Приложение 6.8.11. Генетическая токсикология: Повреждения ДНК и репаративный/внеплановый синтез ДНК в клетках млекопитающих in vitro

Приложение 6.8.11

Генетическая токсикология: Повреждения ДНК и репаративный/внеплановый синтез ДНК в клетках млекопитающих in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 482 "Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair/Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro" (ОЭСР Руководство N 482 "Генетическая токсикология: Повреждения ДНК и репаративный/внеплановый синтез ДНК в клетках млекопитающих in vitro"). Принят 23 октября 1986 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Метод внепланового синтеза ДНК (ВСД) в клетках млекопитающих in vitro описывает методики использования первичных клеток млекопитающих или перевиваемых клеточных линий для выявления репаративного синтеза ДНК. В методе внепланового синтеза ДНК выявляется включение радиактивно меченного нуклеотида , используя авторадиографическую методику или жидкостно-сцинтилляционный (ЖСС) подсчет. ВСД можно также анализировать в тест-системах in vivo.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Метод ВСД измеряет репаративный синтез ДНК после вырезания (эксцизии) части цепи ДНК, содержащей место, где находится повреждение, вызванное химическим или физическим агентом. Метод основан на включении в ДНК клеток млекопитающих, которое происходит не в период S-фазы клеточного цикла. Включение в ДНК обработанных клеток может быть выявлено авторадиографически или жидкостным сцинтилляционным счетчиком (ЖСС). Клетки млекопитающих в культуре, кроме первичных культур гепатоцитов крыс, обрабатывают исследуемым соединением в присутствии или отсутствии экзогенной системы метаболической активации.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Исследуемые соединения

4.1.1. В эксперименте исследуемое вещество и контрольные соединения растворяют в культуральной среде или в соответствующем растворителе, и затем разводят в культуральной среде. Конечная концентрация растворителя не должна влиять на клеточную выживаемость.

Клетки и условия культивирования

4.1.2. В тесте используют первичные культуры (например, гепатоциты крыс), лимфоциты человека или перевиваемые линии клеток (например, диплоидные фибробласты человека). Для культивирования необходимо использовать адекватные среды, концентрацию , температуру и влажность. Перевиваемые клеточные линии необходимо периодически проверять на контаминацию микоплазмой.

4.2. Условия испытания

Число культур

4.2.1. На каждую экспериментальную точку следует ставить по крайней мере две культуры при радиоавтографическом методе учета. При учете ВСД методом ЖСС, шесть клеточных культур или меньше, если научно обосновано, необходимо ставить на каждую экспериментальную точку.

Контроли

4.2.2. В каждый эксперимент должны быть включены положительные и отрицательные контроли в вариантах с присутствием или отсутствием метаболической активации.

4.2.3. Примеры соединений, которые можно использовать как положительный контроль для гепатоцитов крыс: 7,12-диметилбензантрацен (7,12-ДМБА) и 2-ацетиламинофлуорен (2-ААФ). Для перевиваемых клеточных линий 4-нитрохинолин-N-оксид (4-НХО) можно использовать как положительный контроль для вариантов без метаболической активации при обоих методах учета ВСД. Как положительный контроль для вариантов с метаболической активацией может быть использован N-диметилнитрозоамин.

Концентрации соединений

4.2.4. Следует тестировать несколько концентраций исследуемого вещества в адекватном диапазоне. Наивысшая концентрация должна вызывать некоторые признаки цитотоксического эффекта. Плохо растворимые в воде соединения следует тестировать в пределах их растворимости, используя соответствующие методики. Для легко растворимых в воде соединений, нетоксичных соединений наивысшая концентрация определяется в каждом конкретном случае.

Метаболическая активация

4.2.5. За исключением первичной культуры гепатоцитов крыс, которая обладает способностью активировать непрямые мутагены, клетки обрабатывают исследуемым веществом как в присутствии, так и в отсутствии соответствующей системы метаболической активации.

4.3. Проведение эксперимента

Подготовка культур

4.3.1. Перевиваемые клеточные линии получают из сток культур (трипсинизация или встряхивание), пересевают в культуральную посуду при соответствующей плотности и инкубируют при 37°С.

4.3.2. Краткосрочные культуры гепатоцитов млекопитающих ставят, давая возможность свежедиссоциированным гепатоцитам прикрепиться к поверхности для роста.

4.3.3. Культуры лимфоцитов человека ставят по общепринятой методике.

Обработка культур исследуемым веществом

- Первичные гепатоциты млекопитающих

4.3.4. Свежевыделенные гепатоциты инкубируют с исследуемым веществом в среде, содержащей , необходимый промежуток времени. По окончании обработки среду удаляют, клетки отмывают, фиксируют и сушат. Стекла покрывают авторадиографической эмульсией (может быть использована фотопленка), выдерживают определенное время, высушивают, проявляют, окрашивают и проводят подсчет.

4.3.5. При другой методике в добавление к авторадиографии используют параллельно инкорпорацию БДУ и последующее центрифугирование в градиенте плотности. Это позволяет разделить реплицирующуюся ДНК от ВСД ДНК до сцинтилляционного подсчета.

- Перевиваемые линии клеток и лимфоциты при использовании техники радиоавтографии

4.3.6. Культуры клеток обрабатывают тестируемым веществом соответствующий интервал времени. Этот интервал определяется природой вещества, активностью системы метаболической активации и типом клеток. Чтобы выявить пик ВСД, добавляют либо непосредственно с исследуемым веществом, либо через несколько минут после экспозиции вещества. На выбор методики влияет возможность взаимодействия исследуемого вещества с .

4.3.7. Для того, чтобы отличать ВСД от нормальной полуконсервативной репликации ДНК последнюю следует убрать или подавить используя, например, аргинин-дефицитную среду, низкое содержание сыворотки или добавление гидроксиметилмочевины в культуральную среду.

- Перевиваемые линии клеток и лимфоциты, при использовании ЖСС анализа ВСД.

4.3.8. Перед обработкой исследуемым веществом следует блокировать вхождение клеток в S-фазу, как описано выше. Клетки экспонируют с исследуемым веществом так же, как и при радиоавтографической методике. В конце периода инкубации необходимо экстрагировать ДНК клеток и определить общее содержание ДНК и степень включения метки.

4.3.9. Следует отметить, что при работе с лимфоцитами человека при обоих техниках выявления ВСД для нестимулированных культур не требуется подавления нормальной полуконсервативной репликации ДНК.

Анализ

Авторадиографическая методика

4.3.10. При анализе ВСД в клетках культуры, ядра в S-фазе не учитывают. Стекла следует шифровать до анализа. Следует анализировать минимум 50 клеток на культуру. Ряд отдельных случайно выбранных полей анализируют на каждом стекле. Число инкорпораций в цитоплазму следует определять, используя соответствующую методику.

4.3.11. Результаты необходимо подтвердить в независимом эксперименте.

ЖСС методика.

4.3.12. Шесть клеточных культур (или меньше, если научно обосновано) необходимо ставить на каждую концентрацию и контроль.

4.3.13. Результаты необходимо подтвердить в независимом эксперименте.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в табличной форме.

Авторадиографическая методика.

5.1.2. Степень включения в цитоплазму и число гранул над клеточным ядром следует приводить отдельно.

5.1.3. Следует приводить среднюю, медиану и моду для описания распределения степени включения в цитоплазму и числа гранул на ядро. Полезную информацию может дать процент клеток с ВСД.

5.1.4. Данные следует обработать соответствующими статистическими методами.

ЖСС методика.

5.1.5. При методике ЖСС включение радиоактивной метки представляется как число распадов в минуту на микрограмм ДНК. Средняя величина этого показателя и стандартное отклонение используются для описания распределения включения.

5.1.6. Данные следует обработать соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.7. Существуют разные критерии определения положительного результата. Один из них - статистически значимое возрастание включения метки (выраженное либо в гранулах на ядро, либо как число распадов в минуту на микрограмм ДНК) с увеличением дозы. Другой критерий основан на получении воспроизводимого и статистически значимого положительного ответа, по крайней мере, на одной экспериментальной точке.

5.1.8. Соединение, которое не показало ни статистически значимого возрастания включения метки (выраженное либо в гранулах на ядро, либо как число распадов в минуту на микрограмм ДНК) с увеличением дозы, ни статистически значимого воспроизводимого положительного ответа в любой из испытанных концентраций, считается не активным в данной тест-системе.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию:

- использованные клетки, плотность и номер пассажа на момент обработки, число клеточных культур;

- методики, используемые при ведении культур клеток, включая среду, температуру и концентрацию ;

- исследуемое вещество, растворитель, изученные в опыте концентрации и обоснование их выбора;

- детальное описание системы метаболической активации;

- схему обработки;

- положительные и отрицательные контроли;

- использованные методики блокирования вступления клеток в S-фазу;

- авторадиографическую методику;

- методику, использованную для экстракции ДНК и определения общего количества ДНК при ЖСС;

- зависимость доза-эффект;

- статистическая оценка результатов;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.