Приложение 6.8.8. Генетическая токсикология: Сестринские хроматидные обмены в клетках млекопитающих in vitro

Приложение 6.8.8

Генетическая токсикология: Сестринские хроматидные обмены в клетках млекопитающих in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 479 "Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells" (ОЭСР Руководство N 479 "Генетическая токсикология: Сестринские хроматидные обмены в клетках млекопитающих in vitro"). Принят 23 октября 1986 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в тесте оценки сестринских хроматидных обменов в клетках млекопитающих in vitro. Метод оценки сестринских хроматидных обменов (СХО) - краткосрочный тест для выявления реципрокных обменов ДНК между двумя сестринскими хроматидами дуплицированной хромосомы. СХО является интеробменом продукта репликации ДНК, по-видимому, в гомологичном локусе. В процесс обмена, по всей видимости, вовлечены разрыв и воссоединение, хотя еще мало известно о его молекулярном механизме. Выявление СХО требует дифференциального окрашивания сестринских хроматид, что может быть достигнуто инкорпорацией бромдезоксиуридина (БДУ) в ДНК хромосомы в течение двух клеточных циклов. СХО можно оценивать как в тестах на млекопитающих, так и в других системах.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Клетки млекопитающих in vitro экспонируют с исследуемым веществом в присутствии или отсутствии экзогенной системы метаболической активации и культивируют в течение двух циклов репликации ДНК в среде, содержащей БДУ. Затем в культуру добавляют ингибитор веретена деления (колхицин) для аккумулирования клеток на стадии метафазы митоза (с-метафаза). Далее клетки фиксируют и готовят препараты хромосом.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Исследуемые соединения

4.1.1. Исследуемое вещество растворяют в культуральной среде или в соответствующем растворителе сразу перед введением в клетку. Конечная концентрация растворителя в культуре не должна значимо влиять на клеточную выживаемость, характеристики роста и уровень СХО.

Клетки и методика культивирования

4.1.2. Используют первичные культуры (например, лимфоциты человека) или перевиваемые линии клеток (например, клетки яичника или легких китайского хомячка). Клетки должны быть проверены на контаминацию микоплазмой. Следует проводить контроль стабильности кариотипа.

4.1.3. Следует использовать адекватную культуральную среду и условия культивирования (т.е. температуру, культуральную посуду, концентрацию и влажность).

Метаболическая активация

4.1.4. Клетки обрабатывают исследуемым веществом как в присутствии, так и в отсутствии соответствующей системы метаболической активации. Примеры такой системы: кофакторы и постмитохондриальная фракция печени грызунов, которые обработали индуцирующими ферменты соединениями, или первичная культура гепатоцитов млекопитающих.

4.2. Условия испытания

Концентрации соединений

4.2.1. Следует тестировать, по крайней мере, 3 концентрации в адекватном диапазоне. Наивысшая концентрация должна быть на уровне токсического эффекта и при этом должна позволять клеткам проходить адекватную репликацию. Для токсичных соединений наивысшая концентрация не должна снижать выживаемость больше, чем на 5-10%. Плохо растворимые в воде соединения следует тестировать в пределах их растворимости, используя соответствующие методики. Для легко растворимых в воде соединений, нетоксичных соединений наивысшая концентрация определяется в каждом конкретном случае.

Число повторов

4.2.2. На каждую экспериментальную точку следует ставить по крайней мере две культуры.

Контроли

4.2.3. В каждый эксперимент должны быть включены положительные контроли с прямо действующими мутагенами и веществами, требующими метаболическую активацию. Следует ставить контроль с растворителем. Примеры соединений, которые могут использоваться как положительный контроль:

- этилметансульфонат, митомицин С (прямодействующие мутагены);

- циклофосфамид (мутаген непрямого действия).

4.3. Проведение эксперимента

Подготовка культур

4.3.1. Перевиваемые клеточные линии получают из стоковых культур (например, путем трипсинизации или встряхивания), пересевают в культуральные флаконы до соответствующей плотности и инкубируют при 37°С. Для культур, растущих в монослое, число клеток на культуру должно подбираться так, чтобы они не вызывали нарушений ко времени фиксации. Могут использоваться клетки, растущие в суспензии. Культуры лимфоцитов периферической крови человека ставят, используя адекватные методики, и культивируют при 37°С.

Обработка культуры исследуемым веществом

4.3.2. К перевиваемым клеточным линиям на экспоненциальной стадии роста добавляют исследуемое соединение на определенный период времени. В большинстве случаев достаточно 1-2 ч. Однако продолжительность обработки может доходить до двух клеточных циклов. В некоторых случаях более эффективно проводить обработку клеток в среде без сыворотки. Клетки следует обрабатывать в присутствии или отсутствии системы метаболической активации. По окончании экспозиции клетки отмывают от вещества и культивируют два цикла репликации в присутствии БДУ. В качестве альтернативной методики клетки одновременно обрабатывают исследуемым веществом и БДУ в период двух циклов репликации.

4.3.3. Культуру лимфоцитов обрабатывают в период, когда она находится в синхронизированном состоянии.

4.3.4. Анализируют клетки, находящиеся во втором митотическом делении после начала обработки, полагая, что наиболее чувствительные стадии клеточного цикла подвергнуты воздействию вещества.

4.3.5. Все культуры, в которые добавляют БДУ, должны быть защищены от света, чтобы минимизировать фотолиз содержащей БДУ ДНК до фиксации клеток.

Фиксация клеток

4.3.6. За 1-4 ч до фиксации клеток в культуру вводят ингибитор веретена деления (колхицин). Каждую культуру фиксируют и обрабатывают отдельно для получения препаратов метафазных хромосом.

Приготовления препаратов хромосом и окраска

4.3.7. Препараты хромосом готовят по стандартной цитогенетической методике. Окраску стекол для учета СХО можно проводить разными методами (например, методом флуоресцентной окраски плюс Гимза).

Анализ

4.3.8. Обычно при учете СХО анализируют 25 хорошо разбросанных метафаз на каждую культуру. На количество анализируемых метафаз может влиять спонтанный уровень СХО в контроле. Перед анализом стекла шифруют. В лимфоцитах человека анализируют только метафазы, содержащие 46 центромер. В перевиваемых клеточных линиях анализируют метафазы, содержащие цетромеры от модального числа. Следует установить, учитывать или нет как СХО метку, проходящую центромеру. Результат необходимо подтвердить в независимом эксперименте.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в табличной форме. Число СХО, число хромосом и среднее число СХО на хромосому нужно представить отдельно для каждой метафазы для всех экспериментальных и контрольных культур.

5.1.2. Обработку данных проводят соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.3. Существуют разные критерии определения положительного результата, один из которых статистически значимое повышение среднего числа СХО на клетку с увеличением дозы. Другой критерий основан на получении воспроизводимого и статистически значимого положительного ответа, по крайней мере, на одной экспериментальной точке.

5.1.4. Соединение, которое не показало ни статистически значимого возрастания среднего числа СХО на клетку с увеличением дозы, ни статистически значимого воспроизводимого положительного ответа в любой из испытанных концентраций, считается немутагеном в данной тест-системе.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию:

- использованные клетки, методы ведения клеточной культуры;

- условия опыта: состав среды, концентрация , концентрации исследуемого вещества, используемый растворитель, температура инкубации, время воздействия, используемый ингибитор веретена деления, его концентрация и продолжительность инкубации, тип системы метаболической активации, положительные и отрицательные контроли, концентрация БДУ;

- число культур на экспериментальную точку;

- детальное описание методики приготовления препаратов;

- число проанализированных метафаз (данные приводятся отдельно для каждой культуры);

- число СХО на клетку и на хромосому (данные приводятся отдельно для каждой культуры);

- критерии учета СХО;

- обоснование выбора доз;

- зависимость эффекта от дозы, если имеется;

- статистическая оценка результатов;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.