Приложение 6.2.2. Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах

Приложение 6.2.2

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 409 "Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Non-Rodents" (ОЭСР Руководство N 409 "Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах". Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования по изучению пероральной токсичности при повторном воздействии в 90-дневных опытах на негрызунах предназначен для получения информации о возможном вреде для здоровья при повторном введении вещества в течение длительного периода времени.

2. Общие положения

2.1. При изучении и оценке токсикологических характеристик химического вещества определение субхронической пероральной токсичности с использованием повторного введения может выполняться после того, как получена первичная информация о токсичности в условиях острого опыта и 28-дневного опыта с изучением токсичности при повторном введении вещества. 90-дневное исследование дает информацию о возможном вреде для здоровья, связанном с повторным воздействием вещества во время периода быстрого роста и в период взросления. В этом исследовании можно получить информацию об основных токсических эффектах, выявить критические органы и способность вещества к аккумуляции. Могут быть также получены данные по оценке уровня, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL), который может использоваться при выборе доз для проведения хронических опытов и установления критериев безвредности воздействия вещества на человека.

2.2. Метод исследования создает возможность для выявления вредных эффектов химического воздействия на видах животных, не относящихся к грызунам, и может использоваться, если:

- эффекты, наблюдавшиеся в других исследованиях, указывают на необходимость их уточнения/характеристики на втором виде животных - негрызунах, или

- токсикокинетические исследования свидетельствуют о том, что именно определенный вид негрызунов является наилучшим выбором лабораторного животного, или

- другие специфические причины оправдывают использование вида животных - негрызунов.

3. Описание метода

3.1. Принцип метода

Изучаемое вещество вводят ежедневно перорально в градуированных дозах нескольким группам экспериментальных животных в одном дозовом уровне на группу в течение 90 дней. В течение периода введения вещества тщательно наблюдают за животными для выявления признаков интоксикации. Погибших или умерщвленных во время эксперимента животных вскрывают, в конце эксперимента выживших животных также умерщвляют для вскрытия.

3.2. Животные

Выбор вида животных

3.2.1. Обычно используемый вид негрызунов - собаки, которые должны быть определенной породы, наиболее часто используется бигль. Могут быть использованы и другие виды животных, например, свиньи, мини-свиньи. Приматы не рекомендуются и их использование должно быть обосновано. Должны использоваться молодые здоровые животные, для собак воздействие вещества предпочтительно начинать с 4-6-месячного и не позднее 9-месячного возраста животных. Если исследование проводится как предварительное к длительному хроническому опыту, в обоих экспериментах должны использоваться животные одного и того же вида/породы.

Содержание и кормление

3.2.2. Для кормления может использоваться обычная лабораторная диета с неограниченным потреблением питьевой воды. На выбор диеты может повлиять необходимость обеспечить хорошее смешивание изучаемого вещества, если оно вводится с кормом. Содержание в клетках должно быть подходящим для используемого вида животных. Предпочтительно искусственное освещение, с последовательным чередованием: 12 ч света и 12 ч темноты. Условия содержания и кормления должны учитывать специфические потребности выбранного вида животных.

Подготовка животных

3.2.3. Должны использоваться здоровые молодые животные, акклиматизированные к лабораторным условиям и ранее не подвергавшиеся экспериментальным процедурам. Продолжительность акклиматизации зависит от выбранного вида экспериментальных животных и их источника. Рекомендуемое время акклиматизации - не менее 5 дней для собак или свиней из постоянных колоний и не менее 2 недель для этих животных из внешних источников. Животные должны быть охарактеризованы по виду, линии, источнику, полу, массе и/или возрасту. Животные должны быть произвольно распределены в контрольную и экспериментальные группы. Клетки должны быть расставлены так, чтобы свести к минимуму возможные эффекты, связанные с размещением клеток. Каждое животное должно получить индивидуальный идентификационный номер.

3.3. Подготовка вводимых доз

3.3.1. Изучаемое вещество может# вводят с диетой или с питьевой водой, желудочным зондом или в капсулах. Метод перорального введения зависит от целей исследования и физико-химических свойств изучаемого вещества.

3.3.2. Если необходимо, изучаемое вещество растворяют или суспензируют в подходящем растворителе. Предпочтительным растворителем является вода; за ним следует масло (например, кукурузное масло) и только потом - другие растворители. Для растворителей, отличных от воды, должны быть известны токсикологические характеристики. Должна быть определена стабильность изучаемого вещества в условиях его введения животным.

3.4. Процедура испытания

3.4.1. Количество и пол животных

В каждой дозе должны быть использованы, по крайней мере, 8 животных (четыре самки и четыре самца). Если планируется умерщвление животных в течение эксперимента, общее число животных должно быть увеличено на то их количество, которое предназначается к умерщвлению до завершения эксперимента. Количество животных в конце исследования должно быть достаточным для адекватной релевантной оценки токсических эффектов. На основе имеющихся данных о веществе или его близком аналоге должна быть рассмотрена целесообразность включения дополнительной сателлитной группы из 8 животных (по четыре каждого пола) в контрольную группу и группу, получающую максимальную дозу вещества, для наблюдения после прекращения воздействия вещества за обратимостью или устойчивостью токсических эффектов. Продолжительность периода этого наблюдения должна определяться с учетом выявленных эффектов.

3.4.2. Дозировка

Должны использоваться, по крайней мере, три уровня доз и контроль, если только не проводится сокращенное изучение вещества. Уровни доз могут быть основаны на результатах экспериментов с повторным введением вещества или исследований по поиску диапазона доз. При этом должны приниматься во внимание любые известные токсикологические и токсикокинетические данные, имеющиеся для изучаемого вещества или родственных веществ. Если нет ограничений, обусловленных физико-химической природой или биологическими эффектами изучаемого вещества, наивысшая доза должна вызвать токсическое действие, но не гибель или сильные страдания животных. Последовательность снижения дозовых уровней должна выбираться с перспективой обнаружения любых дозозависимых реакций и так, чтобы уровень, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL), соответствовал наименьшей из использованных доз. Двух- или четырехкратные интервалы обычно оптимальны для установления убывающих дозовых уровней, а добавление четвертой опытной группы животных часто предпочтительнее использования очень больших интервалов (например, более чем 6-10-кратных) между дозами.

3.4.3. Контрольная группа остается интактной или получает растворитель, если он используется для введения изучаемого вещества. За исключением воздействия изучаемым веществом условия содержания контрольных и опытных животных должны быть идентичными. Если применяется растворитель, контрольная группа должна получать его в наибольшем из используемых объемов. Если изучаемое вещество вводится с диетой и вызывает снижение потребления пищи, может быть полезным использование второй контрольной группы для того, чтобы отличить снижение аппетита животных от токсикологических изменений экспериментальной модели.

3.4.4. При необходимости должны быть приняты во внимание следующие характеристики растворителя или других добавок: эффекты, оказывающие влияние на абсорбцию, распределение, метаболизм или накопление изучаемого вещества; эффекты, влияющие на химические свойства изучаемого вещества, которые могут изменять характеристики его токсичности; эффекты, влияющие на потребление пищи и воды или пищевой статус животных.

3.5. Исследование в сокращенном объеме

Если исследование одной дозы, эквивалентной как минимум 1 000 мг/кг массы те- ла/день, с использованием процедур, предусмотренных для 90-дневного изучения токсичности, не выявляет токсических эффектов и, если токсичность не ожидается исходя из данных о структурно родственных веществах, тогда полное исследование с тремя уровнями доз может рассматриваться как необязательное. В этих случаях проводят исследование вещества в сокращенном объеме, если только воздействие на людей не свидетельствует о необходимости тестирования более высокой дозы.

3.6. Введение доз

3.6.1. Животные должны получать изучаемое вещество ежедневно семь дней в неделю в течение 90 дней. Любой другой режим введения вещества, например, пять дней в неделю, нуждается в обосновании. Если изучаемое вещество вводят животным внутрижелудочно, вся доза должна быть введена в один прием с помощью желудочного зонда или подходящей интубационной канюли.

3.6.2. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера экспериментального животного. В большинстве случаев используется как можно меньший объем.

3.6.3. Для изучаемых веществ, за исключением едких и раздражающих, у которых обычно при увеличении концентрации раздражающие эффекты усугубляются, вариабельность объема должна быть минимизирована подбором концентраций так, чтобы все дозы вводили в одном и том же объеме.

3.6.4. Для веществ, вводимых с диетой или питьевой водой, важно убедиться, что используемые количества изучаемого вещества не нарушают нормальное питание или водный баланс. Если изучаемое вещество вводят с диетой, может использоваться либо постоянная концентрация (ppm), либо постоянный уровень доз в переводе на вес тела животного. Выбор должен быть точно определен.

3.6.5. Для веществ, вводимых с помощью зонда, доза вещества должна вводиться каждый день в одно и то же время и устанавливаться в соответствии с необходимостью поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного. Если 90-дневное исследование проводят как предварительное к долговременному хроническому исследованию, в обоих исследованиях должны использоваться одинаковые диеты.

3.7. Наблюдение

3.7.1. Период наблюдения должен составлять не менее 90 дней. Животные сателлитной группы, предназначенные для последующих наблюдений, должны содержаться в течение соответствующего периода без воздействия вещества для выявления длительности сохранения токсических эффектов или их исчезновения.

3.7.2. Общие клинические наблюдения должны проводиться, по крайней мере, один раз в день, желательно в одно и то же время, принимая во внимание период максимального проявления ожидаемых эффектов после введения вещества. Состояние животных должно быть зафиксировано. Не менее двух раз в день, обычно в начале и конце каждого дня, животных осматривают для выявления клинических симптомов или гибели.

3.7.3. По крайней мере, один раз перед первым введением вещества (для возможности внутригрупповых сравнений) и один раз в неделю после начала воздействия вещества должны быть проведены детальные клинические наблюдения всех животных. Наблюдения должны проводиться вне клетки предпочтительно на стандартном месте и в одно и то же время дня.

3.7.4. Должны быть приняты меры для обеспечения минимальности различий в условиях наблюдения. Признаки токсичности должны быть тщательно зарегистрированы, включая время появления, интенсивность и продолжительность. Наблюдения должны включать, не ограничиваясь этим, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, наличие секреции и экскреции и автономной активности (например, слезотечение, пилоэрекция, размер зрачка, необычные типы дыхания), изменения в походке, позе, грумминге, наличие клонических или тонических движений, стереотипию (например, слишком интенсивный грумминг, повторяющиеся круговые движения) или странное поведение (например, самоповреждение, движение задом наперед).

3.7.5. Офтальмологическое исследование с использованием офтальмоскопа или соответствующего эквивалентного оборудования должно проводиться до начала введения изучаемого вещества и в конце эксперимента, предпочтительно у всех животных или, по крайней мере, в группе с наивысшей дозой и контрольной группе. Если в глазах обнаруживаются изменения, исследование должно быть проведено у всех животных.

3.8. Масса тела и потребление пищи/воды

3.8.1. Все животные должны быть взвешены не менее одного раза в неделю.

3.8.2. Измерения потребления пищи должны проводиться не менее одного раза в неделю. Если изучаемое вещество вводится с питьевой водой, потребление воды должно также измеряться, по крайней мере, еженедельно. Потребление воды может также учитываться в тех экспериментах с введением вещества с диетой или с помощью зонда, в которых может изменяться питьевая активность животных.

3.9. Гематология и клиническая биохимия

3.9.1. Образцы крови должны быть отобраны в запланированные периоды эксперимента, при необходимости сохраняться в соответствующих условиях. В конце исследования образцы крови отбирают непосредственно перед умерщвлением или как часть процедуры умерщвления животных.

3.9.2. Гематология, включая гематокрит, концентрацию гемоглобина, количество эритроцитов, общий лейкоцитоз и лейкоцитарную формулу, количество тромбоцитов и время свертываемости крови, протромбиновое время или тромбопластиновое время, должна изучаться в начале эксперимента, затем с интервалами в один месяц или в середине исследования, и, наконец, при завершении экспериментального периода.

3.9.3. Клинические биохимические исследования для выявления основных токсических эффектов в тканях и, особенно, действия на почки и печень, должны проводиться в образцах крови, взятых у всех животных в начале эксперимента, затем, или с интервалами в один месяц, или в середине исследования, и, наконец, при завершении экспериментального периода. Исследования должны охватывать электролитный баланс, метаболизм углеводов и функции печени и почек. На выбор специфических тестов влияют наблюдения за механизмом действия изучаемого вещества.

3.9.4. Животные должны голодать до взятия крови в течение периода времени, соответствующего виду животного. Предполагаемые исследования включают кальций, фосфор, хлориды, натрий, калий, глюкозу натощак, аланинаминотрансферазу (АЛТ), аспартатаминотрансферазу (ACT), орнитин декарбоксилазу, гамма глютамил транспептидазу, азот мочевины, альбумин, креатинин крови, общий билирубин и общий белок сыворотки.

3.9.5. Анализы мочи должны быть проведены, по крайней мере, в начале, середине и конце эксперимента с использованием таких показателей, как внешний вид, объем, осмотическое давление и удельный вес, pH, белок, глюкоза, кровь и клетки крови. При необходимости могут использоваться дополнительные параметры для углубленного изучения наблюдаемых эффектов.

3.9.6. Кроме того, должны быть предусмотрены исследования для выявления маркеров общего повреждения тканей. Другие измерения, которые могут оказаться необходимыми для адекватной токсикологической оценки, включают анализы липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина и угнетения холинэстеразы. Дополнительная клиническая биохимия может быть использована при необходимости углубленных исследований наблюдаемых эффектов. Такие исследования могут проводиться для химических веществ соответствующих классов или в каждом отдельном случае. Необходим гибкий подход, зависящий от вида животного и наблюдаемого/или ожидаемого эффекта того или иного соединения.

3.10. Патология

Некропсия

3.10.1. Все экспериментальные животные должны быть подвергнуты полной, детальной некропсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий и черепных грудных, абдоминальных полостей и их содержимого. Печень с желчным пузырем, почки, надпочечники, семенники, придатки семенников, яичники, матка, щитовидная железа (с паращитовидными железами) тимус, селезенка, головной мозг и сердце всех животных (за исключением животных, найденных агонизирующими и/или умерщвленных до завершения эксперимента) должны быть соответствующим образом освобождены от прилежащих тканей и их масса определена как можно скорее после диссекции для предупреждения высыхания.

3.10.2. Следующие ткани должны быть фиксированы в наиболее подходящей для обоих типов тканей фиксирующей среде и подвергнуты последующему гистопатологическому исследованию: все явные повреждения, головной мозг (репрезентативные области, включая большой мозг, мозжечок и продолговатый мозг/варолиев мост), спинной мозг (на трех уровнях: шейном, среднегрудном и поясничном), гипофиз, щитовидная железа, паращитовидные железы, тимус, пищевод, слюнные железы, желудок, тонкий и толстый кишечник (включая Пейеровы бляшки), печень, желчный пузырь, поджелудочная железа, почки, надпочечники, селезенка, сердце, трахея и легкие, аорта, гонады, матка, вспомогательные половые органы, молочные железы самок, простата, мочевой пузырь, лимфатические узлы (желательно один лимфатический узел вблизи пути введения вещества и еще один лимфатический узел, удаленный от пути введения вещества, для выявления системных эффектов), периферический нерв (седалищный или большеберцовый) желательно в непосредственной близости к мышце, срез костного мозга (и/или свежий пунктат костного мозга) и кожа. Клинические и другие данные могут послужить основанием для изучения дополнительных тканей. Кроме того, должны быть фиксированы любые органы, которые могут оказаться критическими исходя из известных свойств изучаемого вещества.

Гистопатология

3.10.3. Полное гистопатологическое исследование должно быть проведено с фиксированными органами и тканями всех животных контрольной группы и всех животных, получавших максимальную дозу вещества. Исследование должно быть распространено и на всех животных, получавших вещество в других дозах, если у животных, получавших максимальную дозу, выявлены изменения, обусловленные воздействием изучаемого вещества.

3.10.4. Все макроскопические патологические изменения должны быть изучены.

3.10.5. Если использовалась сателлитная группа, гистопатологические исследования должны проводиться с тканями и органами, в которых выявлены изменения, вызванные воздействием изучаемого вещества.

4. Данные и отчет

4.1. Данные

4.1.1. Данные должны быть представлены для животных индивидуально. Дополнительно все данные обобщаются в табличной форме, где для каждой экспериментальной группы приводятся число животных в начале исследования, число животных, найденных погибшими в течение эксперимента или умерщвленных из гуманных соображений, с указанием времени гибели или умерщвления, число животных с выявленными признаками токсичности, описание наблюдавшихся признаков токсичности, включая время появления, продолжительность и тяжесть каждого токсического эффекта, число животных с выявленными патологическими изменениями, типы этих изменений и процент животных, у которых наблюдался каждый из типов патологических изменений.

4.1.2. Если возможно, количественные результаты должны быть оценены соответствующим и в целом приемлемым статистическим методом. Статистические методы и анализируемые данные должны выбираться при планировании эксперимента.

4.2. Отчет

Отчет о проведенных исследованиях должен включать следующую информацию.

Изучаемое вещество:

- физическая природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные.

Растворитель (если применялся):

- обоснование выбора растворителя, если это не вода.

Экспериментальные животные:

- вид и линия использованных в эксперименте животных;

- число, возраст и пол животных;

- источник, условия содержания, диета и т.д.;

- индивидуальная масса животных в начале эксперимента.

Условия эксперимента:

- обоснование выбора уровней доз;

- детали технологии подготовки изучаемого вещества/приготовление диеты, полученные концентрации, стабильность и гомогенность препарата;

- детали введения изучаемого вещества;

- фактическая доза вещества (мг/кг массы/день), коэффициент пересчета концентраций изучаемого вещества в корме/питьевой воде (ppm) на фактическую дозу (мг/кг массы/день), если требуется;

- детали качества корма и воды.

Необязательные для изучения показатели:

- перечень изученных необязательных показателей.

Результаты:

- масса тела и изменения массы тела;

- потребление пищи и потребление воды, если требуется;

- данные о токсических реакциях в зависимости от пола и дозовых уровней, включая признаки токсичности;

- природа, тяжесть и длительность клинических проявлений (обратимых или необратимых);

- результаты офтальмологических исследований;

- сенсорная активность, оценка силы схвата и моторной активности (если требуется);

- гематологические исследования с соответствующими исходными уровнями;

- клинические биохимические исследования с соответствующими исходными уровнями;

- масса тела при умерщвлении, масса внутренних органов и относительная масса внутренних органов;

- данные некропсии;

- детальное описание всех гистопатологических изменений;

- данные абсорбции, если имеются;

- статистическая обработка результатов, при необходимости.

Обсуждение результатов.

Выводы.