Приложение 6.5.2.1. Стандарты соответствия для оценки кожной сенсибилизации в предложенном или модифицированном тесте LLNA

Приложение 6.5.2.1

Стандарты
соответствия для оценки кожной сенсибилизации в предложенном или модифицированном тесте LLNA

1. Введение

1.1. Цель Стандартов Соответствия (СС) состоит в том, чтобы проинформировать пользователей о той основе, на которой новые экспериментальные методы, запатентованные (то есть защищенные авторским правом, имеющие официально зарегистрированную торговую марку, зарегистрированные) и незапатентованные, могут быть определены как имеющие достаточную точность и надежность для специфических целей эксперимента. Данные СС, основанные на ратифицированных и принятых методах испытания, могут использоваться для оценки надежности и точности других аналогичных экспериментальных методов (в разговорной речи именуемых методами "Я тоже"), базирующихся на аналогичных научных принципах и оценивающих или прогнозирующих тот же биологический или токсический эффект.

1.2. До принятия модифицированных методов испытания (то есть предложенных потенциальных усовершенствований к одобренному методу испытания) следует провести оценку эффективности предложенных изменений и степени, в которой эти изменения влияют на другие компоненты процесса валидации. В зависимости от количества и природы предложенных изменений, полученных с использованием данных и соответствующей сопроводительной документации, измененный метод или проходит полный процесс валидации, как все новые тесты, или, если это будет признано возможным, только сокращенную процедуру оценки надежности и правомерности с использованием утвержденных СС.

1.3. Сходные или модифицированные методы тестирования, предложенные для использования в рамках данного документа, должны быть подвергнуты оценке для выявления их надежности и точности с использованием стандартных химических соединений, соответствующих полному диапазону шкалы баллов LLNA. Во избежание необоснованного использования животных настоятельно рекомендуется, чтобы разработчики модели вошли в контакт с OECD до начала валидационного исследования в соответствии со СС и руководством, представленными в данном документе.

1.4. Данные СС основаны на гармонизации документов "Координационных комитетов по утверждению альтернативных методов (CCVAM)" - USA-ICCVAM, EC-ECVAM и Japanese-JaCVAM - для оценки валидности аналогичных или модифицированных вариантов LLNA. СС состоят из описания основных компонентов метода тестирования, компонентов метода тестирования стандартных эталонов (позитивных контролей), списка рекомендованных эталонов и стандартов для оценки степени точности и надежности, которые предлагаемый усовершенствованный метод должен обеспечить или превысить.

2. Основные компоненты метода испытания

2.1. Чтобы гарантировать, что аналогичный или модифицированный метод LLNA является функционально и механистически соответствующим данному методу LLNA и оценивает тот же самый биологический эффект, в протокол метода должны быть включены следующие компоненты:

- тестируемое вещество должно быть нанесено накожно на оба уха мыши;

- пролиферацию лимфоцитов следует оценивать в лимфоузлах, дренирующих участок аппликации тестируемого вещества;

- пролиферацию лимфоцитов следует оценивать в течение фазы индукции кожной сенсибилизации;

- самая высокая доза тестируемого вещества должна быть максимальной концентрации, еще не вызывающей проявлений системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи мышей; для позитивных контролей самая высокая доза должна давать значение ИС не менее 3 (см. предлагаемые эталонные соединения в таблице) и при этом не вызывать симптомов системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи мышей;

- в каждое исследование следует включать параллельно контроль на растворитель и, где предусмотрено, параллельный ПК;

- следует использовать группу, как минимум, из четырех животных на каждую дозу;

- можно отбирать биологический материал как от каждой мыши отдельно, так и объединяя его по группам.

Если нет соответствия по любому из этих критериев, данный СС не может быть использован для валидации аналогичного или модифицированного метода испытания.

3. Минимальный список веществ-эталонов

3.1. Гармонизация СС USA-ICCVAM, EC-ECVAM и Japanes-JaCVAM позволяет создать список из 18 основных веществ-эталонов, которые рекомендовано использовать, и четырех дополнительных опциональных эталонов (веществ, которые давали ложноположительные или ложноотрицательные эффекты в LLNA при сравнении с результатами, полученными на людях и морских свинках (см. МР 406), и тем самым давали равноценную или лучшую результативность, чем LLNA). Критерии для выбора этих веществ нижеследующие:

- в список эталонов включены вещества, неоднократно тестировавшиеся на потенциальную возможность вызывать состояние кожной сенсибилизации в диапазоне эффектов, которые LLNA способен оценить или предсказать;

- все вещества имели точно определенные химические структуры;

- для этих веществ были доступны данные LLNA, полученные в опытах на морских свинках (см. МР 406), и (где возможно) данные, полученные на людях;

- все эти вещества можно было приобрести в виде коммерческих препаратов.

Рекомендованные эталоны перечислены в таблице. Исследования с использованием предложенных эталонов следует проводить с растворителями, перечисленными в таблице. В случае недоступности перечисленных веществ можно использовать другие вещества, удовлетворяющие вышеупомянутым критериям отбора, с соответствующим обоснованием.

4. Определенные стандарты надежности и точности

4.1. Точность аналогичного или модифицированного теста LLNA должна быть не ниже точности исходного метода LLNA, причем сравнение должно проводиться по результатам тестирования полной минимальной базы из 18 эталонных веществ. Новый или модифицированный метод LLNA должен дать правильную классификацию этих эталонов, основанную на заключениях "да/нет". Однако новый или модифицированный метод LLNA может правильно классифицировать не все основные эталоны, которые следует использовать. Если, например, один из слабых сенсибилизаторов был неправильно классифицирован, необходимо представить разумное объяснение неправильной классификации данного эталона и соответствующие дополнительные данные (например, результаты испытаний, давших правильную классификацию других веществ, сходных с неверно классифицированным эталоном по физическим, химическим и сенсибилизирующим свойствам), чтобы показать равноценность сравниваемых методов. При таких обстоятельствах валидация нового или модифицированного метода LLNA должна будет проводиться в каждом конкретном случае заново.

Таблица

Рекомендованные вещества - эталоны для стандартизации соответствия LLNA

N	Вещество*(1)	CAS N	Форма	Раств.*(2)	ЕС3%*(3)	N*(4)	0,5х-2,0х ЕС3	Актуальный диапазон ЕС3	LLNA vs. м/св.	LLNA vs. человек
1	5-хлор-2-метил-4-изотиазолин-3-он (ХМИ)/2-метил-4-изотиазолин-3-он (МИ)*(5)	26172-55-4/ 2682-20-4	Ж	ДМФ	0,009	1	0,0045-0,018	NC	+/+	+/+
2	ДНХБ	97-00-7	С	АОМ	0,049	15	0,025-0,099	0,02-0,094	+/+	+/+
3	4-фенилендиамин	106-50-3	С	АОМ	0,11	6	0,055-0,22	0,07-0,16	+/+	+/+
4	хлорид кобальта	7646-79-9	С	ДМСО	0,6	2	0,3-1,2	0,4-0,8	+/+	+/+
5	изоэйгенол	97-54-1	Ж	АОМ	1,5	47	0,77-3,1	0,5-3,3	+/+	+/+
6	2-меркаптобензотиазол	149-30-4	С	ДМФ	1,7	1	0,85-3,4	NC	+/+	+/+
7	цитраль	5392-40-5	Ж	АОМ	9,2	6	4,6-18,3	5,1-13	+/+	+/+
8	ГКА	101-86-0	Ж	АОМ	9,7	21	4,8-19,5	4,4-14,7	+/+	+/+
9	эйгенол	97-53-0	Ж	АОМ	10,1	11	5,05-20,2	4,9-15	+/+	+/+
10	фенилбензоат	93-99-2	С	АОМ	13,6	3	6,8-27,2	1,2-20	+/+	+/+
11	коричный спирт	104-54-1	С	АОМ	21	1	10,5-42	NC	+/+	+/+
12	имидазолидинилмочевина	39236-46-9	С	ДМФ	24	1	12-48	NC	+/+	+/+
13	метил метакрилат	80-62-6	Ж	АОМ	90	1	45-100	NC	+/+	+/+
14	хлорбензол	108-90-7	Ж	АОМ	25	1	NA	NA	-/-	-/*(6)
15	изопропанол	67-63-0	Ж	АОМ	50	1	NA	NA	-/-	-/+
16	молочная кислота	50-21-5	Ж	ДМСО	25	1	NA	NA	-/-	-/*(6)
17	метил салицилат	119-36-8	Ж	АОМ	20	9	NA	NA	-/-	-/-
18	салициловая кислота	69-72-7	С	АОМ	25	1	NA	NA	-/-	-/-
Опциональные стандарты для демонстрации улучшения характеристик LLNA
19	натриевая соль лау- рилсульфата	151-21-3	С	ДМФ	8,1	5	4,05-16,2	1,5-17,1	+/-	+/-
20	этиленгликоль диметакрилат	97-90-5	Ж	МЭК	28	1	14-56	NC	+/-	+/+
21	ксилол	1330-20-7	Ж	АОМ	95,8	1	47,9-100	NC	+/*(7)	+/-
22	хлорид никеля	7718-54-9	С	ДМСО	5	2	NA	NA	-/+	-/+

Сокращения: АОМ - смесь ацетона с оливковым маслом (4:1, v/v); CAS N = номер вещества по каталогу Chemical Abstracts Service; ДМФ - N,N-диметилформамид; ДМСО - диметилсульфоксид; ДНХБ - 2,4-динитрохлорбензол; ЕС3 - расчетная концентрация вещества, дающая индекс стимуляции, равный 3; м/св. - результат тестирования на морских свинках (см. МР 406); ГКА - гексил-коричный альдегид; Ж. - жидкость; LLNA - исследование реакции региональных лимфоузлов у мышей (см. МР 429); МЭК - ме- тилэтилкетон; NA - не годно в качестве стандарта, так как индекс стимуляции <3; NC - не рассчитано, так как данные получены от одного исследования; С. - сухое вещество; Раств. - растворитель.

Примечания:

*(1) Растворы тестируемого вещества должны готовиться ежедневно, если данные по стабильности не допускают возможности более длительного хранения.

*(2) Поскольку растворители потенциально способны влиять на результаты теста LLNA, следует для каждого стандартного вещества использовать рекомендованный для него растворитель.

*(3) Среднее арифметическое значение в тех случаях, когда доступен более чем один параметр ЕС3. Для веществ, не давших ожидаемого результата (то есть с индексом стимуляции <3), приводится самая высокая из проверенных концентраций.

*(4) Количество исследований LLNA, в которых были получены данные.

*(5) Коммерчески доступен как Kathon CG (CAS N 55965-84-9), который является смесью указанных компонентов ХМИ и МИ в соотношении 3:1. Относительные концентрации каждого компонента в препарате Kathon CG варьируют от 1,1 до 1,25% для ХМИ и от 0,3 до 0,45% для МИ. Неактивные компоненты - соли магния (от 21,5 до 24%) и нитрат меди (от 0,15 до 0,17%), остаток препарата на 7-77% состоит из воды. Kathon CG можно приобрести через Sigma-Aldrich или Rohm & Haas (теперь Корпорация Dow Chemical).

*(6) Предположение о том, что данное вещество не является сенсибилизирующим агентом, основано на факте отсутствия положительных результатов клинических кожных проб, данного вещества в списках стандартных аллергенов и описанных клинических случаев сенсибилизации у людей.

*(7) Данные м/св. (полученные на морских свинках) не доступны.

Внутрилабораторная воспроизводимость

Для оценки внутрилабораторной воспроизводимости новый или модифицированный метод LLNA должен быть проверен на одном из сенсибилизаторов, хорошо изученных в исходном варианте теста LLNA. Поэтому СС LLNA основаны на оценке вариабельности результатов повторных экспериментов с использованием гексил-коричного альдегида (ГКА). Для оценки внутрилабораторной надежности, необходимо определить пороговую (минимально эффективную) концентрацию ГКА (ECt) в четырех отдельных опытах с промежутком между ними, по крайней мере, в одну неделю. Уровень внутрилабораторной воспроизводимости, может считаться удовлетворительным, если в этих 4 опытах значения пороговой концентрации ГКА находятся внутри диапазона от 5 до 20%, то есть от 0,5 до двух значений средней величины ЕС3 (концентрация вещества, дающая индекс стимуляции, равный 3) для ГКА, равной 10% (см. таблицу).

Межлабораторная воспроизводимость

Межлабораторную воспроизводимость нового или модифицированного метода LLNA следует оценивать, используя два сенсибилизатора, хорошо изученных в LLNA. Данный СС LLNA основан на оценке вариабельности результатов тестирования ГКА и 2,4-динитрохлорбензола (ДНХБ) в различных лабораториях. Параметры ECt для этих двух веществ должны быть определены, по крайней мере, в трех отдельных лабораториях, по одному опыту в каждой. Для демонстрации приемлемого уровня межлабораторной воспроизводимости каждая лаборатория должна получить значения ECt от 5 до 20% для ГКА и от 0,025 до 0,1% для ДНХБ; эти диапазоны составляют, соответственно, от 0,5 до двух значений средних величин ЕС3 (концентрация вещества, дающая индекс стимуляции, равный 3) для ГКА (10%) и ДНХБ (0,05%) (см. таблицу).