Приложение 6.5.1. Испытания по оценке кожной сенсибилизации

Приложение 6.5.1

Испытания по оценке кожной сенсибилизации

Идентичен международному документу OECD TG N 406 "Skin Sensitization" (ОЭСР Руководство N 406 "Кожная сенсибилизация"). Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования определяет порядок проведения испытаний кожной сенсибилизации.

2. Общие положения

2.1. В настоящее время количественные зависимости структура-активность и методы in vitro развиты недостаточно для использования при оценке способности вещества вызывать кожную сенсибилизацию и, следовательно, по-прежнему должны основываться на моделях in vivo.

2.2. Морская свинка в течение нескольких десятилетий использовалась в испытаниях сенсибилизирующего действия. Были разработаны два типа тестов: адъювантные тесты, в которых сенсибилизация инициируется введением полного адъюванта Фрейнда (ПАФ), и неадъювантные тесты. До недавнего времени было рекомендовано использование четырех адъювантных и трех неадъювантных тестов. В настоящее время предпочтение отдается Максимизационному тесту на морских свинках (GPMT) Магнуссона и Клигмана, который является адъювантным, и неадъювантному тесту Бюхлера. Однако при определенных обстоятельствах для получения необходимой информации о сенсибилизации использование других методов также признается возможным.

2.3. Иммунная система мыши была исследована более подробно, чем иммунная система морской свинки. Были разработаны модели для оценки сенсибилизационного потенциала на мышах, обладающие рядом преимуществ, в частности возможностью объективной оценки конечного результата испытания, короткой продолжительностью и минимальной процедурой обработки животных. Тест на отек уха мыши (MEST) и метод локальных лимфатических узлов (LLNA) считаются перспективными. Оба метода прошли проверку в ряде лабораторий, в результате было доказано, что с их помощью могут выявляться умеренные и сильные сенсибилизаторы. Методы LLNA или MEST могут использоваться в качестве первого этапа оценки сенсибилизационного потенциала. Если в обоих испытаниях получен положительный результат, исследуемое вещество может быть признано потенциальным сенсибилизатором и для него может не требоваться проведение дальнейшего испытания на морских свинках. Однако, если в LLNA или MEST получают отрицательный результат, испытания на морских свинках (GPMT или тест Бюхлера) должны проводиться с использованием процедуры, приведенной в данном документе.

3. Принцип метода исследования

3.1. В общем случае, экспериментальные животные подвергаются воздействию исследуемого вещества путем подкожной инъекции и/или накожного нанесения (индукционная экспозиция). Животные обрабатываются провокационной дозой по прошествии 10-14 дней (индукционный период), в течение которых может развиться иммунная реакция. Величина и степень кожной реакции на провокационную дозу у подопытного животного сравнивается с реакцией животных, которые подвергались фиктивному воздействию в индукционный период и получили провокационную дозу вещества.

4. Процедура исследования

4.1. Подготовка

Пол животных

4.1.1. Используются взрослые здоровые молодые самцы и/или самки. Используемые самки не должны быть рожавшими или беременными.

Условия содержания и кормления

4.1.2. Температура лабораторной комнаты должна составлять , относительная влажность - от 30 до 70%. Используется искусственное освещение в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может применяться стандартная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Очень важно, чтобы животные получали необходимое количество аскорбиновой кислоты.

Подготовка животных

4.1.3. Адаптация к лабораторным условиям осуществляется в течение не менее 5 дней до начала испытания. Перед испытанием животных случайным образом распределяют в тестовые группы. В зависимости от метода испытания для удаления шерсти используется срезание, бритье или химическая депиляция. Шерсть удаляют аккуратно, избегая повреждений кожного покрова. Животных взвешивают до начала и в конце испытания.

Проверка на достоверность

4.1.4. Чувствительность и надежность используемой экспериментальной техники должны оцениваться каждые шесть месяцев с помощью стандартных веществ, обладающих легким и умеренным сенсибилизирующим действием.

4.1.5. В правильно проведенном испытании для легких/умеренных сенсибилизаторов должны наблюдаться отклики: как минимум 30% для адъювантного теста и не менее 15% для неадъювантного. В качестве стандартных веществ используют предпочтительно гексилциннамальдегид (CAS N 101-86-0), меркаптобензотиазол (CAS N 149-30-4) и бензокаин (CAS N 94-09-7). При определенных обстоятельствах могут использоваться другие контрольные вещества, удовлетворяющие приведенным критериям, с соответствующим обоснованием.

Удаление исследуемого вещества

4.1.6. Для удаления исследуемого вещества используют воду или растворитель, не влияющий на полученную реакцию и целость кожного покрова.

4.2. Максимизационный тест на морских свинках (GPMT)

Количество животных

4.2.1. Группа, подвергающаяся воздействию, должна содержать как минимум 10 животных, контрольная группа - 5. При использовании менее 20 тестовых и 10 контрольных морских свинок невозможно сделать вывод о том, является ли вещество сенсибилизатором, поэтому строго рекомендуется исследование дополнительных животных для получения как минимум 20 тестовых и 10 контрольных животных.

Уровни доз

4.2.2. Концентрация исследуемого вещества для индукционной экспозиции должна быть хорошо физиологически переносимой и максимально вызывающей легкое/умеренное раздражение кожи. Концентрация в провокационной экспозиции должна быть максимально не вызывающей раздражение. Подходящие концентрации должны быть определены в предварительном испытании на 2-3 животных, если другая информация отсутствует. Для этой цели предпочтение должно быть отдано ПАФ-обработанным животным.

5. Индукционная экспозиция

5.1. Подкожные инъекции

День 0 - исследуемая группа

5.1.1. Три пары подкожных инъекций объемом 0,1 мл должны быть введены в плечевую область, очищенную от шерсти таким образом, чтобы инъекции были по обе стороны срединной линии.

Инъекция 1: а 1:1 смесь (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

Инъекция 2: исследуемое вещество в подходящем растворителе в выбранной концентрации.

Инъекция 3: исследуемое вещество в выбранной концентрации в смеси 1:1 (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

В инъекции 3 растворимые в воде вещества до смешивания с ПАФ растворяют в воде. Жирорастворимые или нерастворимые вещества до перемешивания с водой растворяют в ПАФ. Конечная концентрация исследуемого вещества должна быть равной концентрации в инъекции 2.

Инъекции 1 и 2 вводят близко друг другу и к голове животного, в то время как инъекцию 3 вводят ближе к хвостовой части тестовой области.

День 0 - контрольная группа

5.1.2. Три пары подкожных инъекций объемом 0,1 мл вводят в одно и то же место животным, не подвергшимся обработке.

Инъекция 1: а 1:1 смесь (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

Инъекция 2: неразбавленный растворитель.

Инъекция 3: а 50% растворитель в 1:1 смеси (по объему) ПАФ/вода или физиологический раствор.

5.2. Местная аппликация

День 5-7 - тестовая и контрольная группы

5.2.1. Примерно за 24 часа до нанесения вещества, если вещество не является раздражающим для кожи, тестовая область после стрижки или бритья обрабатывается 0,5 мл 50%-м натрий-лаурилсульфатом в вазелине для того, чтобы вызвать местное раздражение.

День 6-8 - тестовая группа

5.2.2. С тестовой области снова удаляется шерсть. Фильтровальная бумага (2x4 см) полностью заполняется исследуемым веществом в подходящем растворителе и накладывается на тестовую область и находится в контакте с кожей под герметичной повязкой в течение 48 часов. Выбор растворителя должен быть обоснован. Твердые вещества измельчаются и помещаются в подходящий растворитель. Жидкости при необходимости можно наносить неразбавленными.

День 6-8 - контрольная группа

5.2.3. С тестовой области снова удаляется шерсть. На тестовую область наносится только растворитель аналогичным способом и остается в контакте с кожей под герметичной повязкой в течение 48 часов.

5.3. Провокационная экспозиция: местная аппликация

День 20-22 - тестовая и контрольная группы

5.3.1. С боков тестовых и контрольных животных удаляется шерсть. Пластырь, заполненный тестовым веществом, накладывается на один бок животного и, если необходимо, пластырь, заполненный растворителем, также может быть наложен на другой бок. Пластырь удерживается в контакте с кожей под герметичной повязкой в течение 24 часов.

5.4. Наблюдения

5.4.1. Тестовая и контрольная группы:

- через 21 час после удаления пластыря контрольная область очищается, коротко остригается, бреется или, если необходимо, депилируется;

- через 3 часа (примерно через 48 часов с начала контрольного нанесения) кожная реакция наблюдается и регистрируется в соответствии с классификацией, приведенной ниже;

- через 24 часа после данного наблюдения (72 часа) проводится второе наблюдение, и снова регистрируется реакция.

5.4.2. Приветствуется независимая оценка тестовых и контрольных групп.

Шкала Магнуссона - Клигмана для оценки реакций в провокационном тесте

0 - Никаких видимых изменений

1 - Мелкоочаговая или неоднородная эритема

2 - Умеренная и сплошная эритема

3 - Интенсивная эритема и отек

5.5. Повторная обработка

5.5.1. Если необходимо прояснить результаты, полученные на первом контроле, второй контроль, если необходимо с новой контрольной группой, должен быть проведен примерно через неделю после первого. Повторный контроль также может быть проведен и с первой контрольной группой.

5.6. Клинические наблюдения

5.6.1. Все кожные реакции и другие наблюдения, включая соматические реакции, являющиеся результатом индукционных и провокационных экспозиций, должны наблюдаться и регистрироваться. Другие исследования, например гистопатологическое, измерение толщины кожных складок, могут быть проведены для прояснения сомнительных результатов.

6. Тест Бюхлера

6.1. Количество животных

6.1.1. В тестовой группе используется как минимум 20 животных, в контрольной - как минимум 10.

6.2. Уровни доз

6.2.1. Концентрация исследуемого вещества для каждой индукционной экспозиции должна быть максимально возможной, вызывающей слабое раздражение. Концентрация, используемая в провокационной экспозиции, должна быть максимальной, не вызывающей раздражение. Подходящие концентрации определяют в предварительном тесте с использованием 2-3 животных, если другая информация отсутствует.

6.2.2. Для растворимых веществ необходимо использовать воду или не вызывающий раздражение раствор ПАВ в качестве растворителя. Для других исследуемых веществ 80% смесь этанола/воды, подходящую для индукционной экспозиции, ацетон - для провокационной.

6.3. Индукционная экспозиция: местное нанесение

День 0 - тестовая группа

6.3.1. С одного бока животного удаляется (коротко остригается) шерсть. Тестовый пластырь должен быть полностью заполнен исследуемым веществом в подходящем растворителе (выбор растворителя должен быть обоснован, жидкие исследуемые вещества можно наносить неразбавленными, если возможно). Исследуемое вещество накладывается на тестовую область и удерживается в контакте с кожей герметичной повязкой или пластырем в течение 6 часов.

6.3.2. Тестовая система должна быть герметичной. Подходит ватный диск, круглый или квадратный, размером примерно 4-6 . Для гарантии герметичности предпочтительно использовать фиксацию подходящей повязкой. Если используется манжета, то может потребоваться дополнительная экспозиция.

День 0 - контрольная группа

6.3.4. На одном боку животного удаляется (коротко остригается) шерсть. На кожу тем же путем, что и для тестовой группы, наносится только растворитель. Тестовая система удерживается в контакте с кожей герметичным пластырем или подходящей повязкой в течение 6 часов. Если будет показано, что фиктивная контрольная группа не нужна, могут использоваться животные, не подвергавшиеся обработке.

День 6-8 и 13-15 - тестовая и контрольная группы

6.3.5. На 6-8, а потом на 13-15 дни та же тестовая область того же бока животного (шерсть удаляется, если необходимо) обрабатывается тем же способом, что и в 0 день.

6.4. Провокационная экспозиция

День 27-29 - тестовая и контрольная группы

6.4.1. С необработанного бока животных тестовой и контрольной групп удаляется (коротко остригается) шерсть. На заднюю часть необработанного бока животных тестовой и контрольной групп накладывается повязка, содержащая необходимое количество исследуемого вещества в максимально возможной концентрации не вызывающей раздражение. Если необходимо, то повязка или пластырь с растворителем также накладываются на переднюю часть необработанного бока животных тестовой и контрольной групп. Пластырь удерживается герметичной повязкой в контакте с кожей в течение 6 часов.

6.5. Наблюдения

6.5.1. Тестовая и контрольная группы:

- через 21 час после удаления пластыря с контрольной области удаляется шерсть;

- через 3 часа (примерно через 30 часов после наложения контрольного пластыря) наблюдаются кожные реакции и регистрируются в соответствии с классификацией, приведенной для максимизационного теста;

- через 24 часа после осмотра на 30-м часе (примерно через 54 часа после наложения контрольного пластыря) кожные реакции вновь наблюдаются и регистрируются.

6.5.2. Приветствуется независимая оценка тестовых и контрольных групп.

6.6. Повторная обработка

6.6.1. Если необходимо прояснить результаты, полученные на первом контроле, второй контроль, если необходимо, с новой контрольной группой, должен быть проведен примерно через неделю после первого. Повторный контроль также может быть проведен и с первой контрольной группой.

6.7. Клинические наблюдения

6.7.1. Все кожные реакции и другие наблюдения, включая соматические реакции, являющиеся результатом индукционных и провокационных экспозиций, должны наблюдаться и регистрироваться. Другие исследования, например гистопатологическое, измерение толщины кожных складок, могут быть проведены для прояснения сомнительных результатов.

7. Данные и отчет о проведении испытания (GPMT и тест Бюхлера)

7.1. Данные

7.1.1. Данные должны быть представлены в табличной форме с указанием кожных реакций для каждого животного в каждом наблюдении.

7.2. Отчет о проведении испытания

Отчет о проведении испытания должен содержать следующую информацию.

Исследуемое вещество:

- физическая природа и, при необходимости, физико-химические свойства;

- данные идентификации.

Растворитель:

- обоснование выбора растворителя.

Экспериментальные животные:

- группа/вид используемых морских свинок;

- количество, возраст и пол животных;

- источник животных, условия содержания, диета и т.д.;

- индивидуальная масса тела животных в начале эксперимента.

Условия проведения испытания:

- процедура подготовки тестовой области;

- процедура подготовки и нанесения пластыря;

- результаты предварительного исследования с заключением об индукционной и провокационной концентрациях, которые необходимо использовать в тесте;

- подробности приготовления тестового вещества, его нанесения и удаления;

- концентрация растворителя и исследуемого вещества, которые используются в индукционном и контрольном тестах, и общее количество вещества, нанесенного на стадии эксперимента и контроля.

Проверка достоверности:

- обзор результатов последней проверки достоверности, включая информацию об исследуемом веществе, концентрации и растворителе.

Результаты:

- результаты по каждому животному в соответствии с классификацией;

- описание природы и степени наблюдаемых реакций;

- любые результаты гистопатологических исследований.

7.3. Обсуждение результатов

Если перед проведением исследований предварительное испытание выполнялось на морских свинках, то должны быть предоставлены описание или ссылка на нее, включая сведения о тестовой процедуре и результаты, полученные для исследуемого и стандартного веществ.