последующее течение;

- масса тела животных линии Р;

- данные аутопсии;

- подробное описание данных микроскопического исследования;

- статистическая обработка результатов, если необходимо;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.

5.3. Интерпретация результатов

Исследование репродуктивной токсичности дает информацию об эффектах повторного орального воздействия вещества. Результаты исследования должны рассматриваться совместно с результатами субхронического, тератогенного и других исследований. Экстраполяция результатов на людей действительна до определенной степени, результаты исследования могут дать полезную информацию о недействующих и допустимых уровнях воздействия на организм человека.