Приложение 6.6.3.2. Выявление эстроген-агонистической активности веществ методом ER-опосредованной транскрипционной активации стабильно трансфецированной люциферазы в клеточной линии BG1Luc

Приложение 6.6.3.2

Выявление эстроген-агонистической активности веществ методом ER-опосредованной транскрипционной активации стабильно трансфецированной люциферазы в клеточной линии BG1Luc

1. Общие положения и ограничения (см. также пп. 1.3 и 1.4)

1.1. В этом методе анализа используется клеточная линия BG1Luc4E2. Метод был валидизирован National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM) и Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM). Клеточные линии BG1Luc экспрессируют преимущественно эндогенный и незначительное количество эндогенного .

1.2. Этот метод может использоваться для тестирования широкого класса химических веществ при условии, что они растворимы в диметилсульфоксиде (ДМСО; CASRN 67-68-5), химически не взаимодействуют с ДМСО или клеточной средой и не обнаруживают цитотоксичности при используемых концентрациях. Если нельзя использовать ДМСО, возможно использовать другой носитель, например воду или этанол. Продемонстрированная эффективность этого BG1Luc ER ТА-метода для тестирования агонистов предполагает, что результаты тестирований можно использовать для выбора приоритетных веществ, подлежащих дальнейшим исследованиям.

1.3. Этот метод предназначен для детекции и опосредованной ТА-методом измерения хемилюминесценции по конечной точке. Хемилюминесценция широко используется в биологических анализах, поскольку для этого метода характерно высокое отношение сигналфон. Однако на активность люциферазы в клеточных системах могут влиять посторонние вещества, вызывая ингибирование люциферазы или, напротив, стабилизацию ее активности. Кроме того, в некоторых ER ТА-системах с использованием люциферазы в качестве репортера наблюдалась люминесценция, неопосредованная ER-рецепторами, при тестировании фитоэстрогена в концентрациях более 1 мкМ в результате гиперактивации гена-репортера люциферазы. И хотя вид кривой концентрация-ответ указывает на то, что при низких концентрациях происходит истинная, ER-опосредованная, активация люциферазы, анализ экспрессии люциферазы при более высоких концентрациях фитоэстрогена или аналогичных веществ, подозреваемых на фитоэстроген-подобную гиперактивации гена-репортера люциферазы, требует более осторожного подхода при тестировании с использованием STTA ER ТА-тестовых систем (см. прилож. 6.6.3.1).

1.4. Перед использованием этого метода в регуляторных целях Область применения (п. 1) и Описание ER ТА метода тестирования (п. 4) в основном тексте документа должны быть внимательно изучены.

2. Принцип метода тестирования (см. также п.п. 1.3 и 1.4)

2.1. Метод анализа основан на связывание лиганда с ER, с последующей транслокацией лиганд-рецепторного комплекса в ядро, где он связывается со специфическими последовательностями ДНК (эстроген-эффекторнными элементами) и трансактивирует репортерный ген люциферазы (luc). В результате увеличивается синтез люциферазы, что может быть количественно измерено с помощью люминометра по увеличению испускания света при расщеплении люциферазой своего субстрата. Активность люциферазы может быть быстро и недорого определена с использованием различных коммерчески доступных наборов. Для in vitro определения веществ с ER-агонистической активностью используется клеточная линия BG-1Luc ER ТА, созданная на основе ER-реактивной клеточной линии аденокарциномы яичников человека (BG-1) путем стабильной трансфекции репортерного конструкта, кодирующего люциферазу светлячка, под контролем четырех эстроген-эффекторных элементов, встроенных перед промотором вируса рака молочной железы мышей (MMTV). Этот MMTV-промотор проявляет лишь незначительную перекрестную реактивность с другими стероидными и нестероидными гормонами. Критерии для интерпретации данных детально рассмотрены в п. 4.6. Вкратце, позитивный эффект рассчитывается по кривой концентрация-ответ, содержащей как минимум три точки с неперекрывающимися доверительными интервалами (среднее ), при условии, что максимальное среднее нормализированное значение RLU для тестируемого вещества составляет не менее чем 20% от максимального значения RLU для референсного контроля ( [Е2; CASRN 50-28-2]).

3. Описание метода

Клеточная линия

3.1. В исследовании используют стабильно трансфецированную клеточную линию BG1Luc4E2. Эта клеточная линия доступна для заказа на условиях соглашения о техническом лицензировании в University of California, Davis, California, USA* и в Xenobiotic Detection Systems Inc., Durham, North Carolina, USA**.

Стабильность клеточной линии

3.2. Для обеспечения стабильности и постоянства клеточной линии после размораживания клетки необходимо растить в селективной среде для поддержания клеток не менее одного пассажа (см. п. 3.4). Не допускается культивировать клетки более чем 30 пассажей. Для клеточной линии BG1Luc4E2 30 пассажей составят примерно три месяца.

Клеточная культура и условия посева

3.3. Необходимо следовать процедурам, описанным в Руководстве по надлежащим практикам клеточных культур, чтобы обеспечить надлежащее качество всех материалов и правильность выполнения методов и чтобы сохранялась непрерывность, достоверность и воспроизводимость.

3.4. BG1Luc4E2-клетки культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 0,9% пенициллина-стрепромицина и 8,0% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в специальном для культур клеток при , влажности и в воздухе.

3.5. По достижении конфлюэнтности клетки BG1Luc4E2 субкультивируют и выдерживают 48 часов в безэстрогенных условиях, после чего высевают на 96-луночные планшеты для экспозиции с тестируемыми веществами и анализа эстроген-зависимой индукции люциферазной активности. Безэстрогенная среда (EFM) содержит DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко) без фенола красного с добавлением 4,5% очищенной на активированном угле, покрытым декстраном FBS, 1,9% L-глютамина и 0,9% раствора пенициллина-стрептомицина. Весь используемый пластик должен быть свободен от эстрогенной активности.

Критерии приемлемости теста

3.6. Принятие или не принятие тестирования основывается на результатах для референсных стандартов и контролей в каждом эксперименте на 96-луночном планшете. Референсный стандарт каждый раз тестируется в нескольких концентрациях, при этом референсный стандарт и контроли ставятся в нескольких повторах. Результаты сравниваются с контролями качества (QC) по соответствию тем параметрам, которые были получены для исторических баз данных, созданных в каждой лаборатории в ходе проверки на техническое владение методом. Исторические базы данных непрерывно пополняются данными по референсным стандартам и контролям в ходе каждого тестирования. Изменение лабораторных условий и используемого оборудования может потребовать обновления исторических баз данных.

Определение интервала между концентрациями

3.7. Критерии приемлемости теста по определению интервала между концентрациями следующие:

- Индукция (активация): определяется как наивысшее среднее RLU значение для референсного стандарта Е2, деленное на среднее значение RLU для контроля носителя (ДМСО). Результат должен соответствовать не менее чем 4-кратной индукции (как правило, наблюдается пятикратная индукция).

- Контроль носителя (ДМСО): RLU значения для контроля носителя в проводящемся тестировании должны быть в пределах 2,5-кратного стандартного отклонения (SD) для среднего RLU контроля растворителя из исторической базы данных.

- Если не выполняется любой из критериев приемлемости, такой тест отбрасывается и должен быть повторен заново.

Развернутый тест

3.8. Развернутое тестирование должно соответствовать критериям приемлемости для теста по определению интервала концентраций и дополнительно следующим критериям:

- Референсный стандарт: кривая концентрация-ответ для референсного стандарта Е2 должна иметь сигмоидную форму и, как минимум, три средних значения должны попадать в область линейного наклона кривой.

- Положительный контроль: среднее значение RLU для контроля с метоксихлором (methoxychlor) должно превышать среднее значение плюс три стандартных отклонения (SD) для ДМСО контроля.

- Если не выполняется любой из критериев приемлемости, такой тест отбрасывается и должен быть повторен заново.

Референсные стандарты, положительный контроль и контроль носителя

Контроль носителя

3.9. Носитель, используемый для растворения тестируемого вещества, должен выступать в качестве контроля носителя. В качестве носителя при валидизации BG1Luc ER ТА-метода тестирования использовался 1% (v/v) диметилсульфоксид (ДМСО, CASRN 67-68-5) (см. п. 3.16). Если будет использоваться носитель, отличный от ДМСО, все референсные стандарты, контроли и тестируемые вещества должны также растворяться и анализироваться в этом растворителе, если возможно.

Референсный стандарт (при определении интервала концентраций)

3.10. Референсным стандартом является Е2 (CASRN 50-28-2). При определении интервала концентраций референсный стандарт используется в четырех последовательных разведениях Е2 (, , и М), каждая концентрация тестируется в двух повторностях (в двух лунках).

Референсный стандарт (при полном исследовании)

3.11. При полном исследовании референсный стандарт Е2 включает 11 последовательных разведений с шагом 1 : 2 (от до М) в двух повторностях (в двух лунках).

Слабый положительный контроль

3.12. Слабый положительный контроль = М n,n'-метоксихлора (CASRN 72-43-5), разведенный в EFM (см. п. 3.5).

3.13. Величина активация люциферазы референсным стандартом (Е2) определяется как наивысшее среднее RLU значение для референсного стандарта Е2, деленное на среднее значение RLU для контроля носителя (ДМСО). Результат должен соответствовать не менее чем 4-кратной индукции.

Подтверждение технической компетентности лаборатории

3.14. Для того чтобы продемонстрировать владение BG1Luc ER ТА методом, лаборатория должна вести базу данных с результатами тестирования референсных стандартов и с данными контролей, полученных, как минимум, в 10 независимых экспериментах, проведенных в различные дни. База должна пополняться всеми дальнейшими результатами приемлемых тестирований. Для демонстрации достаточного владения методом в дальнейших тестированиях будет достаточно продемонстрировать значения, отклоняющиеся от исторических контролей не более чем на 2,5 стандартных отклонения (см. п. 3.6).

3.15. После создания и накопления данных в базе необходимо протестировать стандарты технической компетентности, перечисленные в табл. 2 раздела "Составляющие ER ТА метода тестирования" (п. 4.4 данного документа).

Носитель

3.16. Используемый растворитель должен быть способен растворять тестируемые вещества и смешиваться со средой для культивирования клеток. Вода, этанол (95-100%) и ДМСО являются подходящими носителями. Если используется ДМСО, его доля не должна превышать 1% (v/v). Для любого носителя должно быть показано, что максимальные используемые объемы не вызывают цитотоксического эффекта и не влияют на проведение анализа. Референсные стандарты и контроли растворяют в 100% растворителе и затем разводят в EFM до необходимой концентрации.

Подготовка тестируемых веществ

3.17. Тестируемые вещества растворяют в 100% ДМСО (или другом подходящем растворителе) и затем разводят до требуемых концентраций в EFM. Перед растворением и разбавлением все тестируемые вещества должны иметь комнатную температуру. Для каждого эксперимента готовят свежие растворы тестируемых веществ. Растворы не должны содержать заметный осадок или помутнение. Запасы растворов референсного стандарта и контролей можно приготовить в большом количестве, однако рабочие разведения стандарта, контролей и тестируемых веществ для каждого эксперимента должны быть свежими, и использовать их необходимо в течение 24 часов после приготовления.

Растворимость и цитотоксичность: определение интервала концентраций

3.18. При определении интервала проверяемых концентраций используют семь последовательных разведений тестируемого вещества с шагом 1:10 в двух повторностях. Первоначально тестируемое вещество проверяют вплоть до максимальной концентрации 1 мг/мл ( мМ). При фиксировании интервала концентраций определяют:

- начальную концентрацию тестируемого вещества, используемую при развернутом тестировании;

- шаг (кратность) разведения (1:2 или 1:5) для развернутого тестирования.

3.19. Оценка клеточной жизнеспособности/цитотоксичности описана в протоколе метода (7) и проводится при постановке экспериментов по определению интервала проверяемых концентраций и при развернутом тестировании. Метод оценки цитотоксичности, который использовался при валидизации BG1Luc ER ТА, является шкальной качественной оценкой жизнеспособности клеток путем визуального наблюдения, однако для определения цитотоксичности можно использовать и количественный метод (см. протокол /7/). Исключаются из рассмотрения данные, полученные для концентраций тестируемых веществ, вызывающих более чем 20%-е снижение жизнеспособности.

Экспозиция тестируемым веществом и расположение на планшете

3.20. Клетки подсчитывают и помещают в 96-луночные культуральные планшеты ( клеток на лунку) в EFM и инкубируют в течение 24 часов для прикрепления клеток к планшету. EFM удаляют, замещают EFM средой с растворенными тестируемыми и референсными веществми, и клетки инкубируют в течение 19-24 часов. Особое внимание следует обратить на тестирование высоко летучих веществ, поскольку тогда контрольные лунки, расположенные рядом с тестируемыми, могут показывать ложные положительные результаты. В тех случаях, когда летучесть вещества может представлять проблему, настоятельно рекомендуется заклеивать планшеты специально применяемыми мембранами, что поможет эффективно изолировать индивидуальные лунки во время тестирования.

Определение интервала концентраций

3.21. При определении интервала проверяемых концентраций используют все лунки 96-луночного планшета для исследования до шести веществ в семи последовательных разведениях с шагом 1:10 в двух повторностях (табл. 6.6.3.2.1). В качестве референсного стандарта используют Е2 в четырех концентрациях, каждая взятая в двух повторностях. Контроль носителя (VC)=ДМСО ставится в четырех лунках на каждом планшете (табл. 6.6.3.2.1).

Таблица 6.6.3.2.1

Расположение на 96-луночном планшете для определения интервала концентраций

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

TS1-1

TS1-1

TS2-1

TS2-1

TS3-1

TS3-1

TS4-1

TS4-1

TS5-1

TS5-1

TS6-1

TS6-1

В

TS1-2

TS1-2

TS2-2

TS2-2

TS3-2

TS3-2

TS4-2

TS4-2

TS5-2

TS5-2

TS6-2

TS6-2

С

TS1-3

TS1-3

TS2-3

TS2-3

TS3-3

TS3-3

TS4-3

TS4-3

TS5-3

TS5-3

TS6-3

TS6-3

D

TS1-4

TS1-4

TS2-4

TS2-4

TS3-4

TS3-4

TS4-4

TS4-4

TS5-4

TS5-4

TS6-4

TS6-4

Е

TS1-5

TS1-5

TS2-5

TS2-5

TS3-5

TS3-5

TS4-5

TS4-5

TS5-5

TS5-5

TS6-5

TS6-5

F

TS1-6

TS1-6

TS2-6

TS2-6

TS3-6

TS3-6

TS4-6

TS4-6

TS5-6

TS5-6

TS6-6

TS6-6

G

TS1-7

TS1-7

TS2-7

TS2-7

TS3-7

TS3-7

TS4-7

TS4-7

TS5-7

TS5-7

TS6-7

TS6-7

Н

Е2-1

Е2-2

Е2-3

Е2-4

VC

VC

VC

VC

Е2-1

Е2-2

Е2-3

Е2-4

Сокращения:

Е2-1 - Е2-4 = концентрации (от большей к меньшей) референсного контроля Е2;

TS1-1 - TS1-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 1;

TS2-1 - TS2-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 2;

TS3-1 - TS3-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 3;

TS4-1 - TS4-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 4;

TS5-1 - TS5-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 5;

TS6-1 - TS6-7 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 6;

VC = ДМСО + (1% v/v) EFM - контроль носителя.

3.22. Рекомендуемый конечный объем среды для каждой лунки составляет 200 мкл. Для тестирования используйте только те планшеты, где клетки во всех лунках имеют жизнеспособность 80% и выше.

3.23. Определение исходных концентраций для развернутого тестирования детально описаны в протоколе (7). Вкратце, используются следующие критерии:

- если на кривой концентрация-ответ тестируемого вещества отсутствуют точки, превышающие среднее значение плюс трехкратное стандартное отклонение SD для контроля с ДМСО, тогда полное тестирование проводят с использованием 11 последовательных разведений с шагом 1:2, начиная с максимальной концентрации, при которой тестируемое вещество растворяется полностью;

- если на кривой концентрация-ответ тестируемого вещества имеются точки, превышающие ДМСО, тогда начальная концентрация для расширенного тестирования должна быть на один шаг выше, чем концентрация, дающая максимальное приведенное значение RLU при поиске интервала концентраций. При этом для 11 последовательных разведений используют шаг 1:2 или 1:5 в соответствии со следующими критериями:

- если кривая концентрация-ответ, полученная в эксперименте по определению интервала концентраций, включает весь диапазон ТА-ответов, то в при полном тестировании используют 11 последовательных разведений с шагом 1:2; иначе, используют шаг разведения 1:5.

- если вещество в эксперименте по определению интервала концентраций, дает двухфазную кривую концентрация-ответ, то при расширенном тестировании должны быть проверены оба интервала концентраций.

Полное (расширенное) тестирование

3.24. Расширенное тестирование состоит из 11 последовательных разведений (либо 1:2 или 1:5, в зависимости от начальной концентрации, определенной по критериям для расширенного тестирования), при этом каждая проверяемая концентрация используется в трех повторностях в соседних лунках 96-луночного планшета (табл. 6.6.3.2.2). В качестве референсного стандарта используется Е2 в 11 концентрациях (табл. 6.6.3.2.2), каждая взятая в двух посторностях. Контроль носителя (ДМСО) ставится в четырех лунках, как и контроль с метоксихлором ( М), на каждом планшете.

Таблица 6.6.3.2.2

Расположение на 96-луночном планшете при проведении расширенного теста

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

А

TS1-1

TS1-2

TS1-3

TS1-4

TS1-5

TS1-6

TS1-7

TS1-8

TS1-9

TS1-10

TS1-11

VC

В

TS1-1

TS1-2

TS1-3

TS1-4

TS1-5

TS1-6

TS1-7

TS1-8

TS1-9

TS1-10

TS1-11

VC

С

TS1-1

TS1-2

TS1-3

TS1-4

TS1-5

TS1-6

TS1-7

TS1-8

TS1-9

TS1-10

TS1-11

VC

D

TS2-1

TS2-2

TS2-3

TS2-4

TS2-5

TS2-6

TS2-7

TS2-8

TS2-9

TS2-10

TS2-11

VC

Е

TS2-1

TS2-2

TS2-3

TS2-4

TS2-5

TS2-6

TS2-7

TS2-8

TS2-9

TS2-10

TS2-11

Meth

F

TS2-1

TS2-2

TS2-3

TS2-4

TS2-5

TS2-6

TS2-7

TS2-8

TS2-9

TS2-10

TS2-11

Meth

G

Е2-1

Е2-2

Е2-3

Е2-4

Е2-5

Е2-6

Е2-7

Е2-8

Е2-9

Е2-10

Е2-11

Meth

Н

Е2-1

Е2-2

Е2-3

Е2-4

Е2-5

Е2-6

Е2-7

Е2-8

Е2-9

Е2-10

Е2-11

Meth

Сокращения:

TS1-1 - TS1-11 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 1;

TS2-1 - TS2-11 = концентрации (от большей к меньшей) тестируемого вещества 2;

Е2-1 - Е2-11 = концентрации (от большей к меньшей) референсного контроля Е2;

Meth = р,р' метоксихлор - слабый положительный контроль; VC=DMSO (1% v/v) EFM - контроль носителя.

3.25. Для обеспечения независимости тестирования повторный расширенный тест (его дубликат) для того же самого химического вещества должен проводиться в другие дни. Необходимо провести, по крайней мере, два расширенных теста. Если результаты тестов противоречат друг другу (например, один тест положительный, другой отрицательный), или если один из тестов недостоверный, необходимо дополнительно провести третий расширенный тест.

Измерение люминесценции

3.26. Люминесценцию измеряеют в диапазоне от 300 до 650 нм, используя инъекционный люминометр с программным обеспечением, которое управляет объемом впрыска и длительностью интервала измерения (7). Излучение света в каждой лунке выражается в RLU для каждой лунки.

4. Анализ и интерпретация данных

Установление EC50

4.1. Величина ЕС50 (средняя эффективная концентрация тестируемого вещества) определяется на основе данных концентрация-ответ и рассчитывается, используя уравнение Хилла или подходящий альтернативный метод. Уравнение Хилла представляет математическую модель логистической зависимости, определяемой четырьмя параметрами и задающей соответствие между величиной ответа и концентрацией вещества (обычно соответствующую сигмоидной кривой) в соответствии с уравнением:

, где

Y = ответ (например, RLU);

X = логарифм концентрации;

Bottom = минимальный ответ;

Тор = максимальный ответ;

lg ЕС50 = десятичный логарифм концентрации в точке, где ответ равен половине величины между Тор и Bottom;

Hillslope (коэффициент Хилла) характеризует крутизну наклона кривой.

Модель наилучшим образом подходит для расчета Top, Bottom, Hillslope, and ЕС50 параметров методом наилучшего приближения. Для расчета ЕС50 и максимального уровня индукции используют соответствующее статистическое программное обеспечение (например, статистическая программа Graphpad Prism).

Определение выпадающих значений (выбросов)

4.2. При статистически корректных расчетах следует предварительно использовать Q-тест (и/или другие аналогичные) для определения "непригодных", выпадающих значений для лунок, которые необходимо исключить из анализа данных.

4.3. Любое приведенное значение RLU для двух повторностей референсных стандартов при данной концентрации Е2 рассматривается как выброс, если его значение более чем на 20% отличается от приведенных значений RLU для этой концентрации в исторический# базе.

Сбор и нормализация люминометрических данных при определении интервала между концентрациями

4.4. Исходные люминометрические данные необходимо ввести в таблицу, предназначенную для данного метода тестирования. Следует определить значения, являющиеся выбросами, которые надо исключить из рассмотрения (см. Критерии приемлемости теста для параметров, определяемых в ходе анализа). Производят следующие вычисления:

Этап 1 - рассчитать среднее значение для ДМСО VC.

Этап 2 - из значения люминесценции в каждой лунке вычесть среднее значение для ДМСО VC для того, чтобы получить нормализованные данные.

Этап 3 - рассчитать среднюю кратность индукции для референсного стандарта (Е2).

Этап 4 - рассчитать среднее значение ЕС50 для тестируемых веществ.

Сбор и нормализация люминометрических данных при развернутом тестировании

4.5. Исходные люминометрические данные необходимо ввести в таблицу, предназначенную для данного метода тестирования. Следует определить значения, являющиеся выбросами, которые надо исключить из рассмотрения (см. Критерии приемлемости теста для параметров, определяемых в ходе анализа). Производят следующие вычисления:

Этап 1 - рассчитать среднее значение для ДМСО VC.

Этап 2 - из значения люминесценции в каждой лунке вычесть среднее значение для ДМСО VC для того, чтобы получить нормализованные данные.

Этап 3 - рассчитать среднюю кратность индукции для референсного стандарта (Е2).

Этап 4 - рассчитать среднее значение ЕС50 для Е2 и для тестируемых веществ.

Этап 5 - рассчитать среднее приведенное значение RLU для метоксихлора (methoxychlor).

Критерии интерпретации данных

4.6. BG1Luc ER ТА-метод, являясь элементом подхода, называемого "сумма доказательств", призван помочь приоритезировать вещества для дальнейшего тестирования способности оказывать влияние на эндокринную систему (ED) in vivo. Частью этой процедуры приоритезации веществ и является его классификация как положительного или отрицательного относительно ER-агонистической активности. В табл. 6.6.3.2.3 представлены критерии положительной и отрицательной классификации веществ, использовавшихся при валидизации BG1Luc ER ТА-анализа.

Таблица 6.6.3.2.3

Критерии положительной и отрицательной классификации

Положительные	- Все вещества, классифицируемые как положительные, т.е. проявляющие ER-агонистическую активность, должны давать кривую концентрация-ответ, состоящую из базовой линии с последующим подъемом активации, переходящим в плато или горб. В отдельных случаях могут наблюдаться только два из этих характерных участков (базовая линия и подъем или подъем и пик). - Линия, характеризующая наклон подъема должна содержать как минимум три точки с неперекрывающимися диапазонами SD (среднее ). При этом точки, составляющие базовую линию, исключаются из рассмотрения, однако линейная часть подъема может включать собственно пиковое значение или первую точку, попадающую на плато. - Вещество классифицируется как положительное, если амплитуда активации (разница между базовой линией и пиковым значением) составляет, как минимум, 20% от максимального значения для референсного вещества (Е2) (например, 2000 RLUs или более, когда/если максимальный ответ для референсного эстрогена приведен к 10 000 RLUs). - При возможности для каждого положительно классифицированного вещества следует рассчитать величину ЕС50
Отрицательные	Вещество классифицируют как отрицательное, если среднее приведенное RLU значение при данной концентрации равняется или ниже, чем среднее значение RLU для контроля с ДМСО плюс трехкратная величина стандартного отклонения
Некорректные	Если данные не являются достоверными и не позволяют судить о наличии или отсутствии активации (из-за существенного количественного или качественного несоответствия), то такие данные считаются некорректными и не могут использоваться для классификации вещества в качестве положительного или отрицательного

4.7. Критерии интерпретации данных представлены в табл. 3. Насколько возможно, положительные результаты должны характеризоваться как величиной относительной активации (кратностью активации), так и характерной концентрацией, при которой данный эффект обнаруживается. Примеры положительных, отрицательных и некорректных данных представлены на рисунке.

4.8. Расчет ЕС50 можно произвести, используя уравнение Хилла с четырьмя параметрами. Соответствие критериям приемлемости теста говорит только о том, что процедура тестирования проводится надлежащим образом, но это еще не гарантирует получения точных данных в каждом конкретном тестировании. Наилучшим подтверждением правильности полученных результатов является воспроизведение результатов первого теста при повторном тестировании.

5. Подготовка тестового отчета

5.1. См. п. 6 "Подготовка тестового отчета" основного текста настоящего документа.