Приложение 6.1.3. Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом "вверх-вниз"

Приложение 6.1.3

Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом "вверх-вниз"

Идентичен международному документу OECD TG N 425 "Acute Oral Toxicity - Up-and-Down-Procedure (UDP)" (ОЭСР Руководство N 425 "Острая пероральная токсичность - методика "вверх-вниз"). Принят 3 октября 2008 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию острой токсичности при внутрижелудочном поступлении химических веществ и препаратов на их основе (далее - веществ) методом "вверх-вниз" (с изменяемым объемом выборки с возможностью изменения условий испытаний).

1.2. Метод позволяет установить величину с доверительным интервалом, наблюдать за признаками токсичности, а результаты дают возможность определить категорию и классифицировать вещество в соответствии с СГС.

2. Общие положения

2.1. Концепция метода исследования "вверх-вниз" (эксперимент с изменяемым объемом выборки при изменении условий испытаний) впервые была описана Диксоном и Мудом. В 1985 г. Брюс предложил использовать методику "верх-вниз" ("UDP") для определения острой токсичности химических веществ. Существует несколько вариаций экспериментального плана "вверх и вниз" для оценки среднесмертельной дозы . Данные методические рекомендации основываются на методике Брюса, принятой Американским обществом по испытанию материалов в 1987 г. и пересмотренной в 1990 г. В 1995 г. было опубликовано исследование, сравнивающее результаты, полученные с помощью метода "вверх и вниз", стандартного исследования и метода фиксированной дозы ("FDP", Руководство ОЭСР по проведению исследований 420). После появления ранних работ Диксона и Муда были напечатаны и другие работы в биометрической и прикладной литературе, изучающие наилучшие условия применения подхода. Исходя из рекомендаций нескольких заседаний экспертов ОЭСР в 1999 г., было принято решение о своевременности дополнительного пересмотра по следующим причинам: i) было достигнуто международное соглашение о гармонизированных критических величинах для классификации химических веществ; ii) исследование с использованием одного пола (обычно самок) общепринято считается достаточным; iii) чтобы единичное исследование было обоснованным, необходимо оценивать доверительные интервалы.

2.2. Рекомендации по выбору наиболее подходящего метода испытаний острой токсичности веществ при внутрижелудочном поступлении можно найти в Руководстве ОЭСР по изучению пероральной токсичности. Это Руководство содержит и дополнительную информацию о выполнении и интерпретации методики, приведенной в настоящих методических рекомендациях.

2.3. Проведению испытания должен предшествовать анализ информации об исследуемом веществе. Такая информация включает сведения о составе и химическом строении вещества; его физико-химических свойствах; результатах токсикологических испытаний in vivo и in vitro; а также токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация нужна для подтверждения того, что испытание является необходимым для защиты здоровья человека и способствует выбору подходящей начальной дозы.

2.4. Если информация для предварительной оценки величины и наклона кривой зависимости доза-ответ отсутствует, результаты компьютерного моделирования предлагают, что наилучшие результаты будут достигнуты, если начать с примерно 175 мг/кг и использовать половину логарифмической единицы (соответствующую увеличению дозы на коэффициент 3,2) между дозами. Эту начальную дозу следует изменить, если есть вероятность, что исследуемое вещество является высокотоксичным. Половинный логарифмический интервал делает возможным более эффективное использование животных и повышает точность прогнозирования величины . Поскольку метод основан на выборе начальной дозы, важно, чтобы начальная доза находилась ниже величины (см. п. 3.3.1 и приложение 1 в отношении обсуждения последовательностей доз и начальных величин). Однако для химических веществ с большой изменчивостью (например, пологие наклоны кривой зависимости доза-ответ) может произойти отклонение в оценке летальности, и будет иметь большую статистическую погрешность, аналогичную другим методам оценки острой токсичности. Чтобы исправить это, основное исследование включает "правило остановки", соответствующее свойствам оценки, а не фиксированному количеству наблюдений за процессом испытаний (см. п. 3.3.4).

2.5. Основное исследование состоит из упорядоченной дозовой прогрессии, которые вводят животным однократно с минимальными 48-часовыми интервалами. Первое животное получает дозу, на ступень ниже уровня наиболее надежной прогнозной величины . Если животное выживает, доза для следующего животного увеличивается в 3,2 раза от начальной дозы; если оно умирает, доза для следующего животного снижается во столько же раз. За каждым животным следует внимательно наблюдать в течение до 48 часов перед принятием решения о том, вводить ли другую дозу и на каком уровне. Это решение основывается на 48-часовой схеме выживания всех животных к этому времени (см. п. 3.3.7 о выборе интервалов между дозами). "Правило остановки" используется для обеспечения минимального количества экспериментальных животных при соблюдении схемы дозирования с целью снижения эффекта неправильной начальной дозы или низкого наклона кривой зависимости доза-ответ (см. п. 3.3.6). Дозирование прекращают в случае наличия соответствия одному из критериев остановки (см. пп. 3.3.4 и 5.2.1), после чего рассчитывают и доверительный интервал, исходя из состояния всех животных во время остановки. Для большинства случаев испытание будет завершено с использованием только 4 животных после первоначального реверсирования результатов, полученных от животных. рассчитывают с использованием метода максимального правдоподобия [14] [15] (см. пп. 5.2.1 и 5.2.3). Методика расчета доверительного интервала приведена в п. 5.3.

2.6. Данный метод лучше всего применять к веществам, вызывающим смерть в течение одного или двух дней. Непрактично использовать этот метод, если можно ожидать значительно замедленную смерть (через пять дней или более).

2.7. Исследуемые вещества не должны исследовать в дозах, которые являются причиной возникновения выраженных болевых ощущений и недомоганий, оказывая разъедающее или сильно раздражающее действие. Агонизирующие животные или животные, испытывающие непереносимую боль или находящиеся в безнадежном физическом состоянии, должны быть умерщвлены гуманным способом и учтены при подведении результатов исследования так же, как и животные, погибшие во время исследования.

2.8. Для исследования химических веществ, которые, вероятно, имеют низкую токсичность, может эффективно использоваться испытание предельной дозы.

2.9. Испытание предельной дозы - это последовательное испытание, использующее максимум 5 животных. Может использоваться исследуемая доза 2 000 мг/кг или, в исключительных случаях, 5 000 мг/кг. Методики испытаний при 2 000 и 5 000 мг/кг немного различаются (см. п. 3.4.2 в отношении испытания при 2 000 мг/кг и пп. 5.4.3-5.4.5 - при 5 000 мг/кг). Выбор плана последовательного тестирования повышает статистическую точность, и этот выбор был принят также и для намеренного отказа от испытания предельной дозы для веществ с около предельной дозы, т.е. чтобы не допустить ошибку с точки зрения безопасности. Как и в любых других тестах на предельное содержание, вероятность корректной классификации падает с приближением к предельной дозе.

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "пп. 3.4.3-3.4.5"

3. Описание метода

3.1. Животные

3.1.1. Выбор вида. Наиболее предпочтительным видом грызунов является крыса, вместе с тем возможно использование и других видов грызунов. В основном используются женские особи, так как они являются более чувствительными к воздействию токсикантов. Однако если токсикологические и токсикокинетические данные для структурно родственных веществ показывают, что мужские особи являются более чувствительными, следует использовать животных данного пола. Проведение испытания с использованием мужских особей должно быть научно обосновано.

В эксперименте должны быть использованы здоровые молодые половозрелые особи обычно используемых лабораторных линий. Женские особи не должны быть беременными или рожавшими. Каждое животное на момент начала эксперимента должно быть в возрасте от 8 до 12 недель, а его масса должна составлять от среднего веса всех других животных.

3.1.2. Условия содержания и кормления. Температура в лабораторной комнате должна составлять . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки комнаты; оптимальное значение - 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Животных можно содержать группами в клетках в зависимости от дозы, однако количество животных в клетке не должно препятствовать наблюдению за каждым из них.

3.1.3. Подготовка животных. Животные должны быть разделены на группы методом случайной выборки, помечены и содержаться в клетках не менее 5 дней до начала введения тестируемого вещества, что позволит им адаптироваться к лабораторным условиям. Как и в других схемах последовательных испытаний, следует внимательно убедиться, что имеются животные соответствующего размера и возрастного диапазона для всего испытания.

3.2. Процедура испытаний

3.2.1. Подготовка доз. Изучаемое вещество вводят фиксированными объемами во всем исследуемом диапазоне доз путем изменения концентрации вещества. Однако вещества в жидкой препаративной форме целесообразно исследовать без разбавления, т.е. в фиксированной концентрации, это может быть важно для последующей оценки риска использования вещества. Максимальный однократный объем вводимой жидкости зависит от размера подопытного животного и не должен превышать 1 мл/100 г массы тела. В случае с водными растворами вещества объем может составить 2 мл/100 г массы тела. В любом случае максимальный объем вводимой дозы не должен быть превышен. Рекомендуется использовать водные растворы/суспензии/эмульсии химических продуктов; для продуктов, нерастворимых в воде, - другие растворители, отдавая предпочтение растворам/суспензиям/эмульсиям на масляной основе (растительные масла). В случае использования разбавителя (растворителя), отличного от воды, его токсикологические характеристики должны быть известны. Растворы должны быть приготовлены незадолго до введения с учетом стабильности изучаемого вещества в период исследования.

3.2.2. Введение доз. Исследуемый препарат вводят однократно через зонд: желудочную трубку или интубационную канюлю. Если введение однократной дозы невозможно, доза может быть введена частями в период, не превышающий 24 часа.

Перед введением дозы животных необходимо ограничить в пище (т.е. крыс не кормить с вечера перед введением дозы, но поить; мышей не кормить три-четыре часа перед введением дозы, но поить). После голодания необходимо взвесить животных, затем ввести испытываемое вещество. После введения препарата крыс не кормить три-четыре часа, мышей - один-два часа. Если дозу вводят порционно, в зависимости от периода введения дозы животным может потребоваться корм или питье.

3.3. Основное исследование

3.3.1. Первому животному вводят дозу, на ступень ниже наиболее надежной прогнозной величины . Если животное выживает, второе животное получает более высокую дозу. Если первое животное умирает или выглядит умирающим, второе животное получает более низкую дозу. Коэффициент прогрессии (регрессии) дозы следует выбирать как антилогарифм от 1/(предполагаемый наклон кривой зависимости доза-ответ), и он должен оставаться постоянным на протяжении всего испытания (прогрессия 3,2 соответствует наклону 2).

3.3.2. Если отсутствует информация о наклоне, используют коэффициент, равный 3,2. При использовании стандартного коэффициента прогрессии дозы выбираются из последовательности 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 2000 (или 1,75, 5,5, 17,5, 55, 175, 550, 1750, 5000 при специальном требовании регулятивных органов).

3.3.3. Если отсутствуют данные о летальности вещества, дозирование следует начинать с 175 мг/кг. В большинстве случаев эта доза является сублетальной и поэтому служит для снижения уровня боли и страданий. Если ожидается, что переносимость химического вещества высоко вариабельная (т.е. ожидается, что наклон кривой зависимости доза-ответ составит менее 2), следует рассмотреть повышение коэффициента прогрессии дозы выше стандартного до начала испытания. Аналогично, если известно, что исследуемые вещества характеризуются крутыми наклонами, следует выбирать коэффициенты прогрессии дозы меньше стандартных (Приложение 1 включает таблицу прогрессий дозы для большого количества наклонов в диапазоне от 1 до 8 с начальной дозой 175 мг/кг).

3.3.4. Введение доз продолжают в соответствии с ответами всех животных, полученными через фиксированные интервалы времени (например, 48-часовые). Испытание останавливают, если обнаруживают соответствие хотя бы одному из следующих критериев:

(a) более 3 животных, последовательно введенных в эксперимент, выживают при введении максимальной дозы;

(b) происходит 5 реверсирований у любых 6 последовательно испытуемых животных;

(c) как минимум 4 животных проявляют реверсирование после первого наблюдавшегося, и соответствующие отношения правдоподобия превышают критическое значение (см. приложение 2). Расчеты выполняют после каждого введения дозы, после четвертого животного и первого реверсирования.

3.3.5. При широком разнообразии прогнозных значений и наклонов условие правила остановки (с) будет выполняться при наличии от 4 до 6 животных после реверсирования. В некоторых случаях для веществ с пологими кривыми зависимости доза-ответ могут понадобиться дополнительные животные (до пятнадцати).

3.3.6. Если критерии остановки соблюдены, следует рассчитывать на основании результатов, полученных на животных при остановке испытания, используя метод, описанный в п. 5.2.5.

3.3.7. Умирающих животных, животных, умерщвленных по причинам гуманности, учитывают так же, как и животных, которые умерли в ходе испытания. Если животное неожиданно умирает в конце исследования, но имеются другие выжившие при этой или более высокой дозе, следует прекратить вводить вещество и наблюдать за всеми животными, чтобы определить, умрут ли другие животные во время аналогичного периода наблюдения. Если вначале выжившие впоследствии также умирают, и, кажется, что все уровни доз превышают , лучше всего вновь начать испытание, начиная с дозы, ниже не менее чем на две ступени самой низкой из ранее испытанных, вызвавших летальный эффект, увеличивая период наблюдения, так как методика является наиболее точной, если начальная доза ниже . Если последующее животное выживает при введении той дозы, при которой предыдущее животное умерло, или выше, нет необходимости изменять прогрессию дозы, так как информация от животного, которое сейчас умерло, будет включена в расчеты как смерть при более низкой дозе, чем у последующих выживших, что в результате снизит расчетную величину .

3.4. Испытание предельной дозы

3.4.1. Испытание предельной дозы используют, главным образом, в ситуациях, когда экспериментатор имеет информацию, указывающую на то, что исследуемый материал, вероятно, является нетоксичным, т.е. имеет токсичность ниже регулятивных предельных доз. Информация о токсичности исследуемого материала может быть получена из сведений об аналогичных исследуемых составах или аналогичных исследуемых смесях или продуктах с учетом идентичности и процентного содержания компонентов, чья токсичность известна. В ситуациях, когда имеется мало информации о токсичности, или такая информация отсутствует, или если ожидается, что исследуемый материал является токсичным, следует выполнить основное испытание.

3.4.2. Испытание предельной дозы при 2 000 мг/кг. Одному животному вводят исследуемую дозу. Если животное умирает, проводят основное испытание, чтобы определить . Если животное выживает, дозу вводят еще четырем животным последовательно, чтобы всего было исследовано пять животных. Однако если умирает трое животных, испытание на предельное содержание прекращают и выполняют основное испытание. считают большей 2 000 мг/кг, если выживают три или более животных. Если животное неожиданно умирает в конце исследования, а остальные выживают, следует прекратить вводить вещество и наблюдать за всеми животными, умрут ли другие животные во время аналогичного периода наблюдения (см. п. 2.7 по поводу окончания наблюдения). Поздние смерти следует учитывать, как и другие смерти. Результаты оценивают следующим образом (О = выживание, X = смерть):

- меньше 2 000 мг/кг, если умирают три или более животных.

О ХО XX

О ОХ XX

О XX ОХ

О XX X

Если умирает третье животное, проводят основное испытание.

- Исследуют пять животных. больше 2 000 мг/кг, если выживают три или более животных.

О ОО ОО

О ОО ХО

О ОО ОХ

О ОО XX

О ХО ХО

О ХО ОО/Х

О ОХ ХО

О ОХ ОО/Х

О XX ОО

3.4.3. Испытание предельной дозы при 5 000 мг/кг. В исключительных случаях и только если это обосновывается специальной необходимостью регулятивных органов, может быть исследована доза 5 000 мг/кг (см. приложение 3). По причине гуманного отношения к животным испытания в диапазонах Категории 5 СГС (2 000-5 000 мг/кг) не одобряются и проводятся, только если имеется высокая вероятностью того, что результаты такого испытания имеют прямую связь с охраной здоровья человека или животных или окружающей среды.

3.4.4. Одному животному вводят исследуемую дозу. Если животное умирает, проводят основное испытание, чтобы определить . Если животное выживает, дозу вводят еще двум животным. Если оба животных выживают, считают больше 5 000 мг/кг и испытание прекращают (т.е. до завершения 14-дневного наблюдения без введения дозы другим животным).

3.4.5. Если одно или двое животных умирают, дозу вводят еще двум животным, по одному. Если животное неожиданно умирает в конце исследования, а остальные выживают, следует прекратить вводить вещество и наблюдать за другими животными, умрут ли они во время аналогичного периода наблюдения (см. п. 2.7 по поводу окончания наблюдения). Поздние смерти следует учитывать, как и другие смерти. Результаты оценивают следующим образом (О = выживание, X = смерть):

- меньше 5 000 мг/кг, если умирают три или более животных.

О ХО XX

О ОХ XX

О XX ОХ

О XX X

- больше 5 000 мг/кг, если выживают три или более животных

О ОО

О ХО ХО

О ХО О

О ОХ ХО

О ОX О

О XX ОО

4. Наблюдения

4.1. За животными наблюдают индивидуально, не реже одного раза в течение первых 30 минут после введения дозы, периодически в течение первых 24 часов (особое внимание уделяют в течение первых 4 часов) и впоследствии ежедневно, всего в течение 14 дней, за исключением случаев, когда их следует удалить из эксперимента и гуманно умертвить по причинам заботы о животных, или если они мертвы. Однако длительность наблюдения не должна быть жестко фиксированной. Ее следует определять по токсическим реакциям, времени их появления и длительности периода восстановления, и поэтому она может быть увеличена, если это считают необходимым. Время, когда появляются и исчезают симптомы токсичности, является важным, особенно если есть тенденция к задержке токсических симптомов. Все наблюдения систематически регистрируются, при этом по каждому животному ведут отдельные записи.

4.2. Дополнительные наблюдения будут необходимы, если у животных продолжаются симптомы интоксикации. Наблюдения должны включать изменения кожи, глаз и слизистых оболочек, а также респираторной, кровеносной, вегетативной и центральной нервных систем, а также соматомоторной активности и моделей поведения. Внимание должно быть направлено на наблюдение за появлением тремора, конвульсий, слюноотделения, диареи, вялости, сонливости и комы. Следует учитывать принципы и критерии, обобщенные в Руководстве по гуманным конечным точкам [13]. Животных, находящихся в предсмертном состоянии, и животных, испытывающих сильную боль или длительные признаки тяжелого недомогания, следует гуманно умертвить. Если животное умерщвляют по причинам гуманности или оно найдено мертвым, следует зарегистрировать время смерти как можно точнее.

4.3. Масса тела. Незадолго перед введением исследуемого вещества и не реже одного раза в неделю впоследствии следует определять индивидуальный вес тела животных. Следует рассчитывать и регистрировать изменения веса. В конце испытания выживших животных взвешивают и затем гуманно умерщвляют.

4.4. Патология. Всех животных (включая тех, которые умирают во время испытания или удалены из испытания по причинам гуманности) следует подвергнуть общей аутопсии. Все основные патологические изменения должны быть зарегистрированы для каждого животного. Следует провести микроскопическое исследование органов, имеющих признаки выраженной патологии, у животных, выживших в течение 24 или более часов после введения дозы, так как это может дать полезную информацию.

5. Данные и отчетность

5.1. Данные

Следует предоставлять индивидуальные данные о животных. Кроме того, все данные следует обобщать в форме таблицы, для каждой исследуемой дозы указывая количество используемых животных, количество животных, имеющих симптомы токсичности, количество животных, найденных мертвыми во время исследования или умерщвленных по причинам гуманности, индивидуальное время смерти животных, время п