Приложение 6.3.1. Изучение хронической токсичности при внутрижелудочном поступлении

Приложение 6.3.1

Изучение хронической токсичности при внутрижелудочном поступлении

Идентичен международному документу OECD TG N 452 "Chronic Toxicity Studies" (ОЭСР Руководство N 452 "Исследования хронической токсичности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD)).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения исследования хронической токсичности химических веществ и продукции на их основе (далее - веществ) при внутрижелудочном поступлении.

1.2. Исследование хронической токсичности позволяет получить информацию о возможной опасности для здоровья, вероятно, возрастающей от повторяющихся воздействий в течение большей части продолжительности жизни грызунов. Исследование направлено на выявление данных о токсическом воздействии вещества, определение органов-мишеней и выявление возможности накопления (аккумуляции). Также в ходе его определяют наивысший уровень воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), что может быть использовано для установления критерия безопасности воздействия на организм человека. Следует также подчеркнуть необходимость тщательного клинического наблюдения за животными для получения максимально возможного количества информации.

1.3. В проведении исследования хронической токсичности необходимо всегда придерживаться основополагающих принципов и соображений, изложенных в Руководстве ОЭСР N 19 [45].

1.4. Подробные правила и принципы выбора дозы для исследований хронической токсичности и канцерогенности отражены в Руководстве ОЭСР N 116. Метод выбора основной дозы зависит от первоначальных целей или задач исследования. При выборе уровня дозы должен быть достигнут баланс между риском гибели животных с одной стороны и характеристикой ответных реакций на низкие дозы и их значимостью - с другой. Это чрезвычайно важно в случае комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности.

1.5. Проведение комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности требует большего анализа в сравнении с исследованиями хронической токсичности и канцерогенности, проводимыми раздельно. Следует внимательно отнестись к принципам выбора доз при проведении комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Раздельные исследования могут являться необходимыми по определенным нормативным требованиям.

2. Общие положения

2.1. Данный метод исследования предназначен, прежде всего, для исследований, осуществляемых на грызунах. Если проведение таких исследований потребуется на особях другого вида, изложенные принципы и методы также могут быть использованы, с надлежащими изменениями, в соответствии с целями и Руководством ОЭСР N 116.

2.2. До начала проведения исследования испытательной лабораторией должна быть проанализирована вся доступная информация по исследуемому веществу и с тем, чтобы сфокусировать план исследования на более успешное тестирование возможной хронической токсичности и минимизировать использование животных. Данные, которые будут содействовать проведению исследования, включают: идентификацию, химическую структуру и физико-химические свойства исследуемого вещества; любую информацию о механизме действия; результаты любых in vitro и in vivo исследований токсичности; предполагаемое использование и вероятное воздействие на человеческий организм; доступные данные испытаний (Q)SAR и токсические свойства структурно родственных веществ; имеющиеся токсикокинетические данные (однократная доза, а также кинетика повторной дозы, при наличии) и данные, полученные из других исследований повторного воздействия. Изучение хронической токсичности может быть проведено после получения первоначальных данных по изучению токсичности повторной дозы в течение 28 и/или 90 дней. Поэтапный подход к исследованию хронической токсичности следует рассматривать как часть общей оценки возможного неблагоприятного воздействия вещества на здоровье человека.

2.3. Цели исследований хронической токсичности при внутрижелудочном поступлении, охватываемые настоящими методическими рекомендациями, включают:

- определение опасных свойств химических веществ;

- определение органов-мишеней;

- описание зависимости доза-ответ;

- определение наивысшего уровня воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект (NOAEL) или исходных данных для установления нижней 95%-й доверительной границы реперной дозы (BMD);

- прогнозирование хронической интоксикации человека при внутрижелудочном поступлении вещества;

- предоставление данных для проверки гипотез относительно механизма действия.

3. Принцип метода

3.1. Исследуемое вещество вводится ежедневно порциями нескольким группам подопытных животных в течение 12 месяцев, хотя можно также избрать более длительный или короткий периоды. Этот период был выбран в связи с тем, что он достаточен для того, чтобы стали очевидны любые проявления кумулятивной токсичности, не смешиваясь при этом с проявлениями возрастных изменений.

3.2. Отклонение от продолжительности воздействия в 12 месяцев должно быть обосновано, особенно в случае сокращения срока. Тестируемое вещество вводится перорально. План исследования может также включать одно или несколько промежуточных умерщвлений, например, через 3 и 6 месяцев. Для этого необходимо добавить дополнительные группы животных. В течение периода приема вещества животных тщательно обследуют на предмет выявления признаков интоксикации. Животные, которые умерли или были умерщвлены в ходе тестирования, подвергаются аутопсии. По окончании исследования выживших животных умерщвляют и также проводят аутопсию.

4. Описание метода

4.1. Животные

Подбор видов животных

4.1.1. Данные методические рекомендации охватывают оценку и анализ хронической токсичности вещества при внутрижелудочном введении на грызунах, хотя подобные исследования на негрызунах могут также проводиться в соответствии с данными требованиями. Выбор вида животных должен быть обоснован. План и проведение исследования хронической токсичности на видах негрызунов, когда это необходимо, должны быть основаны на принципах, содержащих в данном стандарте, а также в Руководстве ОЭСР N 409 "Изучение токсичности повторной дозы, введенной перорально в течение 90 дней негрызунам". Дополнительная информация по выбору вида и рода экспериментальных животных содержится в Руководстве ОЭСР N 116.

4.1.2. Предпочтительным видом грызунов являются крысы, хотя могут использоваться и другие виды, например, мыши. Крысы и мыши были выбраны в качестве экспериментальных моделей за их сравнительно короткую продолжительность жизни, широкое применение в фармакологических и токсикологических исследованиях, их восприимчивость к индукции новообразований и доступность этих хорошо изученных видов. Вследствие этих качеств, имеется большое количество информации об их психологии и патологии. Следует использовать молодых половозрелых взрослых животных лабораторных видов. Исследование хронической токсичности следует проводить на животных того же рода и того же происхождения, что и животные, использовавшиеся в предварительных токсикологических исследованиях небольшой продолжительности. Женские особи должны быть нерожавшими и небеременными.

Содержание и кормление

4.1.3. Животные должны находиться отдельно или содержаться в клетках небольшими группами одного пола. Отдельное проживание следует применять только, если это научно обосновано. Клетки надо размещать таким образом, чтобы свести к минимуму возможное влияние их местоположения. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не должна превышать 70% (если только не проводится уборка помещения) оптимальная влажность - 50-60%. Свет должен быть искусственным, с последовательностью: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Для кормления могут использоваться традиционные лабораторные диеты с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна отвечать всем потребностям в питании тестируемого вида. Содержание загрязняющих веществ, которые могут повлиять на результаты исследования (остатки пестицидов, стойкие органические загрязнители, фитоэстрогены, тяжелые металлы и микотоксины) должны быть по возможности минимизированы. Аналитические данные по питанию и уровню загрязняющих веществ в пище должны собираться периодически, как минимум в начале исследования и когда меняется используемая партия, и их следует включать в заключительный отчет. Должны также предоставляться аналитические данные по питьевой воде, используемой в исследовании. На выбор пищи может влиять необходимость введения примеси и удовлетворение пищевых потребностей животных, когда исследуемое вещество вводится в диетический рацион.

Подготовка животных

4.1.4. Должны использоваться здоровые животные, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях как минимум в течение 7 дней и над которыми прежде не ставились эксперименты. В случае с грызунами введение доз следует начинать как можно раньше, после отлучения от матери и адаптации, желательно до того, как животным исполнится 8 недель. Тестируемые животные должны быть описаны по роду, виду, происхождению, полу, массе и возрасту. В начале исследования разница в массе подопытных животных должна быть минимальна и не превышать от средней массы всех животных, задействованных в исследовании, отдельно каждого пола. Животные должны быть случайным образом распределены на контрольную и тестовую группы. После распределения заметной разницы в средней массе между группами каждого пола быть не должно. Если же она имеется, следует, по возможности, повторить распределение. Каждое животное должно быть помечено индивидуальным идентификационным номером, и этот номер следует нанести на перманентной основе, с помощью татуировки, вживления микрочипа или другим соответствующим способом.

4.2. Основное исследование

Количество и пол животных

4.2.1. Должны использоваться животные обоих полов. Как правило, грызунов - минимум 20 животных, негрызунов - по 4 животных в каждой группе каждого пола для каждого уровня дозы. В исследованиях, где задействованы мыши, может возникнуть необходимость в дополнительных животных в каждой группе для проведения всех необходимых гематологических анализов. В зависимости от цели исследования можно увеличить статистическую значимость основных показателей, распределив неравномерно животных по уровням доз.

Резерв для промежуточных умерщвлений, вспомогательные группы и индикаторные животные.

4.2.2. При исследовании необходимо сделать резерв для промежуточных умерщвлений, например, в 6 месяцев, для получения данных о развитии токсических изменений и данных о механизме воздействия, если это научно обосновано. Также нужно задействовать вспомогательные группы для отслеживания обратимости любых токсических изменений, вызванных химическими веществами при исследовании. Как правило, их распределяют на группу с самым высоким уровнем дозы и контрольную группу. Если запланировано промежуточное умерщвление, количество животных, включенных в план исследования, должно быть увеличено на число животных, которое планируется умертвить до завершения исследования. Этим животным следует провести такое же обследование (включая массу тела, потребление воды и пищи, гематологические и клинические биохимические показатели, выявление патологий), как и животным в стадии хронической токсичности основного исследования. Можно также сделать резерв (в группах промежуточного умерщвления) для измерений, ограниченных особыми, ключевыми показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность.

Группы доз и дозировка

4.2.3. Следует использовать как минимум три уровня доз и параллельный контроль за исключением тех случаев, когда проводится исследование с максимально возможной дозой. Чаще всего при выборе уровней доз основываются на результатах краткосрочных исследований повторной дозы или исследованиях по обнаружению диапазона доз. Необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные по тестируемому или родственным ему веществам.

4.2.4. Если нет ограничений по физико-химической природе или биологическому воздействию исследуемого вещества, должна быть выбрана самая высокая доза для определения основных органов-мишеней и токсичных эффектов воздействия. Однако следует избегать страданий, тяжелой токсичности, болей или смерти. Самый высокий уровень дозы следует выбрать для получения признаков интоксикации, например, изменение уровня сывороточного фермента или невозможность набрать массу (примерно 10%).

4.2.5. В зависимости от целей исследования должна быть выбрана верхняя доза ниже, чем доза, подтверждающая наличие токсичности, например, если доза вызывает побочное действие, которое, тем не менее, слабо отражается на продолжительности жизни или массе тела. Наивысшая доза не должна превышать 1 000 мг/кг в день.

4.2.6. Разница между уровнями доз должна быть направлена на определение зависимости доза-ответ и установление наивысшего уровня дозы, при которой не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), или других предполагаемых результатов исследования, например, BMD при самом низком уровне дозы. Условия, которые должны быть приняты во внимание при установлении нижних доз, включают: предполагаемый наклон кривой зависимости доза-ответ, дозы при которых могут происходить важные изменения в метаболизме, или вид токсического действия, когда предполагается пороговая величина, или когда предполагается исходная точка для экстраполяции низкой дозы.

4.2.7. Избранная разница в уровне доз зависит от параметров тестируемого вещества. Диапазон от 2 до 4 зачастую оптимален для установления снижения уровней доз, а при использовании очень больших интервалов (например, диапазон примерно 6-10) между дозми предпочтительно добавление четвертой тестируемой группы. При выборе доз и разницы в уровнях доз следует использовать Руководство ОЭСР N 116, но в целом следует избегать использования диапазона выше 10, а его применение должно быть обосновано.

4.2.8. При выборе дозы для проведения исследований хронической токсичности и канцерогенности необходимо учесть:

- знания или предположения о нелинейностях или точках изгиба и зависимости доза-ответ;

- токсикокинетические закономерности, а также уровни доз, при которых происходят или не происходят метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между введенными и поглощенными дозами;

- признаки поражения, влияния или показатели воздействия на основные биологические процессы;

- основные (или предполагаемые) проявления механизма действия, как то дозы, при введении которых начинает увеличиваться цитотоксичность, нарушается гормональный уровень, подавляется гомеостатический механизм и т.д.;

- интервалы кривой доза-эффект, где необходима чрезвычайно надежная оценка, например, в пределах ожидаемых BMD или предполагаемых пороговых величин;

- уровни анализа предполагаемого воздействия на организм человека.

4.2.9. Контрольная группа не должна получать исследуемое вещество. С животными из контрольной группы следует обращаться также, как и с тестируемыми группами. Если используется растворитель, отличный от воды, контрольная группа должна получать его в максимальном объеме от используемого в опытных группах.

4.2.10. Если результаты предыдущих исследований, проведенных в соответствии с требованиями данных испытаний, показали, что тест при одном уровне дозы, равной не менее 1 000 мг/кг массы тела в сутки, не выявляет отрицательного эффекта и токсичность является маловероятной на основании данных, полученных для веществ, близких по структуре, то проведение полного исследования с использованием трех уровней доз не требуется. Предельная доза 1 000 мг/кг массы тела в сутки применяется в тех случаях, когда есть вероятность воздействия на людей более высоких доз.

4.3. Подготовка доз и правила введения исследуемого вещества

4.3.1. Исследуемое вещество вводится перорально через зонд или с пищей, или с питьевой водой. Способ и метод введения зависят от цели исследования, физико-химических свойств вещества, его биологической усвояемости и основного способа и пути воздействия на организм человека. Целесообразность способа и метода введения должна быть обоснована. В интересах благополучия животных, желудочный зонд обычно следует выбирать только для тех агентов, для которых этот маршрут и способ применения представляют потенциал воздействия на человека (например, фармацевтические препараты). Для химических веществ, поступающих из окружающей среды и с продуктами питания, включая пестициды, поступление в организм, как правило, осуществляется с пищей или питьевой водой.

4.3.2. Необходимо уделять внимание следующим характеристикам среды или других вспомогательных веществ, в зависимости от конкретного случая: влиянию на абсорбцию, распределение, метаболизм или накопление исследуемого вещества; влиянию на химические свойства исследуемого вещества, которые могут повысить его токсические свойства; влиянию на потребление пищи или воды или обусловленное питанием, состояние животных. Рекомендуется, где возможно, использовать, в первую очередь, водные растворы/суспензии, затем рассматривать раствор эмульсии в масле (например, кукурузное масло), и затем искать возможное решение с использованием других сред. Для сред, отличных от воды, должны быть известны их токсические свойства. Следует определять стабильность исследуемого вещества к условиям введения.

4.3.3. При введении вещества с пищей или водой важно, чтобы испытуемое вещество не влияло на характер питания и водный баланс. В хронических исследованиях с введением вещества с пищей концентрация химического вещества в корме не должна превышать 5% от общего объема пищи, если только питание не регламентируется условиями тестирования.

4.3.4. При пероральном введении животные получают дозу исследуемого вещества ежедневно (семь дней в неделю), как правило, в течение 1 года. Любой другой режим дозы, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован.

4.3.5. Когда исследуемое вещество вводится животным в одно и то же время ежедневно через зонд, следует использовать желудочный зонд или подходящую полую трубку. Как правило, одна доза вводится раз в день. Когда состав вызывает раздражение, дозу следует вводить дробно. Максимальный объем жидкости, который может быть введен единовременно, зависит от размеров подопытного животного. Как правило, объем должен быть как можно ниже и не превышать 1 мл/100 г массы, исключая случаи с водным раствором, где можно использовать 2 мл/100 г массы. Колебания в тестовом объеме должны быть сведены к минимуму путем корректировки концентрации до обеспечения постоянного объема всех уровней дозы. Потенциально разъедающие или раздражающие вещества являются исключительным случаем. Их необходимо разбавлять, чтобы избежать тяжелых локальных поражений. Щелочной баланс растворов, содержащих дозу, как правило, лежит в интервале от 4 до 9 pH.

4.4. Продолжительность исследования

4.4.1. Несмотря на то, что данный метод исследования рассчитан на 12-месячное исследование хронической токсичности, планом исследования допускается, что может быть применен как более короткий (например, 6 или 9 месяцев), так и более длинный (например, 18 или 24 месяца) период исследований в зависимости от целей и задач эксперимента. Отклонения от продолжительности воздействия в 12 месяцев должны быть обоснованы, особенно в случае сокращения сроков. Вспомогательные группы, включенные для наблюдения за обратимостью любых токсических изменений, вызванных химическим веществом, следует держать без дозировок не менее 4 недель, но не более одной трети от общего периода исследования после прекращения воздействия.

5. Наблюдения

5.1. Общее состояние животных (заболевание или гибель) с особым вниманием к токсикологически значимым признакам, в частности нейрофункциональным и нейроповеденческим реакциям, должно исследоваться в начале и в конце каждого дня. Дополнительно животные должны проверяться как минимум один раз в выходные и праздничные дни. Общее клиническое наблюдение должно осуществляться как минимум один раз в день, предпочтительно в одно и то же время, принимая во внимание период максимума предполагаемого воздействия дозы. Клиническое состояние животных следует фиксировать.

5.2. Подробное клиническое наблюдение должно быть проведено как минимум один раз до начала воздействия (учитывая предмет исследования), к концу первой недели исследования и впоследствии ежемесячно. Протокол наблюдений должен быть согласован так, чтобы обеспечить минимальную разницу между отдельными наблюдателями и независимость от тестовой группы. Эти обследования необходимо делать вне клетки, каждый раз в одном месте, в одно и то же время. Их следует тщательно фиксировать, желательно используя систему количественных показателей, четко оговоренную испытательной лабораторией. Необходимо следить за тем, чтобы варьирование в условиях наблюдения было минимальным. Отмеченные признаки должны включать, но не только, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреции и экскреции и автономной активности (например, слезоотделение, пилоэрекция, размер зрачка, аномальный способ дыхания). Изменения в походке, положении тела, реакции на прикосновение, как и наличие клонических или тонических движений, стереотипах (например, чрезмерное умывание, однообразные движения по кругу) или аномалиях поведения (например, членовредительство, хождение задом наперед) также должны регистрироваться.

5.3. Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить всем животным до первого введения исследуемого вещества. По окончании исследования этот осмотр желательно провести всем животным, но, как минимум, группе с высокой дозой и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена.

5.4. Для химических веществ, для которых предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы в течение 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать нейротоксическое воздействие, сенсорную химическую активность к раздражителям различного типа (например, слуховые, визуальные и проприоцептивные раздражители) оценку силы захвата и двигательной активности можно проводить, по выбору, до начала исследования и затем в 3, 6, 9 и 12 месяцев. Однако можно использовать и другие, не приведенные в списке процедуры.

5.5. Для химических веществ, для которых предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы через 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать иммунотоксическое воздействие, дальнейшие исследования этого результата могут по желанию проводиться до 12 месяцев.

Масса тела, потребление пищи/воды и питательность пищи

5.6. Все животные должны взвешиваться в начале исследования как минимум раз в неделю первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду.

Гематология и клиническая биохимия

5.7. В исследованиях, в которых используются грызуны, гематологические исследования необходимо проводить как минимум на 10 самцах и 10 самках каждой группы в 3, 6 и 12 месяцев, всегда используя одних и тех же животных. В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные с тем, чтобы проводить все необходимые гематологические исследования. В исследованиях с негрызунами пробы берутся у меньшего количества животных (например, 4 особи каждого пола каждой группы в случае с исследованием на собаках). Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на гематологические параметры. Образцы должны быть собраны к концу запланированного периода исследования, в период исследования к 3 и 6 месяцам и к 12 месяцу непосредственно перед или во время процедуры умерщвления животных. Пробы крови следует брать из сердечной камеры или из ретроглазной пазухи и, по возможности, хранить в подходящих условиях. Необходимо исследовать приведенный список параметров: общая и лейкоцитарная формула, содержание эритроцитов, содержание тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит (гематокритное число), среднее гематокритное число (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН), концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), протромбиновое время и время образования и активности тромбопластина. Кроме того, необходимо исследовать тельца Гейнца, или другую атипичную морфологию эритроцитов и метгемоглобин, если присутствуют любые признаки анемии или других нарушений кроветворения. Если химические вещества оказывают влияние на кроветворительную систему, можно также измерить число ретикулярных клеток и цитологию костного мозга, хотя они не обязательны для регулярного проведения.

5.8. Клинические биохимические показатели при исследовании токсического воздействия на ткани и особенно влияние на почки и печень следует определять в пробах крови, полученных от как минимум 10 самцов и 10 самок каждой группы за одинаковые временные интервалы, как предписано для гематологических исследований, всегда используя одних и тех же животных. Для мышей, могут потребоваться вспомогательные животные с тем, чтобы проводить все необходимые клинические биохимические исследования. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на клинические биохимические параметры. Рекомендуется голодание для животных (за исключением мышей) вечером накануне забора крови. Необходимо исследовать приведенный список параметров: глюкоза, азот мочевины, креатинин, общий белок, альбумин, кальций, натрий, калий, общий холестерин, как минимум два анализа на гепатобилиарный статус (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, глютаминат дегидрогеназа, желчные кислоты), и как минимум два анализа на гепатобилиарный анализ (щелочная фосфатаза, гамма-глутаминтрансфераза, 5-нуклеотидаза, общий билирубин, желчные кислоты). Другие клинические химические показатели, такие как триглицерид натощак, специфицеские гормоны и холинэстераза могут быть измерены в случае необходимости в зависимости от токсичности вещества. В целом необходим гибкий подход в зависимости от наблюдаемого и/или ожидаемого воздействия каждого конкретного вещества.

5.9. Анализ мочи должен проводиться как минимум у 10 самцов и 10 самок каждой группы на образцах, собранных за одинаковые промежутки времени, как и в случае с гематологией и клинической химией. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействие на мочу. В последние экспертные рекомендации по исследованию клинической патологии был включен следующий список параметров: внешний вид, объем, осмотическая концентрация раствора или относительная плотность, pH, общий белок и глюкоза. Другие исследования включают кетон, уробилиноген, билирубин и скрытую кровь. Дополнительные исследования могут быть использованы при необходимости расширить изучение наблюдаемых воздействий.

6. Патоморфология

6.1. Макроскопическая аутопсия

6.1.1. Все животные, участвующие в исследовании, подвергаются полной, детальной макроскопической аутопсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудных и брюшных полостей и их содержимого. При этом может быть создан резерв (в группах для промежуточных умерщвлений или во вспомогательных группах) для измерений, ограниченных отдельными, важными показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность. Этих животных не нужно подвергать аутопсии и дальнейшим процедурам. Индикаторные животные могут подвергаться аутопсии в каждом отдельном случае по усмотрению руководителя исследования.

6.1.2. Значимые органы следует собрать у всех животных, исключая тех, что указаны выше. Надпочечник, мозг, придатки яичка, сердце, почки, печень, яичники, селезенка, яички, щитовидная железа (оценив постфиксацию, с паращитовидной железой) и матка всех животных (кроме тех, что были найдены умершими и/или были умерщвлены в промежутках между основными исследованиями) должны быть отсечены, если необходимо, от прилегающих тканей и взвешены как можно быстрее после отсечения для предотвращения высыхания. В случае если органы парные, например, почки, надпочечники, оба органа должны быть взвешены отдельно. В исследованиях с использованием мышей, взвешивание надпочечных желез не обязательно.

6.1.3. Ткани, которые подвергаются консервации в наиболее подходящем средстве фиксации в качестве образца ткани и для необходимого дальнейшего микроскопического исследования: все макроскопические повреждения, поджелудочная железа, аорта, мозг (включая полушария головного мозга, мозжечок и мозговой слой/варолиев мост), слепая кишка, шея, свертывающая железа, толстая кишка, двенадцатиперстная кишка, придаток семенника, глазные яблоки (включая сетчатку), бедро с суставами, желчный пузырь (для видов, отличных от крыс), гардерова железа, сердце, подвздошная кишка, тонкая кишка, почки, слезные железы (не обязательно), печень, легкие, лимфатические узлы (поверхностные и глубокие), молочные железы самок, [назальные ткани], пищевод, [обонятельная луковица], яичники, поджелудочная железа, паращитовидная железа, периферический нерв, слизистая, предстательная железа, [прямая кишка], слюнные железы, семенной пузырек, скелетные мышцы, кожа, спинной мозг (трех уровней: шейный, среднегрудной и поясничный), селезенка, [грудная кость], желудок (кардиальный отдел желудка, железистый желудок), [зубы], яички, вилочковая железа, щитовидная железа, [язык], трахея, мочевой пузырь, матка (включая шейку), [мочеточник], [уретра], влагалище и часть костного мозга и/или свежий пунктат костного мозга. Ткани, приведенные в квадратных скобках, не являются обязательными. В случае с парными органами, например, почки, надпочечники, следует сохранять оба органа. Любые другие органы, считающиеся на основе известных свойств исследуемого вещества возможными органами-мишенями, также следует сохранить. Для других органов/тканей (и в дополнение к отдельно сохраняемым тканям из дыхательных путей) список органов, как он установлен для перорального введения, должен быть пересмотрен.

6.2. Гистопатология

6.2.1. Минимальными гистопатологическими анализами должны быть:

- все ткани из группы с высокой дозой и контрольной группы;

- все ткани животных, умерших или умерщвленных в течение исследования;

- все ткани, имеющие макроскопические аномалии;

- ткани органов-мишеней или ткани животных, имеющие изменения, связанные с проводимым исследованием, из группы, получавшей наивысшую дозу, и из всех других групп;

- в случае с парными органами, например, почки, надпочечники, должны быть исследованы оба органа.

6.2.2. Данные для каждого отдельного животного должны содержать все параметры по оценке воздействия. В дополнение, все данные должны быть сведены в табличной форме, отражающей для каждой тестовой группы количество животных на начало исследования; количество животных, умерших во время исследования или умерщвленных по гуманным соображениям, и время каждой смерти или умерщвления; количество обнаруженных признаков токсичности; описание наблюдаемых признаков токсичности, включая время начала, продолжительность и тяжесть любых токсических воздействий; количество животных, демонстрирующих патологию, тип патологии и процент животных, демонстрирующих каждый тип патологии.

6.2.3. Кроме данных, полученных в контроле исследования, в интерпретации результатов эксперимента важны данные контроля предыдущих исследований. Данные контроля предыдущих исследований должны использоваться, только если в текущем контроле имеются значительные отклонения, но приоритет над данными контроля предыдущих исследований должен иметь текущий контроль. Данные контроля предыдущих исследований должны предоставляться из той же лаборатории, а также должны соответствовать род, вид животных и направление исследований. Использование данных предыдущих исследований должно быть соотнесено с данными, накопленными в течение трех/пяти лет, предшествующих спорному исследованию.

6.2.4. По возможности, численные результаты должны быть оценены специальными и общепринятыми статистическими методами. Статистические методы и данные для анализа должны быть выбраны во время разработки исследования. При необходимости, этот выбор должен предусматривать корректировку выживаемости.

7. Отчёт

Отчёт об исследовании должен содержать следующую информацию.

Исследуемое вещество.

- физические природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные;

- источник вещества;

- номер партии.

Среда (при необходимости):

- обоснование выбора среды (если это не вода).

Подопытные животные:

- вид/род и обоснование сделанного выбора;

- число, возраст, пол в начале исследования;

- происхождение, условия содержания, питание и так далее;

- масса каждого животного в начале исследования.

Данные об условиях проведения исследования:

- обоснование метода введения и выбора дозы;

- при необходимости, статистические методики, используемые для анализа данных;

- подробное описание приготовления состава тестируемого вещества/пищи, достигнутая концентрация, устойчивость и однородность вещества;

- способ введения вещества и подробное описание введения;

- фактическая доза (мг/кг в день) и переводной коэффициент от концентрации исследуемого вещества в пище/питьевой воде к фактической дозе, если возможно;

- качество пищи и воды.

Результаты:

- данные о выживших;

- масса/изменения массы;

- потребление еды, подсчёт энергетической ценности, если проведён, и потребление воды, если возможно;

- реакция на токсичность по полу и уровню дозы, включая признаки токсичности;

- характер, охват и, если выявлена, тяжесть и продолжительность клинических наблюдений (были они промежуточными или постоянными);

- офтальмологический осмотр;

- гематологические анализы;

- клинические биохимические анализы;

- анализ мочи;

- результат любых исследований нейротоксичности или иммунотоксичности;

- конечная масса тела;

- масса органов и их соотношение, если возможно;

- данные аутопсии;

- детальное описание гистопатологических показателей, имеющих отношение к проводимому исследованию;

- данные абсорбции (если возможно).

Статистическая обработка результатов (где это возможно):

- масса тела до и после исследования;

- масса органов до и после исследования;

- потребление пищи или воды и энергетическая ценность пищи.

Изучение результатов включает:

- соотношение зависимости доза-ответ;

- рассмотрение любой формы воздействия;

- изучение возможности моделирования;

- данные контроля предыдущих исследований;

- значимость для человека.

Заключение.