Приложение 6.7.2. Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений при 28-дневном повторном введении

Приложение 6.7.2

Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений при 28-дневном повторном введении

Идентичен международному документу OECD TG N 419 "Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances:28-day Repeated Dose Study" (ОЭСР Руководство N 419 "Исследование отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений при 28-дневном повторном введении"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации об отдаленном нейротоксическом действии фосфорорганических соединений при их повторном воздействии на лабораторных животных и позволяет оценить и классифицировать вещество в соответствии с СГС по данному виду воздействия.

2. Общие положения

2.1. Исследование нейротоксичности химических веществ и продукции на их основе вследствие ингибирования эстеразы (нейротоксичная эстераза - далее НТЭ) для определения последствий в течение 28 дней.

2.2. Метод позволяет дать оценку специфическим типам нейротоксичности, которые не могут быть обнаружены в других токсикологических исследованиях.

2.3. Ингибирование НТЭ в головном и спинном мозге в течение 24-48 часов после введения препарата коррелирует с клиническими и морфологическими эффектами отдаленного нейротоксического действия. Также НТЭ является актуальной моделью тестирования для всех фосфорорганических эфиров, являющихся причиной отдаленных невропатий человека.

2.4. Количественные данные ингибирования НТЭ позволяют значительно повысить точность определения неоднозначных результатов, которые могут наблюдаться в поведенческих реакциях и результатах гистологических исследований, возникающих вследствие отдаленной нейроинтоксикации, а также выявления подпорогового уровня (NOAEL).

2.5. Длительность эксперимента в 28 дней является наиболее оптимальной для выявления ингибирования НТЭ (отдаленного нейротоксического действия) при оценке большинства фосфорорганических веществ.

2.6. До проведения эксперимента необходимо рассмотреть всю доступную об исследуемом веществе информацию. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro; токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация необходима для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

3. Принцип метода

3.1. Вещество в исследуемой дозе вводят перорально домашним курам в течение 28 дней.

3.2. Ежедневное наблюдение за животными для изучения нарушений поведенческих реакций, атаксии и параличей ведется не менее 14 дней после введения последней дозы.

3.3. Биохимический анализ, в частности НТЭ, проводят на курах, выбранных случайным образом из каждой группы (как правило, через 24 и 48 часов после введения последней дозы исследуемого вещества).

3.4. Через две недели после введения последней дозы исследуемого вещества оставшихся кур подвергают эвтаназии и их нервные ткани подвергают гистологическому исследованию (п. 4.3.9).

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Имеется в виду "п. 4.3.8"

4. Описание метода

4.1. Подопытные животные

4.1.1. Выбор видов животных.

Для проведения эксперимента рекомендуются молодые самки яйценосной породы кур (Gallus gallus domesticus) в возрасте от 8 до 12 месяцев.

В исследовании используются животные (куры) стандартных размеров породы и линии, выращенные в условиях свободного передвижения.

4.1.2. Содержание и условия кормления.

Экспериментальных животных содержат в достаточно больших клетках или вольерах, которые позволяют курам свободно передвигаться, с возможностью наблюдать за их движениями.

В помещениях с искусственным освещением необходимо соблюдать последовательность: 12 часов света, 12 часов темноты.

Животные должны содержаться с использованием соответствующей диеты и с неограниченным потреблением питьевой воды.

4.1.3. Подготовка животных.

Молодые и здоровые взрослые куры без вирусных заболеваний, без применения лекарственных препаратов и без нарушения движений должны быть случайно выбраны в группу тестирования и в контрольную группу.

Все животные должны пробыть в лабораторных условиях для акклиматизации, по крайней мере, в течение 5 дней до начала исследования.

4.2. Способ введения и дозы препарата

Тестируемое вещество вводится перорально ежедневно (7 дней в неделю) через желудочный зонд или с использованием желатиновых капсул.

Жидкости могут быть даны как в неразбавленном виде, так и растворенные в соответствующих растворителях, таких как кукурузное масло. Твердые частицы должны быть суспендированы, если это возможно, так как большие дозы твердых веществ в желатиновых капсулах могут не оказывать эффект.

Токсикологические характеристики неводных растворителей должны быть известны, или определяться до начала исследования.

4.3. Процедура исследования

4.3.1. Количество животных и группы тестирования.

Группа тестирования и группа контроля растворителя должны содержать достаточное количество кур, так как шесть особей должны подвергнуться эвтаназии для биохимического анализа (по три особи на каждую из двух временных точек) и шесть должны остаться для наблюдений в течение 14 дней после введения последней дозы.

Обычно формируют не менее трех экспериментальных групп и группу контроля растворителя. Однако, если в исследованиях отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия (ОЭСР Руководство N 418) или в скрининговых тестах in vitro [9-11], или в исследованиях структура-активность не обнаружено эффектов в дозе исследуемого вещества 1000 мг/кг массы тела в сутки, применяют п. 4.3.3 данного руководства.

Каждая группа должна содержать, по крайней мере, шесть кур - для биохимических исследований и шесть - для гистопатологических исследований.

С группой контроля растворителя следует обращаться аналогичным образом, как и с группой тестирования, за исключением введения тестируемого вещества.

4.3.2. Исследования по выбору дозы.

Уровни доз должны быть выбраны с учетом данных исследования отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия и любых других доступных данных о токсичности или кинетике тестируемого вещества.

Самый высокий уровень дозы должен вызывать у экспериментальных животных токсические эффекты, желательно отдаленную нейротоксичность, но не гибель или тяжелые страдания. Последовательность снижения дозы должна продемонстрировать зависимость эффекта от дозы, а наиболее низкая доза должна соответствовать подпороговому уровню (NOAEL).

4.3.3. Ограничения метода.

Если в ходе тестирования с использованием процедур, описанных в данном руководстве, установлено, что доза на уровне не менее 1 000 мг/кг массы тела в сутки не обладает отдаленным нейротоксическим действием, а ожидаемая токсичность основана на наличии данных о токсичности структурно родственных соединений, тогда исследования с более высокими дозами не проводятся.

Ограничение метода не применяется в случае, когда данные по воздействию вещества на человека указывают на необходимость использования более высоких уровней доз.

4.3.4. Замечания.

Наблюдение за экспериментальными животными должны начинаться сразу после воздействия исследуемого вещества.

За всеми курами ведется наблюдение не менее одного раза в день в течение 28 дней введения исследуемого вещества и не менее 14 дней после введения последней дозы до эвтаназии. Наблюдения проводятся за поведенческими реакциями, но не ограничиваются ими.

Все признаки интоксикации животных записываются, в том числе время начала, тип, тяжесть и их продолжительность.

Атаксия должна быть измерена в соответствии с градацией шкалы, состоящей, по меньшей мере, из четырех уровней, отдельно отмечаются случаи паралича.

Куры, отобранные для изучения патологии, не менее двух раз в неделю извлекаются из клеток и подвергаются вынужденной двигательной активности (движение вверх по лестнице) для облегчения выявления минимального токсического эффекта.

Любое умирающее животное должно быть удалено из группы, подвергнуто эвтаназии и общей некропсии.

4.3.5. Масса тела.

У всех животных определяют массу тела (взвешивают) перед введением тестируемого вещества и в дальнейшем не менее одного раза в неделю в течение всего эксперимента.

4.3.6. Биохимические исследования.

В течение нескольких дней после введения последней дозы тестируемого вещества по шесть животных, случайно выбранных из экспериментальной группы и группы контроля растворителя, подвергаются эвтаназии, определяется НТЭ - активность нервной ткани мозга и поясничного отдела спинного мозга. Также может быть исследована НТЭ - активность нервной ткани седалищного нерва.

По три птицы из контрольной и каждой экспериментальной группы подвергают эвтаназии через 24 часа и по три через 48 часов после введения последней дозы.

Если в исследованиях отдаленного нейротоксического действия фосфорорганических соединений после острого воздействия (ОЭСР Руководство N 418) или других исследованиях (например - изучение токсикокинетики) показано, что необходимы другие временные рамки для эвтаназии и забора материала, то их обосновывают, документируют и используют.

В полученных образцах при необходимости можно исследовать активность ацетилхолинэстеразы (AChE). Однако спонтанная реактивация AChE может возникать in vivo, что может привести к недооценке активности испытуемого вещества как ингибитора AChE.

4.3.7. Вскрытие животных.

При вскрытии всех животных (плановозабитых и забитых умирающих) осуществляется анализ внешнего вида головного и спинного мозга.

4.3.8. Гистопатологические исследования.

Нервная ткань животных, выживших в течение всего периода наблюдений, не используемая для биохимических исследований, должна быть подвергнута микроскопическому исследованию.

Ткани должны быть зафиксированы in situ с помощью перфузионной техники.

Образцы должны включать ткани мозжечка (средний продольный уровень), продолговатого мозга, спинного мозга и периферических нервов.

Образцы спинного мозга должны быть взяты из верхних шейных сегментов средне- грудного и пояснично-крестцового отделов.

Необходимо также взять образцы из дистального отдела большеберцового нерва и его ответвлений в икроножной мышце и седалищного нерва.

Миелиновые оболочки и аксоны должны быть окрашены с использованием соответствующих специфических методик.

Примечание: В первую очередь гистологический анализ проводят на тканях контрольной группы и группы max дозы. В случае, когда отмечены эффекты в высоких доза-группах, то низшие доза-группы также оцениваются.

5. Данные и отчетность

5.1. Данные

Данные по каждому животному должны быть предоставлены индивидуально.

Все данные должны быть обобщены в табличной форме с указанием для каждой опытной группы количества животных в начале эксперимента, количества животных с нарушениями поведенческих или биохимических реакций, их типа и степени этих нарушений, и процентные соотношения, отображающие каждый тип и тяжесть нарушения или реакции.

5.2. Оценка результатов

Результаты проведенного исследования оцениваются с точки зрения распространенности, тяжести и корреляции поведенческих, биохимических реакций с результатами гистопатологических исследований, а также с любыми другими наблюдаемыми эффектами в тестируемых и контрольной группах.

Численные результаты оцениваются с использованием надлежащих общепринятых статистических методов. Статистические методы должны быть выбраны на этапе планирования исследования.

5.3. Отчет об исследовании

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

Тестируемое вещество:

- физическая природа (в том числе изомеризация, чистота и физико-химические свойства);

- идентификационные данные.

Растворитель (при необходимости):

- обоснование выбора растворителя, кроме воды.

Животные:

- используемая линия;

- количество и возраст животных;

- условия содержания, пищевой рацион и т.д.;

- индивидуальный вес животных в начале испытания.

Условия испытания:

- описание тестируемого действующего вещества препарата, его стабильность и гомогенность при необходимости;

- способ введения тестируемого вещества;

- описание пищевого и питьевого рациона;

- обоснование выбора дозы;

- детализация введения дозы препарата с указанием растворителя, объема и физической формы вводимого препарата.

Результаты:

- масса животного;

- токсикологические данные по группам, в том числе и по смертности;

- подпороговый уровень (NOAEL)

- характер, тяжесть и продолжительность клинических наблюдений (независимо от того, обратимы они или нет);

- подробное описание биохимических методов и их результатов;

- результаты вскрытия животных;

- подробное описание всех гистологических результатов;

- статистическая обработка результатов, где это необходимо.

Обсуждение результатов.

Выводы.