Приложение 6.7.7. Исследование репродуктивной токсичности на двух поколениях

Приложение 6.7.7

Исследование репродуктивной токсичности на двух поколениях

Идентичен международному документу OECD TG N 416 "Two-Generation Reproduction Toxicity Study" (ОЭСР Руководство N 416 "Исследование репродуктивной токсичности на двух поколениях"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о репродуктивной токсичности химических веществ и продукции на их основе на двух поколениях лабораторных животных и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с СГС по данному виду воздействия.

2. Общие положения

2.1. Исследование влияния токсичности химических веществ и продукции на их основе на репродуктивную функцию лабораторных животных на двух поколениях обеспечивает получение информации об их влиянии на целостность и состояние мужской и женской репродуктивных систем, в том числе на функцию гонад, эстральный цикл, поведение во время спаривания, зачатие, беременность, роды, лактацию и отлучение от материнского питания, а также рост и развитие потомства.

2.2. Метод позволяет дать предварительную оценку токсического действия исследуемых веществ на эмбриональное и постэмбриональное развитие, а также на такие показатели, как неонатальные заболевания, смертность, поведение и тератогенез, и может служить руководством для последующих исследований.

2.3. До проведения эксперимента необходимо рассмотреть всю доступную об исследуемом веществе информацию. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro; токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация необходима для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

3. Принцип метода

3.1. Исследуемое вещество вводится с пищей, питьевой водой или через желудочный зонд в установленных дозах нескольким группам животных: самцов и самок. При необходимости допустимы другие пути введения вещества (например, через кожу или ингаляционно). Пероральный путь введения является предпочтительным.

3.2. Самцам доза вводится на протяжении развития и, по меньшей мере, одного полного сперматогенного цикла (около 56 дней у мышей и 70 дней у крыс) с целью выявить любое неблагоприятное воздействие на сперматогенез.

3.3. Самкам материнского поколения (Р) доза вводится в период роста и в течение нескольких полных эстральных циклов с целью выявления любых неблагоприятных воздействий исследуемого вещества на астральный цикл.

3.4. Исследуемое вещество вводят животным обоего пола на протяжении периода спаривания, а затем только самкам в течение периода беременности и кормления с целью выявления любых неблагоприятных воздействий исследуемого вещества на поведение во время спаривания, зачатия, беременности, родов и лактации.

3.5. После отлучения от материнского питания вещество продолжают вводить потомству во время его роста, во взрослом возрасте, при спаривании, рождении поколения вплоть до отлучения от материнского питания с целью выявления любых неблагоприятных воздействий исследуемого вещества на рост и развитие потомства, а также неонатальные заболевания, смертность, поведение и тератогенез.

3.6. Исследования в соответствии с процедурой проводят у всех животных на наличие признаков токсического действия исследуемого вещества на целостность и функциональное состояние мужской и женской репродуктивной систем, а также на рост и развитие потомства.

4. Описание метода

4.1. Подготовка

4.1.1. Животные, ранее не подвергавшиеся экспериментальным процедурам (в возрасте от 5 до 9 недель), проходят подготовку к исследованию (содержание в лабораторных клетках по отдельности или небольшими группами одного пола в соответствующих условиях и специальном кормлении) в течение не менее пяти дней до начала исследования. Перед тем как приступить к проведению исследования подопытные животные должны быть охарактеризованы по виду, линии, источнику, полу, весу и/или возрасту. Должны быть известны особи одного помета во избежание спаривания братьев и сестер. Животные должны быть произвольно отобраны для контрольных и опытных групп (рекомендуется выборка по массе тела).

4.1.2. Каждому животному присваивается идентификационный номер:

- для поколения Р до начала введения исследуемого вещества;

- для поколения (для выбранных для спаривания животных) при отлучении их от материнского питания.

4.1.3. Записи, указывающие происхождение помета, должны быть сохранены для всех выбранных животных потомства .

4.2. Условия проведения

4.2.1. Подопытные животные.

Крысы являются предпочтительным видом для тестирования. Если используются другие виды животных, то необходимо дать обоснование и внести соответствующие изменения.

Линии с низкой плодовитостью или с известным высоким уровнем заболеваемости, или наличием пороков развития не должны использоваться. В начале исследования изменение массы животных должно быть минимальным и не превышать 20% от среднего веса особей обоего пола.

В исследованиях должны быть использованы здоровые молодые животные. Каждая экспериментальная и контрольная группы должны содержать не менее 20 самцов и 20 самок, чтобы получить не менее 20 беременных самок, близких к родам или рожающих.

Примечание: Для веществ, введение которых вызывает нежелательные эффекты (например, бесплодие, чрезмерную токсичность при высоких дозах), это не всегда возможно. Целью является производство достаточного количества беременных самок и потомства для возможности значимой оценки потенциала вещества в отношении влияния на фертильность, беременность, материнское поведение животных поколения Р, а также рост и развитие потомства линии в период от зачатия до зрелости и развитие их потомства до отнятия от материнского питания. Таким образом, отказ от достижения желаемого числа беременных животных [20] не делает исследование недействительным и его следует оценивать в каждом конкретном случае на индивидуальной основе.

Температура в экспериментальной комнате для животных не должна превышать . Относительная влажность воздуха должна быть не менее 30% и предпочтительно не более 70%, даже при влажной уборке комнаты влажность должна быть 50-60%. Освещение должно быть искусственным, с последовательным чередованием: 12 часов света и 12 часов темноты. Для кормления может быть использован обычный лабораторный рацион с неограниченным количеством питьевой воды. Выбор рациона может влиять на необходимость обеспечения подходящей примеси для введения испытуемого вещества.

4.2.2. Уровень вводимых доз.

Исследуются, как минимум, три уровня доз тестируемого вещества, которые распределяются по диапазону токсических воздействий. Интервал между дозами от двух до четырех раз является оптимальным для установления зависимости доза-эффект и добавление четвертой группы животных для испытания предпочтительнее использовать через очень большие интервалы (например, более чем в 10 раз) между дозами. Уровни доз должны быть выбраны с учетом данных по токсичности, особенно с учетом результатов повторных исследований доз. Любая доступная информация о метаболизме и кинетике тестируемого соединения или связанных с ним материалов, также должна быть рассмотрена. Кроме того, эта информация будет также полезна в выборе режима дозирования.

Примечание: В тестах при введении вещества с пищей интервал доз должен быть не более 3 раз.

Самый высокий уровень дозы, если только действие не ограничено физико-химическими свойствами испытываемого вещества или его биологическим воздействием, должен вызывать у родителей-животных (Р) токсичность, но не гибель или тяжелые страдания.

Примечание: В случае неожиданной смерти животных в родительской (Р) группе при коэффициенте смертности на уровне или менее 10%, испытание считается приемлемым.

Последовательность снижения дозы должна продемонстрировать зависимость эффекта от дозы, но не достигать подпорогового уровня (NOAEL) или доз вблизи предела обнаружения, что позволит определить оптимальную (среднюю) дозу.

При необходимости исследуемое вещество растворяют/суспендируют в соответствующем растворителе. Для растворителей, кроме воды, токсические характеристики должны быть известны. Кроме того, должна быть определена стабильность исследуемого вещества в растворителе. Контрольная группа должна получить растворитель в наибольшем объеме. Необходимо учитывать следующие характеристики растворителя и других добавок: влияние на всасывание, распределение, метаболизм или стабильность исследуемого вещества; воздействие на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсичные свойства, а также воздействовать на свойства пищи, потребление воды или питательный статус животных.

Примечание: Рекомендуется, по возможности, использование водного раствора/суспензии рассматривать в первую очередь, с последующим рассмотрением эмульсии в масле (например, в кукурузном масле), а затем возможные растворения в других растворителях.

Примечание: Если испытываемое вещество вводится с пищей и вызывает уменьшение потребления рациона питания или его утилизацию, использование спаренных контрольных групп может быть признано необходимым. Результаты исследований по контролю, направленные на оценку эффекта снижения потребления пищи на репродуктивные параметры, могут одновременно сравниваться со спаренной контрольной группой.

4.2.3. Исследование предельной (наивысшей) дозы.

В случае низкой токсичности тестируемого вещества (не менее 1 000 мг/кг массы тела/день) и если при пероральном введении с пищей или водой не наблюдается токсических эффектов в деятельности репродуктивной системы, то дальнейшие исследования с этим уровнем дозы могут быть признаны необязательными.

Тест на максимальную концентрацию применяется исключительно в тех случаях, когда воздействие на человека указывает на необходимость более высокого уровня пероральной дозы, которая будет использована. Для других способов введения (ингаляционный или кожный), учитывая физико-химические свойства исследуемого вещества, такие как растворимость, необходимо исследование максимальной концентрации.

4.2.4. Процедура введения.

Животным необходимо вводить дозы исследуемого вещества на протяжении 7 дней в неделю.

Способ введения исследуемого вещества должен быть аналогичным для животных в экспериментальных и контрольной группах в течение соответствующего периода эксперимента. При тестировании объем вещества должен быть сведен к минимуму путем изменения концентрации для обеспечения постоянного объема при всех уровнях доз. При введении исследуемого вещества с помощью желудочного зонда объем жидкости не должен превышать 1 мл/100 г массы тела (0,4 мл на 100 г веса тела является максимальным для кукурузного масла), за исключением водных растворов, где 2 мл на 100 г веса тела могут быть использованы в одно время. Исключение составляют раздражающие или коррозионно-активные вещества, которые усугубляют эффект при увеличении концентрации.

Примечание: При зондовом варианте введения детеныши, как правило, получают исследуемое вещество только косвенно, через молоко, прямое дозирование начинается для них при отлучении от материнского питания. В исследованиях, когда тестируемое вещество вводят через пищу или питьевую воду, детеныши будут дополнительно получать его напрямую, когда они начинают есть сами в течение последней недели периода лактации.

Для веществ, которые вводят через пищу или питьевую воду, важно убедиться в том, что используемые количества исследуемого вещества не нарушают нормальное питание или водный баланс экспериментальных животных.

При введении исследуемого вещества через пищу, возможно либо постоянное его введение в рацион в определенной концентрации (промилле), либо, как альтернативу, использовать постоянное соотношение дозы и веса тела животного, при этом метод расчета должен быть указан.

Если вещество вводится через желудочный зонд, то дозу следует вводить ежедневно в одно и то же время и корректировать, по крайней мере, каждую неделю, чтобы поддерживать постоянный уровень соотношения дозы и массы тела животного. Информацию, касающуюся плацентарного распределения, следует учитывать при способе введения вещества через зонд при расчете дозы в зависимости от веса.

4.2.5. Процедура испытания.

Ежедневное введение тестируемого вещества самцам и самкам родительского поколения (Р) начинают в возрасте от 5 до 9 недель.

Ежедневная дозировка самцам и самкам поколения начинается при отлучении их от материнского питания; следует иметь в виду, что в случаях, когда испытуемое вещество вводится через пищу или питьевую воду, непосредственное воздействие исследуемого вещества для поколения может произойти уже в период лактации.

Для обоих поколений (Р и ) введение вещества должно быть продолжено в течение, по крайней мере, не менее 10 недель до начала периода спаривания. Введение вещества животным обоих полов продолжают в течение 2-х недель периода спаривания.

Самкам поколения Р дозировку продолжают в течение всей беременности и до завершения периода кормления потомства .

Дозы для каждого животного, как правило, рассчитываются исходя из последних результатов индивидуального взвешивания, особенно при расчете дозы в течение последнего триместра беременности.

Введение вещества самцам и самкам поколений Р и необходимо продолжать до завершения исследования. Все животные поколений Р и и взрослые (самцы и самки) должны быть гуманно декапитированы, когда они больше не нужны для исследования репродуктивных эффектов. Животные потомства , не отобранные для спаривания, и все животные потомства после отлучения от материнского питания должны быть гуманно декапитированы.

Примечание: Самцы должны быть декапитированы и осмотрены, если они больше не нужны для оценки репродуктивных эффектов.

4.2.6. Процедуры спаривания.

Процедура спаривания должна проводиться в клетках, подходящих для этой цели. После доказательства совокупления индивидуальное содержание оплодотворенных животных является предпочтительным, но содержание небольшими группами также приемлемо. Животные должны быть отделены друг от друга за один или два дня до родов.

4.2.6.1. Родительское (Р) спаривание.

В исследованиях на репродуктивную токсичность используется спаривание в соотношении 1:1 (один самец к одной самке) или 1:2 (один самец к двум самкам).

При спаривании в соотношении 1:1 самку необходимо поместить с одним самцом до наступления беременности на две недели. Каждое утро самок осматривают на наличие спермы или вагинальной пробки. Нулевым днем беременности считается день появления вагинальной пробки или спермы. В случае неудачного спаривания необходимо дополнительное спаривание с самцами или самками, доказавшими свою способность оплодотворять и оплодотворяться. Спаривания братьев и сестер следует избегать.

4.2.6.2. Спаривание поколения .

Для спаривания поколения , по крайней мере один самец и одна самка должны быть выбраны из каждого помета для спаривания с другими детенышами того же уровня дозы, но из другого помета, для получения поколения . Потомство не должно быть повязано, пока они не достигли полной половой зрелости.

Выбор детенышей из каждого помета должен быть случайным, когда нет значительного различия в массе тела или во внешнем виде между детенышами одного помета. В случае выраженных различий выбираются лучшие представители каждого помета.

Примечание: С практической точки зрения это лучше всего делать на основе массы тела, но выбор может быть более удобным на основе внешнего вида.

Пары без потомства должны быть исследованы для определения очевидной причины бесплодия. Это может включать в себя такие процедуры, как дополнительные возможности спаривания с другими проверенными самцами или самками, микроскопическое исследование репродуктивных органов и изучение циклов течки или сперматогенеза.

4.2.6.3. Второе спаривание.

В случаях изменения размера помета или сомнительного эффекта первого спаривания, связанных с введением вещества, рекомендуется взрослых особей поколений Р или заменить на других, для получения второго помета - на производителей противоположного пола с доказанными функциями.

Если производство второго помета считается необходимым в любой генерации, животные должны быть заменены примерно через неделю после отлучения от материнского питания последнего помета.

4.2.6.4. Размер помета.

Животным обеспечивается возможность полноценных родов, кормления и воспитания потомства до отлучения от материнского питания. Стандартизация размеров приплода не является обязательным. При необходимости стандартизации метод должен быть подробно описан.

4.2.7. Наблюдения.

Наблюдение за общим состоянием животных необходимо проводить ежедневно и в случае дозирования зондом следует принимать во внимание ожидаемый пиковый период эффекта после приема препарата.

Поведенческие изменения, признаки трудных или длительных родов, а также все признаки токсичности должны быть зарегистрированы.

Дополнительный, более тщательный осмотр каждого животного должен осуществляться, по крайней мере, еженедельно, и это удобно выполнять при взвешивании животного два раза в день, а при необходимости, в выходные дни - один раз в день, все животные должны быть под наблюдением для выявления заболеваемости и смертности.

4.2.7.1. Вес тела, потребление продуктов питания и воды.

Родительские животные (Р и ) взвешиваются (данные регистрируются) в первый день дозирования и минимум раз в неделю после этого. Родители - самки (Р и ) взвешиваются в период беременности, на 0, 7, 14 и 20 или 21 дни, в период лактации в те же дни, при взвешивании помета и в день забоя животных.

Во время спаривания и в период беременности потребление продуктов питания измеряется еженедельно. Потребление воды также должно быть измерено, как минимум, еженедельно, если исследуемое вещество вводится в воду.

4.2.7.2. Цикл течки.

Длительность цикла течки и нормальность ее протекания оцениваются у Р и самок с помощью влагалищных мазков до спаривания и, по возможности, во время спаривания, пока доказательства спаривания не обнаруживаются. При получении клеток влагалища и шейки матки необходимо избегать нарушения слизистой оболочки, а затем индукции ложной беременности.

4.2.7.3. Параметры сперматогенеза.

После окончания исследования регистрируется вес яичек (семенник, testis) и придатков яичек (придатки семенник, epididymis) всех самцов Р и , также необходимо зафиксировать по одному органу каждого вида для дальнейшего гистопатологического исследования (см. п. 6.2.9).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "п. 4.2.9"

У десяти самцов из каждой группы потомств Р и яички и придатки яичек используются для подсчета гомогенизационно-устойчивых сперматид и объема спермы в хвосте придатков яичек.

Из этой же подгруппы самцов сперма из хвоста придатков яичек или из семявыносящих протоков отбирается для исследования подвижности и морфологии сперматозоидов.

Примечание: Если наблюдаются эффекты, связанные с введением вещества, или, когда есть данные других исследований о возможном воздействии на сперматогенез этого вещества, то оценка спермы должна быть проведена у всех самцов в каждой доза-группе, в противном случае расчет может быть ограничен контролем и высокой дозой Р и самцов.

Объем спермы в хвосте придатков яичек рассчитывается по концентрации и объему сперматозоидов в суспензии, использованной для полной качественной оценки. Также необходимо оценить количество сперматозоидов, восстановившихся после измельчения и/или гомогенизации оставшейся ткани хвоста придатков яичек. Расчет должен быть выполнен для выбранной подгруппы самцов всех доза-групп немедленно после эвтаназии животных, если не сделаны видео или цифровые записи, или если образцы замораживают для последующего анализа. В этих случаях контрольная и группа с высокой дозой анализируются в первую очередь.

Примечание: В случае отсутствия эффектов, связанных с введением вещества (например, влияние на количество сперматозоидов, подвижность или морфологию) другие доза-группы можно не анализировать. В случае, когда отмечены эффекты в высоких доза-группах, то низшие доза-группы также оцениваются.

Подвижность сперматозоидов в придатке яичка (или семявыносящем протоке) оценивается в соответствии с принятой методикой или с помощью видео немедленно после эвтаназии. Сперма должна быть получена при сведении к минимуму повреждений и разбавлена для анализа подвижности с использованием приемлемых методов. Процент подвижных сперматозоидов определяется либо субъективно, либо объективно. Когда анализ подвижности выполняется компьютеризированно, то результат определения подвижности сперматозоидов зависит от определяемых пользователем пороговых значений для средней скорости и прямолинейности или линейного индекса.

Примечание: Если образцы являются видеозаписями или изображениями, записанными другим способом во время вскрытия, то последующий анализ может быть выполнен только в группах контроля и высоких доз для самцов Р и ; если наблюдаются связанные с введением вещества эффекты, то в этом случае группы с низкими дозами должны быть оценены. В отсутствие видео- или цифровых изображений все животные во всех группах дозирования должны быть вскрыты и проанализированы.

Морфологическую оценку образцов спермы придатка яичка (или семявыносящих протоков) проводят путем приготовления фиксированных, влажных препаратов из спермы, содержащих как минимум, 200 сперматозоидов в образце и классифицируют их как нормальные или аномальные.

Примеры морфологических аномалий спермы могут включать в себя слияние, изолированные и уродливые головы и/или хвосты.

Примечание: Оценка должна быть выполнена в выбранных подгруппах самцов всех доза-групп либо сразу после декапитации животных, либо, при наличии видео- или цифровых записей, в более позднее время. Фиксированные мазки также можно исследовать в более позднее время. В этих случаях группы контроля и с высокой дозой могут быть проанализированы в первую очередь. Если не выявлены связанные с тестированием эффекты (например, влияние на морфологию сперматозоидов), то другие доза-группы можно не анализировать. При проявлении эффектов в группах, связанных с введением высоких доз, необходимо провести исследования в группах с низкими дозами.

Если любой из перечисленных выше параметров оценки спермы уже был рассмотрен в рамках системного изучения токсичности в течение, как минимум 90 дней, то они не обязательно должны быть повторены в данных исследованиях. Рекомендуется, однако, сохранить образцы или цифровые записи исследования спермы поколения Р с тем, чтобы при необходимости провести их оценку.

4.2.7.4. Потомство.

Каждый помет должен быть осмотрен как можно скорее после родов (лактация, день 0), чтобы установить количество и пол детенышей: число мертворожденных и родившихся живыми с наличием выраженных аномалий.

Детеныши, найденные мертвыми в день 0, если они не мацерированы, проверяются на предмет возможных дефектов и причин смерти и фиксируются для хранения.

Живые детеныши взвешиваются индивидуально при рождении (лактация, день 0) или на 1-ый день и регулярно после этого, например, в 4, 7, 14 и 21 дни лактации. Физические или поведенческие аномалии, наблюдаемые у матерей или в потомстве, регистрируются.

Физическое развитие потомства регистрируется, в основном, как прирост массы тела. Другие физические параметры (например, открытие ушей и глаз, прорезывание зубов, рост шерсти) дают дополнительную информацию и оцениваются с учетом данных о половом созревании (например, возраст и масса тела при вагинальном раскрытии или отделение головки пениса от крайней плоти).

У потомства до и/или после отлучения от материнского питания особенно связанные с половым созреванием рекомендуется проводить функциональные исследования (например, двигательная активность, сенсорные функции, рефлекторный онтогенез), если они не включены в отдельные тесты.

Возраст вагинального раскрытия и препуциального отделения должны быть определены для детенышей, выбранных для спаривания. Анально-генитальные расстояния измеряют в 0-ой день после родов у детенышей, если в генерации наблюдаются изменения в соотношении полов или сроках полового созревания.

Функциональные наблюдения не проводят в группах, в которых выявлены явные признаки отрицательного воздействия (например, значительное снижение веса и т.д.). Если сделаны функциональные исследования, то их не повторяют для детенышей, отобранных для спаривания.

4.2.8. Вскрытие животных.

На момент прекращения испытания (или в случае смерти в течение исследования) все животные с внешними отклонениями или клиническими признаками, а также, по крайней мере, один случайно выбранный детеныш/пол/помет от обоих и поколений, должны быть исследованы макроскопически для выявления структурных аномалий или патологических изменений. Особое внимание уделяется органам репродуктивной системы. Животные после эвтаназии и мертвые детеныши, если они не мацерированы, исследуются на наличие возможных дефектов и/или установление причины смерти и фиксируются для дальнейшего хранения.

Матки всех первородящих самок должны быть исследованы на наличие и количество мест имплантации методом, согласующимся с гистопатологической оценкой.

На момент окончания испытания взвешиваются тела животных и следующие органы всех Р и родительских животных (парные органы должны быть взвешены по отдельности):

- матка, яичники;

- яички и придатки яичек (весь и хвост);

- предстательная железа;

- семенные пузырьки с коагулирующими железами и их жидкостями (как единое целое);

- мозг, печень, почки, селезенка, гипофиз, щитовидная железа, надпочечники и известные органы-мишени.

Окончательный вес тела определяется для детенышей и , которые выбраны для вскрытия, и следующие органы от одного случайно выбранного детеныша/пол/помет: мозг, селезенка и тимус.

Результаты вскрытия и взвешивания органов должны оцениваться в контексте с наблюдениями, сделанными в других повторных исследованиях доз, когда это возможно.

4.2.9. Гистопатологические исследования.

4.2.9.1. Гистопатологические исследования родительских животных (Р и ).

Следующие органы и ткани родительских животных (Р и ) или репрезентативно выбранные, должны быть зафиксированы и храниться в подходящей среде для гистопатологического исследования:

- влагалище, матка с шейкой матки и яичниками (сохраненные в соответствующем фиксаторе);

- одно яичко (сохраненное в растворе Буэна или подобном фиксаторе), один придаток яичка, семенные пузырьки, простата и coagulating gland (расположенная на передней части семенного пузырька);

- ранее определенные органы-мишени из всех Р и животных, выбранных для спаривания.

Полное гистопатологическое исследование сохраненных органов и тканей, перечисленных выше, выполняется для высоких доз и контрольных групп животных поколений Р и , выбранных для спаривания.

Органы, в которых наблюдаются связанные с введением вещества изменения, также должны быть исследованы в группах низких и средних доз для получения дополнительных данных для определения NOAEL. Все серьезные поражения, такие как атрофия или опухоли, должны быть проверены.

Примечание: Дополнительно проводятся гистопатологические исследования репродуктивных органов животных в группах низких и средних доз, подозреваемых в снижении фертильности, например, те, которым не удалось спариться, забеременеть, произвести потомство или родить здоровое потомство, либо для которых цикличность течки, либо количество, подвижность или морфологии спермы отличаются от контроля.

Детальное гистопатологическое исследование яичка (например, с использованием фиксатора Буэна, заливка парафином и поперечной секцией толщиной 4-5 ) проводят для определения сохранности сперматид, отсутствующих слоев или типов зародышевых клеток, наличия гигантских многодетных клеток или отторжения клеток спермы в просвет. Исследование ранее зафиксированных придатков яичек проводится путем продольного сечения, и включает в себя оценку головы, тела и хвоста. Придатки яичка оцениваются на лейкоцитарную инфильтрацию, изменение превалирования типов клеток, присутствие аберрантных клеток и фагоцитов в сперме. PAS и окрашивание гематоксилином могут быть использованы для изучения мужских половых органов.

Постлактационный яичник должен содержать первичные растущие фолликулы, а также большое количество желтых тел лактации. В гистопатологических исследованиях определяют качественное уменьшение первичной популяции фолликулов. Количественная оценка первичных фолликулов проводится для самок ; выборка числа животных, выбор отдела яичника и его размера должны быть статистически пригодны для используемой процедуры оценки. Исследования включают в себя подсчет числа первичных фолликулов, которые могут быть объединены с малыми растущими фолликулами для сравнения опытных и контрольных яичников.

4.2.9.2. Гистопатологические исследования детенышей.

Ткани и органы-мишени всех детенышей с внешними серьезными аномалиями или клиническими проявлениями, а также, по меньшей мере, одного случайно выбранного детеныша/пола/помета поколений и , который не был выбран для спаривания (см. п. 4.2.8), должны быть выделены и сохранены в подходящей среде для гистопатологического исследования. Полная гистопатологическая характеристика сохраненных тканей должна быть выполнена с особым вниманием к органам репродуктивной системы.

5. Данные

5.1. Результаты должны быть представлены в табличной форме индивидуально для каждой тестовой группы и для каждого поколения. В них указывается:

- количество животных в начале теста;

- количество умерших и животных, подвергшихся эвтаназии во время испытания;

- время любой смерти или эвтаназии;

- количество фертильных животных;

- число беременных самок;

- количество животных с признаками токсичности;

- описание наблюдаемых признаков токсичности, в том числе время начала, продолжительность и тяжесть;

- типы гистопатологических изменений;

- соответствующие данные о помете.

Численные результаты обрабатываются соответствующими общепринятыми статистическими методами, которые выбираются как часть описания исследования. Статистическая модель доза-эффект может быть полезна для анализа результатов.

Отчет должен содержать полные сведения о методах анализа и использованной компьютерной программе, так, чтобы независимый эксперт/статистик мог повторно восстановить и оценить анализ.

5.2. Оценка результатов репродуктивной токсичности двух поколений.

5.2.1. Полученные результаты исследования репродуктивной токсичности двух поколений должны быть оценены с точки зрения наблюдаемых эффектов при вскрытии и микроскопическом исследовании.

5.2.2. При оценке результатов испытаний проводится выявление зависимости или отсутствия таковой между дозой исследуемого вещества и наличием или отсутствием эффекта и тяжести нарушений, в том числе серьезных поражений, выявленных в органах-мишенях, нарушением фертильности, клиническими аномалиями, нарушением репродуктивности и производства потомства, изменением массы тела, воздействием на смертность и любые другие токсические проявления.

Проведенное должным образом изучение репродуктивной токсичности должно обеспечить удовлетворительную оценку уровня отсутствия эффекта и понимание неблагоприятного воздействия на воспроизводство, роды, лактацию, постнатальное развитие, включая рост и половое развитие.

Примечание: При оценке результатов репродуктивной токсичности двух поколений принимаются во внимание физико-химические свойства исследуемого вещества и, если это возможно, данные токсикокинетики при их наличии.

6. Отчет

Отчет испытаний должен включать следующую информацию:

Данные об изучаемом веществе:

- физическая природа и, в случае необходимости, физико-химические свойства;

- химическая идентификация;

- чистота (примеси) испытуемого вещества.

Характеристики растворимости (в случае необходимости):

- обоснование выбора растворителя, если используется не вода.

Животные:

- используемые вид/штамм;

- количество, возраст и пол животных;

- источник, лабораторные условия, питание, используемые материалы и др.;

- вес каждого животного в начале теста.

Условия испытаний:

- обоснование подбора уровня доз;

- детальная формула испытуемого вещества, подготовка рациона питания, расчетные концентрации;

- стабильность и однородность смеси;

- условия введения тестируемого вещества;

- концентрация (ppm) испытуемого вещества при переходе из пищи/питьевой воды для достижения дозы (мг/кг массы тела/день), если это возможно;

- детализация качества пищевого рациона и воды.

Результаты:

- потребление продуктов питания, воды и, если это возможно, пищевой эффективности (увеличение массы тела на грамм продуктов питания) и оценка расхода материалов для животных и Р, за исключением периода спаривания и, по крайней мере, последнего триместра лактации;

- данные по абсорбции (при наличии);

- данные веса тел животных Р и , выбранных для спаривания;

- данные веса помета и детенышей;

- вес тела животных после эвтаназии, а также абсолютные и относительные данные результатов взвешивания органов родительских животных;

- характер, тяжесть и продолжительность клинических проявлений (в независимости от того, обратимы они или нет);

- время смерти животных во время исследования, а также животных, сохраненных до окончания тестирования;

- данные о токсических реакциях по признаку пола и дозы, включая показатели спаривания, фертильности, беременности, рождения, жизнеспособности и лактации; в отчете следует указать количество особей, используемых в вычислении этих показателей;

- токсичное или иное влияние на репродукцию, потомство, постнатальный рост и т.д.;

- результаты вскрытия;

- подробное описание всех гистопатологических исследований;

- количество самок Р и генераций с нормальным и продолжительным циклами;

- общее количество сперматозоидов в хвосте придатка яичка, % подвижных сперматозоидов, % морфологически нормальных сперматозоидов и % сперматозоидов с каждой выявленной патологией;

- время спаривания, включая количество дней до спаривания;

- длительность беременности;

- количество имплантаций, желтых тел, размер приплода;

- число родившихся живыми и погибших после имплантации;

- количество детенышей с видимыми грубыми аномалиями, также необходимо указать, если они есть, количество недоразвитых детенышей;

- данные о физических размерах детенышей и другие данные постнатального развития; оценка физических параметров должна быть обоснована;

- данные функциональных исследований детенышей и взрослых, когда это необходимо;

- статистическая обработка результатов, где это необходимо.

7. Интерпретация результатов

Выводы, в том числе NOAEL значения для матери и потомства

Исследование репродуктивной токсичности двух поколений предоставляет информацию о последствиях многократного воздействия вещества на всех этапах репродуктивного цикла. В частности, исследование предоставляет информацию о репродуктивных параметрах, данные о развитии, росте и выживании потомства.

Результаты исследования должны быть интерпретированы в сочетании с результатами субхронического пренатального развития, токсикокинетики и других имеющихся данных исследований. Результаты данного исследования могут часто использоваться в оценке необходимости проведения дополнительных испытаний химических веществ.

Экстраполяция результатов исследования на человека носит ограниченный характер. Наилучшим образом они могут быть использованы для получения информации об уровнях доз, не вызывающих негативные эффекты, и допустимые уровни воздействия на человека.