Приложение 6.8.16. Генетическая токсикология: Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

Приложение 6.8.16

Генетическая токсикология: Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 487 "Genetic Toxicology: In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test" (ОЭСР Руководство N 487 "Генетическая токсикология: Микроядерный тест на клетках млекопитающих in vitro"). Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/OECD), принят 22 июля 2010 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Микроядерный тест in vitro (МТ) - является методом, который проводится на культивируемых клетках человека и грызунов. Тест дает полное основание исследовать хромосомные нарушения in vitro, поскольку выявляет как анеугены, так и кластогены.

2. Общие положения

2.1. Тесты in vitro обычно требуют использования экзогенного источника метаболической активации, за исключением клеток, которые метаболически компетентны в отношении исследуемых соединений. Система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия, присутствующие у млекопитающих in vivo. Следует тщательно избегать условий, которые могут привести к результатам, не отвечающим реальной мутагенности. Позитивные результаты, не отвечающие реальной мутагенности, могут возникать вследствие изменения рН, осмотической концентрации, высокого уровня токсичности. Если исследуемое вещество вызывает изменение рН среды во время введения в культуру, значение рН должно быть скорректировано, предпочтительно добавлением забуференного исходного раствора. Таким образом, все объемы при всех концентрациях и все контроли будут иметь одинаковое значение рН.

2.2. Для анализа индукции микроядер необходимо, чтобы митозы были как в опытных, так и контрольных культурах. Для анализа микроядер наиболее информативной является стадия, при которой клетки прошли один митоз во время или после воздействия исследуемого вещества.

3. Принцип метода

3.1. МТ - метод оценки генотоксичности по выявлению микроядер в цитоплазме интерфазных клеток. Микроядра могут образовывать ацентрические фрагменты хромосом (т.е. с отсутствием центромеры) или целые хромосомы, которые не способны мигрировать к полюсам на стадии анафазы клеточного деления. Метод оценивает кластогенную и анеугенную активности химических веществ в клетках, которые проходят клеточное деление во время или после экспозиции исследуемого вещества. Данное руководство касается использования протоколов без или с применением ингибитора актинполимеразы цитохалазина В (ЦХ). Добавление ЦХ перед изучаемым митозом позволяет идентифицировать и проводить анализ частоты микроядер в клетках, которые прошли один митоз, так как такие клетки двуядерны. Это руководство также дает описание протокола без блока цитокинеза при условии наличия данных, что анализируемая клеточная популяция митотически активна.

3.2. В дополнение к использованию цитокинетического блока для идентификации индуцирующих микроядра химических веществ иммунохимическое мечение кинетохоров или гибридизация с центромерными/теломерными зондами (флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)) позволяют получить информацию по механизмам хромосомных нарушений и образования микроядер. Процедуры мечения и гибридизации можно использовать в случаях, когда имеется повышение образования микроядер и исследователь хочет выяснить, является ли это возрастание результатом кластогенных и/или анеугенных событий.

3.3. Микроядра представляют собой нарушения хромосом, которые передаются дочерним клеткам, тогда как аберрации хромосом, анализируемые в метафазных клетках, могут не передаваться. Поскольку выявление микроядер в интерфазных клетках достаточно объективно, сотрудникам лабораторий необходимо определить, прошла или не прошла клетка клеточное деление и какое количество клеток содержит микроядра. В результате анализ препаратов проводится относительно быстро и может быть автоматизирован. На практике это позволяет анализировать тысячи, а не сотни клеток, увеличивая силу метода. Наконец, поскольку микроядра могут образовывать отставшие хромосомы, возникает возможность выявлять агенты, индуцирующие анеуплоидию, что трудно оценивать в стандартном тесте на хромосомные аберрации (например, Руководство OECD 473). Однако без специальных методик, таких как FISH, которая описана в п. 6, МТ не позволяет дифференцировать вещества, индуцирующие полиплоидию, от веществ, которые индуцируют кластогенность.

3.4. МТ надежен и эффективен в различных типах клеток как в присутствии, так и отсутствии ЦХ. Имеется большое количество данных, показывающих приемлемость МТ при использовании клеток грызунов различных линий (СНО, V79, CHL/IU и L5178Y) и лимфоцитов человека. Они включают Международное исследование по валидизации теста, координируемое the Francaise de Toxicologie (SFTG) и доклады Международных совещаний по генетическому тестированию. Все приемлемые данные были также повторно оценены в "weight-of-evidence" ретроспективном валидационном исследовании Европейского центра по валидизации альтернативных методов (ECVAM) Европейской Комиссии (ЕС). Метод тестирования рекомендован как научно обоснованный ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC). Имеются данные по использованию клеточной линии лимфобластных клеток человека ТК6, HepG2 клеток и первичных эмбриональных клеток сирийского хомячка, хотя они не проходили валидизационное исследование.

3.5. Культуры клеток человеческого или животного происхождения обрабатывают исследуемым веществом как без, так и в присутствии экзогенного источника метаболической активации за исключением клеток с адекватными особенностями метаболизма. Во все тесты включают контроли с растворителем/разбавителем и позитивные контроли.

3.6. Во время и после воздействия исследуемым веществом клетки должны расти такой период времени, который достаточен для формирования хромосомных нарушений или нарушений веретена деления и в результате микроядер в интерфазных клетках. Для индукции анеуплоидии тестируемое вещество обычно должно присутствовать на протяжении всего митоза. Микроядра анализируют в фиксированных и окрашенных интерфазных клетках. В идеале микроядра следует анализировать только в тех клетках, которые закончили митоз во время экспозиции исследуемого вещества или в течение постэкспозиционного периода, если таковой используется. В культурах, которые обрабатывают блокатором цитокинеза, это достигается при анализе двуядерных клеток. В отсутствии блока цитокинеза важно показать, что анализируемые клетки прошли клеточное деление во время или после воздействия исследуемым веществом. Для всех протоколов важно показать, что пролиферация клеток была как в контрольных, так и опытных культурах. В культурах, в которых анализируют микроядра (или параллельных культурах), степень индуцированных исследуемым веществом цитотоксичности и цитостатичности должна быть определена.

4. Описание метода

4.1. Материалы

4.1.1. Используют первичные культуры лимфоцитов периферической крови человека и клеточные линии грызунов, такие как СНО, V79, CHL/IU и L5178Y. Использование других клеточных линий и типов должно быть научно обосновано по критериям, описанным в разделе "Критерии приемлемости". Так как спонтанная частота микроядер влияет на чувствительность метода, рекомендуется использовать типы клеток с низкой, стабильной спонтанной частотой образования микроядер.

4.1.2. Лимфоциты человека следует отбирать у молодых (возраст приблизительно 18-35 лет), здоровых, некурящих индивидов, которые не имели недавнего контакта с генотоксическими химическими веществами и радиацией. Если клетки более чем одного донора объединяют для использования, число доноров должно быть указано. Частота микроядер возрастает с возрастом индивидов, и этот тренд более заметен у женщин, чем у мужчин. Это следует принимать во внимание при отборе доноров для объединения результатов.

Среды и условия культивирования

4.1.3. Необходимо использовать соответствующую культуральную среду и условия инкубации (культуральная посуда, температура, концентрация и влажность). Перевиваемые клеточные линии и штаммы должны обычно проверяться на стабильность модального числа хромосом и отсутствие контаминации микоплазмой. Не следует использовать культуры, если выявлена контаминация микоплазмой, или модальное число хромосом изменено. Должна быть известна нормальная продолжительность клеточного цикла для условий культивирования, используемых в лаборатории. Если используется метод цитокинетического блока, то концентрация ингибитора цитокинеза должна быть оптимизирована для каждого типа клеток и должно быть показано, что имеется достаточное количество двуядерных клеток для анализа.

Подготовка культур

4.1.4. Перевиваемые клеточные линии и штаммы: клетки отбирают из исходных (сток) культур, высевают в культуральную среду в такой плотности, чтобы культура не достигла слияния в монослое, а суспензионные культуры не достигли избыточной плотности к моменту фиксации. Клетки инкубируют при 37°С.

4.1.5. Лимфоциты: цельную кровь, обработанную антикоагулянтом (например, гепарином), или выделенные лимфоциты культивируют в присутствии митогена фитогемагглютинина (ФГА) перед воздействием исследуемого вещества и ЦХ.

Метаболическая активация

4.1.6. При работе с клетками, у которых отсутствует адекватная эндогенная метаболическая система, следует использовать систему экзогенной метаболической активации. Наиболее часто используемая система включает кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9) печени грызунов, обработанных индукторами ферментов, такими как Arochlor 1254, или комбинация фенобарбитала и . Последняя комбинация не противоречит Стокгольмской конвенции по стойким органическим загрязнениям и, как было показано, так же эффективна, как Arochlor 1254 по индукции оксигеназ смешанной функции. Обычно S9-фракцию используют в концентрации в диапазоне 1-10% от конечного объема среды. Условия системы метаболической активации зависят от класса тестируемого химического соединения. В некоторых случаях возможно проведение опыта с более чем одной концентрацией постмитохондриальной фракции.

4.1.7. Генетически инженерные клеточные линии, экспрессирующие специфические активирующие ферменты человека или грызунов, могут ограничить необходимость применения экзогенных систем метаболической активации и могут быть использованы в данной тест-системе. В этом случае выбор клеточных линий должен быть научно обоснован, например, пригодность оксидаз смешанной функции для метаболизма исследуемого вещества; по ответу при тестировании известных кластогенов и анеугенов (смотри раздел "Критерии приемлемости"). Следует помнить, что тестируемое вещество может не метаболизироваться экспрессируемыми оксидазами смешанной функции. В этом случае отрицательный результат не указывает на то, что вещество не индуцирует микроядра.

Подготовка исследуемого вещества

4.1.8. Твердые вещества необходимо растворять в соответствующих растворителях или разбавителях и разводить перед обработкой клеток. Газообразные и летучие соединения следует тестировать при соответствующих модификациях стандартного протокола, таких как обработка в закупоренных сосудах. Свежие препараты следует использовать до тех пор, пока не будут получены данные об их стабильности при соответствующих условиях хранения.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен химически взаимодействовать с исследуемым веществом и не должен влиять на выживаемость клеток и активность S9-системы в используемых концентрациях. Если помимо хорошо изученных растворителей/разбавителей (например, воды, культуральной среды, диметилсульфоксида), используется другой, его применение должно быть обосновано данными, показывающими его совместимость с исследуемым веществом и отсутствие у него генетической активности. Рекомендуется, если возможно, использовать в первую очередь водные растворы/суспензии.

Использование ЦХ как блокатора цитокинеза

4.2.2. Одним из важнейших моментов проведения МТ является гарантия того, что анализируемые клетки прошли митоз во время обработки или в период инкубации после обработки, если его использовали в методике. ЦХ - вещество, которое наиболее широко используется для блокирования цитокинеза, так как он подавляет сборку актина и таким образом препятствует разделению дочерних клеток после митоза, приводя к формированию двуядерных клеток. Поэтому подсчет микроядер может быть ограничен клетками, которые прошли митоз во время или после воздействия. Одновременно можно оценить действие вещества на кинетику пролиферации. ЦХ следует использовать как блокатор цитокинеза в опытах с лимфоцитами человека, так как длительность клеточного цикла может варьировать между культурами и между донорами, и не все лимфоциты будут отвечать на ФГА. Когда тестируют клеточные линии, используют другие методики, чтобы определить, прошли ли учитываемые клетки деление. Это рассмотрено ниже (см. п. 4.2.8).

4.2.3. Необходимые концентрации ЦХ следует определить в лаборатории для каждого типа клеток, чтобы достичь оптимальной частоты двуядерных клеток в контрольных культурах с растворителем/разбавителем. Обычно приемлемая концентрация ЦХ находится в диапазоне между 3 и 6 мкг/мл.

Измерение клеточной пролиферации и цитотоксичности, выбор экспозиционных концентраций

4.2.4. При определении максимальной исследуемой концентрации вещества следует избегать концентраций, которые могут вызвать искусственный положительный ответ, вызывая сильную цитотоксичность, преципитацию в культуральной среде или заметное изменение рН и осмотической концентрации.

4.2.5. Анализ клеточной пролиферации проводится для того, чтобы установить, что клетки находились в митозе во время обработки и что воздействие привело к приемлемому уровню цитотоксичности (см. п. 4.2.11). В опытах без ЦХ цитотоксичность следует оценивать в вариантах с наличием и без метаболической активации в клетках, которые не требуют метаболической активации, используя относительное возрастание количества клеток (RICC) (см. формулы п. 5.3) и относительное удвоение популяции (RPD). В опытах с ЦХ цитотоксичность может быть определена, используя индекс репликации (RI) (см. формулы п. 5.3).

4.2.6. Обработка культур ЦХ и определение относительных частот одноядерных, двуядерных и многоядерных клеток в культуре является точным методом установления количественного эффекта воздействия на клеточную пролиферацию, цитостатическую и цитотоксическую активность и позволяет анализировать только клетки, которые делились во время или после воздействия.

4.2.7. В исследованиях с ЦХ цитостатичность/цитотоксичность можно количественно оценить, используя индекс пролиферации при блоке цитокинеза (CBPI) или вывести из RI при анализе 500 клеток на культуру (см. формулы п. 5.3). Эти параметры наряду с другими можно использовать при оценке цитотоксичности, сравнивая величины в экспериментальных и контрольных культурах. Оценка других показателей цитотоксичности (конфлюентность, число клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз) также дает полезную информацию.

4.2.8. В экспериментах без ЦХ необходимо показать, что анализируемые клетки прошли деление во время или после воздействия исследуемым веществом. Если это не сделать, то могут быть получены ложноотрицательные результаты. Методы, которые используются для анализа делящихся клеток, включают: инкорпорацию и последующее выявление бромдезоксиуридина (БДУ) для идентификации клеток, прошедших репликацию; образование клонов, когда клетки перевиваемых клеточных линий обрабатываются и подсчитываются in situ на стекле под микроскопом (индекс пролиферации (PI)) или определяется относительное удвоение популяции (RPD), или относительное возрастание количества клеток (RICC), или другие обоснованные методы (см. формулы п. 5.3). Оценка других показателей цитотоксичности (конфлюентность, число клеток, апоптоз, некроз, подсчет метафаз) также дает полезную информацию.

4.2.9. Должны быть оценены, по крайней мере, 3 концентрации, которые позволяют провести анализ. Для достижения этого, по-видимому, необходимо провести эксперимент, используя большое число близко ранжированных концентраций, и анализировать микроядра при концентрациях, проявивших подходящий уровень цитотоксичности. Альтернативная стратегия - проведение предварительного эксперимента по оценке цитотоксичности, чтобы ограничить диапазон концентраций для основного теста.

4.2.10. Наивысшая концентрация должна вызывать цитотоксичность на уровне . Высокие концентрации могут индуцировать хромосомные нарушения, которые являются вторичным эффектом цитотоксичности. При выявлении цитотоксичности исследуемые концентрации должны быть в диапазоне от концентрации, вызывающей цитотоксичность , до концентраций с минимальной цитотоксичностью или отсутствием цитотоксичности.

4.2.11. Если не наблюдается цитотоксичность или преципитация, максимальные концентрации следует брать 0,01М, 5 мг/мл или 5 мкл/мл, выбирая из них наименьшую. Интервал между выбранными концентрациями следует брать не более . Для веществ, у которых выявляется крутая зависимость концентрация-эффект, возможно использование более узкого интервала между концентрациями, анализируя культуры со средним и низким уровнем токсичности.

4.2.12. Когда ограничивающим фактором является растворимость, максимальная концентрация, если не ограничивает цитотоксичность, берется на уровне наименьшей концентрации, при которой в культуре отмечается минимальная преципитация, не мешающая анализу препарата. Оценка преципитации проводится методами световой микроскопии, при выявлении преципитации, которая персистирует, или по проявлению преципитации во время культивирования (в конце воздействия).

Контроли

4.2.13. В каждый опыт для вариантов в присутствии и без метаболической активации должны быть включены позитивные контроли и контроли с растворителем/разбавителем.

4.2.14. Позитивные контроли необходимы, чтобы показать способность использованных клеток и протокола тестирования выявлять кластогены и анеугены и подтвердить метаболическую способность S9. Позитивные контроли выбираются из известных веществ, индуцирующих образование микроядер в концентрациях, которые вызывают небольшое, но воспроизводимое повышение эффекта над контролем и демонстрируют чувствительность тест-системы. Концентрации позитивных контролен подбирают так, чтобы эффект был четким, но не позволял исследователю сразу идентифицировать зашифрованный препарат.

4.2.15. Кластогены, для которых необходима метаболическая активация (например, циклофосфамид, бенз(а)пирен), следует использовать, чтобы показать как метаболическую компетентность, так и способность теста идентифицировать кластогены. При обосновании можно использовать другие вещества в качестве позитивного контроля. Поскольку некоторые позитивные контроли, которые нуждаются в метаболической активации, могут быть активны без экзогенной метаболической активации при определенных условиях воздействия или в определенных клеточных линиях, необходимость метаболической активации и активность S9 следует изучить на выбранных клеточных линиях и при отобранных концентрациях.

4.2.16. В настоящее время не известны анеугены, которые требуют метаболической активации для проявления генотоксической активности. К веществам, принятым как позитивный контроль для оценки анеугенной активности, относятся, например, колхицин и винбластин. Можно использовать другие вещества, если они индуцируют микроядра исключительно или в основном через анеугенную активность. Чтобы избежать необходимости двух контролей (для кластогенности и анеугенности) без метаболической активации, анеугенный контроль может применяться как позитивный в вариантах без S9, а контроль кластогенности может использоваться для оценки адекватности используемой системы метаболической активации. Позитивные контроли на кластогенность и анеугенность следует использовать на клетках, которые не требуют S9 (см. табл. 6.8.16.1).

Таблица 6.8.16.1

Стандартные (референсные) вещества, рекомендованные для оценки качества*

Категория	Вещество	Номер CAS
1. Кластогены, активные без метаболической активации
	Цитозин арабинозид	147-94-4
	Митомицин С	50-07-7
2. Кластогены, требующие метаболическую активацию
	Бенз(а)пирен	50-32-8
	Циклофосфамид	50-18-0
3. Анеугены
	Колхицин	64-86-8
	Винбластин	143-67-9
4. Негативные контрольные вещества
	Ди(2-этилгексил)фталат	117-81-7
	Налидиксовая кислота	389-08-2
	Пирен	129-00-0
	Хлорид натрия	7647-17647-14-5

______________________________

* Стандартные (референсные) вещества - рекомендованные к использованию вещества. Замена или добавление химического вещества к перечисленным выше может быть сделана, если известна их активность, если они индуцируют микроядра по тому же механизму действия, и если было показано, что они относятся к веществам, которые будут оценены в МТ. В зависимости от цели обоснование может включать валидационное (проверочное) исследование, включающее широкий спектр веществ, или сфокусированное на сужение спектра, основанное на химическом классе исследованного вещества или изученном механизме нарушений.

4.2.17. Можно допустить использование веществ, химически связанных с известными позитивными контролями. Все используемые вещества позитивного контроля должны соответствовать типу клеток и условиям активации.

4.2.18. Контроль с растворителем/разбавителем должен присутствовать для каждого времени фиксации. Дополнительно негативный контроль без обработки также может ставиться, пока опубликованные данные или исторический контроль лаборатории не покажет, что растворитель в использованных концентрациях не индуцирует генотоксические и другие вредные эффекты.

4.3. Проведение эксперимента

Схема обработки

4.3.1. Для того чтобы максимизировать вероятность выявления анеугена или кластогена, активных в специфических стадиях клеточного цикла, необходимо, чтобы достаточное число клеток было обработано исследуемым веществом в течение всех стадий клеточного цикла. Схемы обработки для клеточных линий и первичных клеточных культур могут отличаться от таковой для лимфоцитов, которые требуют стимуляции митогеном для начала клеточного цикла (см. пп. 4.3.5-4.3.7).

4.3.2. Теоретические подходы вместе с опубликованными данными показывают, что большинство анеугенов и кластогенов будут выявлены при коротком периоде обработки от 3 до 6 часов в присутствии и отсутствии S9, последующем удалении исследуемого соединения и периоде роста в течение 1,5-2,0 клеточных циклов. После начала или окончания обработки клетки фиксируют через промежуток времени, эквивалентный приблизительно 1,5-2,0-кратной продолжительности нормального (т.е. без обработки) клеточного цикла (см. табл. 6.8.16.2). Время фиксации или восстановления может быть увеличено, если известно или ожидается, что вещество нарушает продолжительность клеточного цикла (например, при исследовании аналогов нуклеозидов).

4.3.3. Из-за потенциальной цитотоксичности S9 для культивируемых клеток млекопитающих длительность экспозиции 1,5-2,0 нормального клеточного цикла используется только в вариантах при отсутствии S9. Существует мнение, что при длительной экспозиции можно проводить обработку клеток химическим веществом при отсутствии и в присутствии ЦХ. Это мнение относится к ситуациям, когда предполагается возможное взаимодействие между исследуемым веществом и ЦХ.

4.3.4. Предлагаемая схема обработки клеток представлена в табл. 6.8.16.2. Эти общие схемы обработки можно модифицировать в зависимости от стабильности и реакционной способности исследуемого вещества или особых характеристик роста используемых клеточных линий. Все виды обработки культуры должны начинаться и заканчиваться в период, когда клетки растут экспоненциально. Эти схемы в деталях представлены далее в пп. 4.3.5-4.3.11.

Таблица 6.8.16.2

Время обработки клеток и фиксации в микроядерном тесте

Лимфоциты, первичные клеточные культуры и клеточные линии с введением ЦХ	+S9	Длительность обработки 3-6 часов в присутствии S9; удаление S9 и среды с веществом; добавление свежей среды и ЦХ; фиксация через промежуток времени 1,5-2,0 нормального клеточного цикла
	-S9, кратковременная экспозиция	Длительность обработки 3-6 часов; удаление среды с веществом; добавление свежей среды и ЦХ; фиксация через промежуток времени 1,5-2,0 нормального клеточного цикла
	-S9, длительная экспозиция	Вариант А: обработка 1,5-2,0 нормального клеточного цикла в присутствии ЦХ; фиксация в конце периода экспозиции. Вариант Б: обработка 1,5-2,0 нормального клеточного цикла; удаление исследованного вещества; добавление свежей среды и ЦХ; фиксация через промежуток времени 1,5-2,0 нормального клеточного цикла
Клеточные линии обрабатываются без ЦХ (Схемы введения идентичны представленным выше, за исключением того, что ЦХ не добавляется)

Лимфоциты, первичные клетки и клеточные линии с ЦХ

4.3.5. Для лимфоцитов наиболее эффективный подход - начать экспозицию исследуемым веществом через 44-48 часов после стимуляции ФГА, когда исчезает синхронизация клеточного цикла. В начальном эксперименте клетки обрабатывают исследуемым веществом от 3 до 6 часов в отсутствии или присутствии S9. Затем среду с веществом удаляют и замещают свежей средой, содержащей ЦХ. Клетки фиксируют через 1,5-2,0 нормальных клеточных цикла.

4.3.6. Если начальные тесты с коротким (3-6 часов) периодом обработки показали отрицательный или сомнительный результат, используют протокол с длительной экспозицией без S9. Одинаково приемлемы 2 варианта обработки. Однако, возможно для стимулированных лимфоцитов более подходит Вариант А, когда экспоненциальный рост может снижаться к 96 часу после стимуляции. Также в культурах клеток не следует достигать высокой конфлюентности при выборе времени фиксации в Варианте Б.

- Вариант А. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов и фиксируют в конце периода экспозиции.

- Вариант Б. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов. Среду с веществом удаляют и замещают свежей средой. Клетки фиксируют через дополнительный промежуток времени 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов.

4.3.7. Первичные клетки и клеточные линии обрабатывают сходным способом, что и лимфоциты, за исключением того, что нет необходимости стимуляции их ФГА и обрабатывать через 44-48 часов. Клетки, кроме лимфоцитов, следует обрабатывать в таком режиме, чтобы во время окончания обработки клетки еще находились в логарифмической фазе роста.

Клеточные линии без ЦХ

4.3.8. Клетки следует обрабатывать 3-6 часов в присутствии и отсутствии S9. Среду с веществом удаляют и замещают свежей средой, а клетки фиксируют через промежуток времени, соотвествующий 1,5-2,0 нормальным клеточным циклам.

4.3.9. Если начальные тесты с коротким (3-6 часов) периодом обработки показали отрицательный или сомнительный результат, используют протокол с длительной экспозицией без S9. Подходят 2 варианта обработки. Оба варианта одинаково приемлемы.

- Вариант А. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов и фиксируют в конце периода экспозиции.

- Вариант Б. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в течение 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов. Среду с веществом удаляют и замещают свежей средой. Клетки фиксируют через дополнительный промежуток времени 1,5-2,0 нормальных клеточных циклов.

4.3.10. В монослое митотические клетки (идентифицируются как шарообразные образования и отделяющиеся от поверхности) могут появляться в конце 3-6-часовой обработки. Так как эти митотические клетки легко отделяются, их можно потерять при удалении среды, содержащей исследуемое вещество. Следует тщательно собрать их при отмывании культуры и вернуть в культуру, чтобы избежать потерь клеток, находящихся в митозе, которые ко времени фиксации являются клетками риска для микроядер.

Число культур

4.3.11. Следует использовать по две культуры для каждой концентрации исследуемого вещества, для контроля с растворителем/разбавителем и негативного контроля. Когда предшествующие данные лаборатории показывают минимальные вариации между двумя культурами, можно использовать в опыте одну культуру. При использовании в опыте одной культуры рекомендуется увеличить число анализируемых концентраций.

Фиксация клеток и приготовление препаратов

4.3.12. Каждую культуру фиксируют отдельно. Приготовление препаратов может включать гипотоническую обработку. Однако этот этап не обязателен, если достигается адекватный разброс клеток. Можно использовать различные методики приготовления препаратов, которые позволяют получать препараты высокого качества для анализа. Должна сохраняться цитоплазма клеток, чтобы определять микроядра и (при методе блока цитокинеза) реально идентифицировать двуядерные клетки.

4.3.13. Можно использовать различные методы окраски препаратов, такие как Гимза или специфические к ДНК флуоресцентные красители. Использование специфичных к ДНК красителей (например, акридинового оранжевого или Hoechst 33258 плюс пиронин-Y) может убрать ряд артефактов, связанных с применением красителей, не специфичных к ДНК. Антикинетохорные антитела, FISH с панцентромерными ДНК зондами или in situ мечение панцентромера-специфическими праймерами, в сочетании с соответствующими красителями могут быть использованы для идентификации содержания (хромосома/фрагменты хромосомы) микроядер, если интересует информация по механизму их формирования. Возможно использование других методов дифференцировки между кластогенами и анеугенами, если показана их эффективность.

Микроскопический анализ

4.3.14. Перед микроскопическим анализом все препараты, включая варианты с растворителем/разбавителем и контроли, должны быть независимо зашифрованы. Альтернативно шифруют пробы при анализе валидизированными системами проточной цитометрии или анализа изображения.

4.3.15. В культурах с ЦХ для оценки частоты микроядер следует анализировать минимум 2 000 двуядерных клеток на концентрацию (минимум 1 000 двуядерных клеток на культуру при постановке двух культур на концентрацию). В опытах с одной культурой следует анализировать минимум 2 000 двуядерных клеток на концентрацию. Если на каждую концентрацию учитывается существенно меньше, чем 1000 двуядерных клеток на культуру, или менее 2 000 при постановке одной культуры, и если не выявлено значимого повышения частоты микроядер, опыт должен быть повторен, используя больше клеток для анализа или менее токсичные концентрации. Не следует учитывать клетки неправильной формы или с двумя ядрами, значительно различающимися в размерах. Не следует путать двуядерные клетки с плохо разбросанными многоядерными клетками. Клетки, содержащие более чем два ядра, не должны анализироваться на микроядра, так как исходная (спонтанная) частота микроядер в этих клетках может быть выше. Возможен подсчет одноядерных клеток, если показано, что исследуемое вещество влияет на активность ЦХ.

4.3.16. В опытах с клеточными линиями без ЦХ микроядра анализируют минимум в 2 000 клетках на концентрацию (минимум 1 000 клеток на культуру при постановке двух культур на концентрацию). В опытах с постановкой одной культуры на концентрацию анализируют минимум 2 000 клеток на культуру.

4.3.17. При использовании ЦХ следует определять CBPI или RI для оценки клеточной пролиферации (см. формулы п. 5.3), анализируя минимум 500 клеток на культуру. При воздействии в отсутствии ЦХВ, следует получить данные, что клетки, которые анализируют, прошли деление (как это показано в пп. 4.2.7-4.2.10).

Критерии приемлемости

4.3.18. Описанные в данном руководстве лабораторные правила использования МТ показывают его возможность реально и точно выявлять вещества с известной анеугенной и кластогенной активностью в условиях присутствия и отсутствия метаболической активации, а также известные негативные вещества, используемые в качестве контрольных соединений. Когда имеются данные о возможности корректно выполнять данный тест, лаборатория должна показать, что анализируемые на микроядра клетки прошли одно клеточное деление, если тест проводится без использования ЦХ.

4.3.19. Вещества, представленные в табл. 6.8.16.1, рекомендуется использовать в качестве контрольных соединений. Могут быть проведены замена или дополнение, если известна активность этих веществ, если у них сходный механизм действия и если они относятся к веществам, которые будут тестированы, используя МТ. Обоснование может включать валидационное исследование, включающее широкий спектр веществ, или сфокусированное на сужение спектра, основанное на химическом классе исследованного вещества или изученном механизме нарушений.

4.3.20. Контроль с растворителем/разбавителем и контроль без обработки должны давать воспроизводимо низкий и постоянный уровень частоты микроядер (типично 5-25 микроядер на 1 000 клеток для клеточных типов, указанных в п. 4.1.1). Другие типы клеток могут иметь разные уровни ответов, которые следует определить, когда обосновывается возможность использования их в МТ. Данные контролей позитивного, негативного и с растворителем следует использовать для установления пределов колебаний исторического контроля. Эти оценки необходимо использовать при решении вопроса об адекватности соответствующих негативных/позитивных контролей в эксперименте.

4.3.21. Если предполагаются минимальные изменения протокола эксперимента (например, методики автоматического анализа, использование нового типа клеток), то если их эффективность показана до модификации протокола, они могут считаться приемлемыми для использования. Демонстрация эффективности включает показ того, что главные механизмы, хромосомные разрывы и отставания и потери могут быть определены, и что соответствующие позитивные и негативные результаты могут быть получены для тестируемого класса отдельных веществ или широкого ряда веществ.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Если используется методика цитокинетического блока, то для оценки индукции микроядер используется только частота двуядерных клеток с микроядрами (независимо от числа микроядер на клетку). Учет числа клеток с одним, двумя и более микроядрами может дать полезную информацию, но не обязателен.

5.1.2. Параллельно следует проводить оценку цитотоксичности и/или цитостатичности во всех обработанных и контрольных с растворителем/разбавителем культурах [58]. Необходимо рассчитать CBPI или RI для всех обработанных и контрольных культур, как меру задержки клеточного цикла при использовании метода блока цитокинеза. В отсутствии ЦХ следует использовать RPD или RICC или PI (см. формулы п. 5.3).

5.1.3. Данные приводят по отдельным культурам. Дополнительно все данные следует объединить (суммировать) в табличной форме.

5.1.4. Вещества, которые индуцируют микроядра в МТ, индуцируют хромосомные разрывы, потери хромосом или комбинацию этих событий. Дальнейший анализ с применением анти-кинетохорных антител, специфических центромерных зондов in situ или других методов может использоваться для установления механизма индукции микроядер вследствие кластогенного и/или анеугенного эффектов.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.5. Нет требований по дополнительному тестированию для верификации четко положительного или отрицательного ответа. Противоречивые результаты следует прояснить, проводя дополнительный анализ 1 000 клеток из всех культур, чтобы тестирование оставалось "слепым". Если это не разрешает ситуацию, следует провести дальнейшее тестирование. В последующих экспериментах следует модифицировать параметры исследования, расширяя или сужая колебания условий. Параметры исследования, которые могут быть модифицированы, включают диапазон изучаемых концентраций, время обработки и фиксации клеток и/или условия метаболической активации.

5.1.6. Существует ряд критериев для определения положительного результата: зависимость эффекта от концентрации или воспроизводимое повышение частоты мутаций. На первом месте должна быть биологическая обоснованность результатов. Рассмотрение того, находится ли оценка в пределах или за пределами колебаний исторического контроля, может дать информацию по оценке биологической значимости ответа. Соответствующие статистические методы дополнительно могут быть использованы при оценке результатов. Однако при оценке зависимости доза-эффект статистическая обработка необходима. Следует принимать во внимание воспроизводимость и исторические данные.

5.1.7. Хотя в большинстве исследований получают четкие положительные или отрицательные результаты, в редких случаях данные не позволяют сделать заключение об активности вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными несмотря на то, что эксперименты несколько раз повторены.

5.1.8. Положительные результаты в МТ показывают, что вещество индуцирует хромосомные разрывы и потери хромосом в культивируемых клетках млекопитающих. Отрицательные результаты показывают, что при данных условиях исследуемое вещество не индуцирует хромосомные разрывы и/или отставание или потери хромосом в культивируемых клетках млекопитающих.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер СAS;

- физическая природа и чистота;

- физико-химические параметры, имеющие значимость для данного исследования;

- взаимодействие исследуемого вещества с растворителем/разбавителем или с культуральной средой.

Растворитель/разбавитель:

- обоснование выбора растворителя/разбавителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе/разбавителе.

Клетки:

- тип и источник клеток;

- пригодность используемого типа клеток;

- отсутствие микоплазмы, если оценивали;

- информация о продолжительности клеточного цикла, времени удвоения или пролиферативный индекс;

- при работе с лимфоцитами: пол, возраст и число доноров крови;

- при работе с лимфоцитами: использовали цельную кровь или выделенные лимфоциты;

- число пассажей, если используются;

- методы поддержания клеточных культур, если используются;

- модальное число хромосом;

- нормальное (негативный контроль) время клеточного цикла.

Условия эксперимента:

- вещество, применяемое для блока цитокинеза (например, ЦХ), его концентрация и длительность экспозиции в культуре;

- обоснование выбора концентраций и числа клеточных культур, включающее данные по цитотоксичности и ограничения по растворимости, если имеются;

- состав среды, концентрация ;

- концентрации исследуемого вещества;

- концентрации (и/или объем) растворителя и количество добавленного исследуемого вещества;

- температура и время инкубации;

- длительность обработки культуры;

- время после обработки до фиксации;

- клеточная плотность при посеве, если применяли;

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости;

- позитивные и негативные контроли;

- методы приготовления препаратов и методика окраски;

- критерии учета микроядер;

- число проанализированных клеток;

- методы оценки цитотоксичности;

- любая дополнительная информация в отношении цитотоксичности;

- критерии учета результата как положительный, отрицательный или противоречивый (сомнительный);

- методы статистической обработки;

- методы для характеристики содержания в микроядре целых хромосом или фрагментов хромосомы, такие, как использование антител к кинетохору.

Результаты:

- оценка цитотоксичности, например, CBPI или RI при использовании методов с блоком цитокинеза, RICC, RPD или PI, когда блок цитокинеза не используется, другие признаки, если имеются, такие, как клеточное слияние (конфлюентность, апоптоз, подсчет метафаз, частота двуядерных клеток);

- признаки преципитации;

- данные величины рН и осмотической концентрации во время обработки исследуемым веществом, если определяли;

- определение приемлемости клеток для анализа;

- распределение одно-, двух- и многоядерных клеток при применении метода блока цитокинеза, если проводили;

- число клеток с микроядрами, приведенное отдельно для каждой обработанной и контрольной культуры, и отдельно выделенное в двуядерных или моноядерных клетках, если применяли;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- данные негативного (растворитель/разбавитель) и позитивного контроля (концентрации и растворитель);

- исторические данные по негативному (растворитель/разбавитель) и позитивному контролям с указанием пределов колебаний, среднего и стандартного отклонения и доверительных интервалов (95%);

- статистический анализ, значения Р.

Обсуждение результатов.

Заключение.

5.3. Формулы анализа цитотоксичности

При использовании ЦХ оценка цитотоксичности основана на Индексе пролиферации при цитокинетическом-блоке (Cytokinesis-Block Proliferation Index (CBPI)) и индексе репликации (Replicative Index (RI)). CBPI показывает среднее число клеточных циклов на клетку в течение периода экспозиции ЦХ. Он может быть использован для подсчета клеточной пролиферации. RI показывает относительное число ядер в обработанной культуре по сравнению с контрольной культурой и может использоваться при расчете % цитостатичности:

Таким образом, при CBPI = 1 (все клетки с одним ядром) - эквивалент цитостатичности у 100% клеток.

Цитостатичность = 100 - RI

,

где Т - культура с введением исследуемого вещества; К - контрольная культура с растворителем.

Таким образом, RI 53% означает, что по сравнению с числом клеток, которые делятся, образуя двуядерные и многоядерные клетки в контрольной культуре, только 53% от этого числа делятся в обработанной культуре, т.е цитостатичность в 47%.

Эксперименты без использования ЦХ. Оценку цитотоксичности рекомендуется представлять в виде показателей относительного увеличения количества клеток (Relative Increase in Cell Count) (RICC) или относительного удвоения популяции (Relative Population Doubling) (RPD). Оба показателя принимают во внимание долю делящихся клеток в популяции.

, где

Таким образом, RICC или RPD 53% показывает 47% цитотоксичности/цитостатич- ности.

Используя индекс пролиферации (Proliferatin Index) (PI), цитотоксичность может быть рассчитана путем подсчета числа клонов, состоящих из 1 клетки (с11), 2 клеток (с12), 3-4 клеток (с14) и 5-8 клеток (c18)

PI используется как реальный параметр цитотоксичности для клеточных линий, культивируемых in situ в отсутствии ЦХ [25, 26, 27, 28].