Приложение 6.8.9. Генетическая токсикология: Метод оценки генных мутаций на Saccharomyces cerevisiae

Приложение 6.8.9

Генетическая токсикология: Метод оценки генных мутаций на Saccharomyces cerevisiae

Идентичен международному документу OECD TG N 480 "Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay" (ОЭСР Руководство N 480 "Генетическая токсикология: Метод оценки генных мутаций на Saccharomyces cerevisiae"). Принят 23 октября 1986 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в тесте оценки генных мутаций на Saccharomyces cerevisiae.

1.2. Метод используется для оценки генных мутаций у дрожжей, эукариотического микроорганизма. Были разработаны штаммы Saccharomyces cerevisiae, которые выявляют прямые или обратные мутации (замены пар оснований или сдвига рамки считывания).

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Для оценки образования генных мутаций, индуцируемых химическими соединениями, используют ряд гаплоидных и диплоидных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

3.2. Могут быть использованы системы оценки прямых мутаций на гаплоидных штаммах, например, анализ мутаций от красных, аденинзависимых мутантов (ade-1, ade-2) к двойным аденинзависимым белым мутантам, или селективные системы, такие как индукция резистентности к канаванину и циклогексемиду.

3.3. Наиболее полно валидизированная система оценки обратных мутаций включает использование гаплоидного штамма XV 185-14С, который несет охра нонсенс (Ochre nonsense) мутации ade 2-1, are 4-17, lvs 1-1 и trp 5-48, которые ревертируются мутагенами, индуцирующими мутации замены пар оснований, вызывая сайт-специфические мутации или мутации ochre супрессии. XV 185-14С также несет his 1-7 маркер, миссенс мутацию, которая ревертируется в основном мутациями во вторичных точках, и маркер hcm 3-10, который ревертируется фраймшифт-мутагенами.

3.4. Из диплоидных штаммов используется только штамм , который гомозиготен по ilv 1-92.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Исследуемые соединения

4.1.1. Растворы исследуемого соединения и положительного контроля следует готовить непосредственно перед тестированием, используя, когда это необходимо, соответствующий растворитель. Конечная концентрация растворителя не должна значимо влиять на клеточную выживаемость и характеристики роста.

Тест штаммы

4.1.2. Гаплоидный штамм XV 185-14С и диплоидный штамм наиболее широко используются в опытах по оценке генных мутаций. Другие штаммы также применимы.

Среды

4.1.3. Соответствующие культуральные среды используются для оценки клеточной выживаемости и частоты мутаций.

Метаболическая активация

4.1.4. Клетки обрабатывают исследуемым веществом как в присутствии, так и в отсутствии соответствующей экзогенной системы метаболической активации.

4.1.5. Наиболее широко используется система, включающая постмитохондриальную фракцию печени грызунов, которых обработали ферментиндуцирующими соединениями, и кофакторы. Использование других видов животных, других тканей и постмитохондриальных фракций или других методик также допустимо.

4.2. Условия испытания

Концентрации соединений

4.2.1. Следует использовать, по крайней мере, 5 концентраций в адекватном диапазоне. Среди факторов, которые необходимо принимать во внимание, наиболее важны цитотоксичность и растворимость. Наивысшая концентрация не должна влиять на клеточную выживаемость. Для токсичных соединений наивысшая концентрация не должна снижать выживаемость более, чем на 5-10%. Плохо растворимые в воде соединения следует тестировать в пределах их растворимости, используя соответствующие методики. Для легко растворимых в воде соединений наивысшая концентрация определяется в каждом конкретном случае.

Частота спонтанных мутаций

4.2.2. Следует использовать только субкультуры с частотой спонтанных мутаций в пределах нормальных колебаний.

Число повторов

4.2.3. Следует использовать по крайней мере 3 чашки на концентрацию для оценки генных мутаций к прототрофности и для оценки выживаемости. В экспериментах, использующих маркеры такие как hom 3-10, число чашек должно быть увеличено, чтобы получить статистически значимые данные.

Контроли

4.2.4. В каждый эксперимент должны быть включены положительные контроли с прямо действующими мутагенами и веществами, требующими метаболическую активацию. Следует ставить контроль с растворителем. Примеры соединений, которые могут использоваться как положительный контроль:

- метилметансульфонат, этилметансульфонат, 4-нитрохинолин-N-оксид (прямодействующие мутагены);

- N-нитрозодиметиламин, циклофосфамид (мутагены непрямого действия);

- IСR-170 (прямодействующий фраймшифт-мутаген).

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. Обработку Saccharomyces cerevisiae обычно проводят в жидкой среде, используя стационарные или растущие клетки. Первый опыт следует проводить на растущих клетках. клеток экспонируют с исследуемым веществом до 18 ч при 28-37°С, проводя встряхивание. Для опытов с метаболической активацией в смесь добавляют адекватное количество метаболической системы. По окончании экспозиции веществом клетки центрифугируют, отмывают и делают посев на соответствующую культуральную среду. После инкубации в течение 4-7 дней при 28-30°С в темноте на чашках проводят подсчет колоний для анализа выживаемости и индукции генных мутаций.

4.3.2. Если первый опыт дал отрицательный результат, следует провести второй опыт, используя клетки в стационарной фазе. Если в первом опыте получен положительный результат, это подтверждается соответствующим независимым опытом.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в табличной форме, указывая число подсчитанных колоний, число мутантов, выживаемость и частоту мутаций.

5.1.2. Обработку данных проводят соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.3. Существуют разные критерии определения положительного результата, один из которых - статистически значимое повышение числа мутантов, также как и частоты мутаций, с увеличением дозы.

5.1.4. Другой критерий основан на получении воспроизводимого и статистически значимого положительного ответа, по крайней мере, на одной концентрации исследуемого соединения.

5.1.5. Соединение, которое не показало ни статистически значимого возрастания частоты мутаций с увеличением дозы, ни статистически значимого воспроизводимого положительного ответа в любой из испытанных концентраций, считается немутагеном в данной тест-системе.

5.2. Отчет

Отчет должен содержать следующую информацию:

- использованные штаммы;

- условия опыта: стационарные или растущие клетки, состав среды, температура и продолжительность инкубации, система метаболической активации;

- условия обработки, уровни экспозиции, процедура и длительность обработки, температура при экспозиции, положительные и отрицательные контроли;

- подсчитанное число колоний, число мутантов, выживаемость и частота мутантов, зависимость доза-эффект (если есть), данные статистической обработки результатов;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.