Приложение 6.2.4. Оценка субхронической токсичности при накожном поступлении в 90-дневном исследовании

Приложение 6.2.4

Оценка субхронической токсичности при накожном поступлении в 90-дневном исследовании

Идентичен международному документу OECD Test N 411 "Subchronic Dermal Toxicity: 90-day Study" (ОЭСР Тест N 411 "Субхроническая кожная токсичность: 90-дневное исследование"). Принят 12 мая 1981 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию субхронической кожной токсичности химических веществ.

1.2. Метод обеспечивает получение информации о токсичности вещества при накожном пути поступления при повторном воздействии.

2. Общие положения

2.1. Указанный метод исследования предназначен для изучения субхронической кожной токсичности химических веществ в целях получения информации о воздействии на организм человека в результате повторного нанесения на кожу в течение 90 дней.

2.2. При оценке токсичных свойств химического вещества определение субхронической кожной токсичности может быть проведено после получения исходной информации о токсичности в ходе испытания острой токсичности. Исследование острой токсичности предоставляет информацию о возможных опасностях для здоровья, которые могут возникнуть в результате повторной экспозиции на кожу в течение ограниченного периода времени.

3. Описание метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество наносится ежедневно на кожу в отмеренных дозах нескольким группам экспериментальных животных, одна доза на группу, в течение периода 90 дней.

3.1.2. Необходимы следующие сведения об исследуемом веществе:

- агрегатное состояние: твердое или жидкое;

- химическая идентификация исследуемого вещества;

- чистота (примеси) исследуемого вещества;

- характеристики растворимости;

- pH (при необходимости);

- стабильность, включая стабильность в растворителе, при использовании;

- точка плавления/точка кипения.

3.1.3. В течение периода нанесения животные наблюдаются ежедневно для выявления признаков токсичности. Животные, которые погибают во время эксперимента, подвергаются аутопсии. В конце испытания выживших животных умерщвляют и также подвергают аутопсии.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Для проведения испытания следует использовать половозрелых крыс (с массой тела 200-300 г), кроликов (с массой тела 2,0-3,0 кг) или морских свинок (с массой тела 350-450 г). В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

3.2.2. В случае если субхроническое исследование кожной токсичности проводится перед долгосрочным исследованием, следует в обоих исследованиях использовать животных одной породы и одного и того же происхождения.

Подготовка

3.2.3. Следует использовать животных обоих полов. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. При испытании каждой дозы следует использовать, по крайней мере, 20 животных (10 самок и 10 самцов) со здоровой кожей.

3.2.4. Если предполагается промежуточное умерщвление животных, то количество животных в группах должно быть увеличено на число планируемых к забою животных. Также может быть составлена дополнительная (вспомогательная) группа из 20 животных (по 10 животных каждого пола) которая будет подвергнута воздействию дозой высокого уровня в течение 90 дней с последующим наблюдением в течение не менее 28 дней после завершения нанесения вещества для контроля обратимости и стойкости изменений появления отдаленных токсических эффектов.

3.2.5. Здоровых молодых половозрелых животных акклиматизируют к лабораторным условиям, по крайней мере, в течение 5 дней до испытания. Перед испытанием животные распределяются на экспериментальную и контрольную группы в произвольном порядке. Волосяной покров спинной области туловища экспериментальных животных должен быть удален незадолго до начала испытания. Шерсть может быть выбрита, но производить бритье следует приблизительно за 24 ч до начала испытания. Повторная стрижка или бритье должны производиться еженедельно. При стрижке или бритье волосяного покрова необходимо соблюдать осторожность во избежание повреждений кожи, могущих повлиять на ее проницаемость, за исключением случаев, когда это предусмотрено методикой испытания. Должно быть очищено не менее 10 процентов площади поверхности тела. Для принятия решения о том, какая площадь кожи должна быть очищена от волосяного покрова и каковы должны быть размеры участка для нанесения вещества, следует учитывать массу животного. При тестировании твердых веществ, которые можно растереть в порошок, их следует измельчить, причем исследуемое вещество должно быть достаточно увлажнено водой или подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании растворителя следует учитывать его влияние на проницаемость кожи для исследуемого вещества. Жидкие исследуемые вещества обычно используются неразбавленными.

Содержание

3.2.6. Животных следует содержать в клетках отдельно. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять для грызунов или для кроликов, оптимальный уровень относительной влажности - 30-70%. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания с неограниченным потреблением питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме: 12 ч при свете/12 ч в темноте.

3.3. Группы доз и дозировка

3.3.1. Следует использовать не менее трех опытных групп (трех уровней доз), одну контрольную группу, которая не должна подвергаться воздействию исследуемого вещества, при необходимости - контрольную группу с нанесением растворителя. За исключением нанесения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться тем же способом, что и с экспериментальными группами.

3.3.2. Самый высокий уровень дозы должен привести к токсическим эффектам, но не вызывать смертельных исходов, которые могут препятствовать обоснованной оценке. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать никаких признаков интоксикации. В том случае, если есть приемлемая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать ее. Средний уровень дозы, в идеале, должен вызвать минимальные видимые токсические эффекты. Если используются более, чем одна промежуточная доза, их уровни должны быть распределены так, чтобы можно было произвести градацию токсических эффектов. В группе с малым уровнем дозы, в промежуточных и контрольных группах число смертельных исходов должно быть низким, чтобы обеспечить значимую (статистически достоверную) оценку результатов.

3.3.3. Если при нанесении исследуемое вещество вызывает сильное раздражение кожи, его концентрация может быть уменьшена, хотя это может привести к снижению или отсутствию других токсических эффектов при дозе высокого уровня. Однако, при сильном повреждении кожи в начале исследования, может возникнуть необходимость прекратить испытание и провести новое исследование при более низких концентрациях.

3.3.4. Пороговый тест. Если при испытании одного уровня дозы составляющего не менее 1 000 мг/кг массы тела (при том, что ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования дозы более высокого уровня), с использованием процедур, описанных для данного исследования, не выявлено видимых токсических эффектов, и если токсичность исследуемого вещества является маловероятной на основании данных, полученных для соединений близких по структуре, то полное исследование с использованием трех уровней доз не является необходимым.

3.4. Методика проведения исследования

3.4.1. Животных обрабатывают исследуемым веществом не менее 6 ч в день в течение 7 дней в неделю на протяжении 90 дней. Однако, исходя, прежде всего, из практических соображений, считается приемлемым нанесение вещества 5 дней в неделю. Животных вспомогательной группы, предусмотренной для последующих наблюдений, выдерживают в течение по меньшей мере 28 дней после эксперимента, чтобы выявить способность к восстановлению или стойкость токсических эффектов.

3.4.2. Исследуемое вещество следует наносить равномерно на участок, составляющий примерно 10 процентов от общей площади поверхности тела. При использовании высокотоксичных веществ поверхность участка для нанесения вещества может быть меньше, но большая часть его должна быть покрыта тонкой и равномерной пленкой насколько это возможно.

3.4.3. Между нанесениями исследуемого вещества, оно должно контактировать с кожей посредством пористой марлевой повязки, зафиксированной не вызывающей раздражения лентой. Участок тела, через который воздействует исследуемое вещество, должен быть покрыт способом, позволяющим удерживать испытуемое вещество, на которое сверху наложена марлевая повязка, и не позволяющим животным проглотить испытываемое вещество. Можно использовать ограничители движения для препятствия слизыванию вещества, но полная иммобилизация не рекомендуется.

3.4.4. Если наблюдаются признаки токсичности, они должны быть зарегистрированы, фиксируются время их выявления, степень и продолжительность. Наблюдения за животными должны включать: изменения кожи и волосяного покрова, глаз и слизистых оболочек, а также органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервной системы, соматомоторной деятельности и модели поведения, но не ограничиваться только этим. Измерения потребления пищи и взвешивание животных следует проводить еженедельно. Регулярное наблюдение за животными необходимо, чтобы гарантировать, что животное не выбыло из исследования по причине каннибализма, аутолиза тканей или дистопии. При завершении исследования всех выживших животных не вспомогательных, экспериментальных групп умерщвляют. При обнаружении умирающих животных они должны быть удалены и умерщвлены.

3.5. Наблюдение

3.5.1. По крайней мере, один раз в день должен быть проведен тщательный клинический осмотр. Дополнительные наблюдения следует проводить ежедневно, принимая необходимые меры для минимизации потери животных при исследовании, например, аутопсию или охлаждение животных, найденных мертвыми, и изоляция или умерщвление слабых или умирающих животных.

3.6. Офтальмологический осмотр

3.6.1. Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента, нужно провести до нанесения исследуемого вещества и по окончании исследования, предпочтительно у всех животных, но, по меньшей мере, в группе, получающей высокую дозу, и в контрольной группе. Если обнаружены изменения глаз, нужно исследовать всех животных.

3.7. Гематология и клиническая биохимия

3.7.1. Считается, что для всех исследований следует провести оценку баланса электролитов, метаболизма углеводов, печеночной и почечной функции.

3.7.2. Для всех животных при завершении исследования должны быть выполнены гематологическое исследование с определением гематокрита, концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, общего и дифференциального количества лейкоцитов, а также величины потенциала свертывания, таких как время свертывания крови, протромбиновое время, тромбопластиновое время или количество тромбоцитов и биохимическое исследование крови, при котором достаточным является определение параметров крови, характеризующих функции печени и почек.

3.7.3. Выбор специальных исследований будет зависеть от наблюдения за механизмом действия вещества. Предполагаемый перечень таких исследований: измерения уровней кальция, фосфора, хлора, натрия, калия, уровня глюкозы натощак (с периодами голодания для соответствующих видов); определение глутаминовой пировиноградной трансаминазы сыворотки (аланинаминотрансфераза сыворотки), глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы сыворотки (аспартатаминотрансфераза сыворотки), орнитиндекарбоксилазы, гамма-глутамилтранспептидазы, азота мочевины, белка, креатинина крови, общего билирубина и общего белка сыворотки.

3.7.4. Другие исследования, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина, активности холинэстеразы. При необходимости расширить исследования наблюдаемых эффектов может быть проведен дополнительный клинический биохимический анализ.

3.7.5. Анализ мочи требуется производить в случаях, когда есть показание, основанное на ожидаемой или наблюдаемой токсичности.

3.7.6. Если исторических исходных данных недостаточно, то перед началом дозирования следует уделить внимание определению гематологических и клинических биохимических показателей

4. Патология

4.1. Макроскопическая аутопсия

4.1.1. Все животные в исследовании должны быть подвергнуты полной макроскопической аутопсии, которая включает в себя осмотр внешней поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Печень, почки, надпочечники и яички должны быть взвешены влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Следующие органы и ткани должны быть сохранены в подходящей среде для дальнейшего проведения возможной гистопатологической экспертизы: все большие поврежденные органы, мозг, включая части продолговатого мозга/варолиева моста, мозжечковую кору и мозговую кору, гипофиз, щитовидная/паращитовидная железа, тимус, (трахея), легкие, сердце, аорта, слюнные железы, печень, селезенка, почки, надпочечники, поджелудочная железа, гонады, придаточные половые органы, желчный пузырь, пищевод, желудок, двенадцатиперстная кишка, тощая кишка, подвздошная кишка, слепая кишка, ободочная кишка, прямая кишка, мочевой пузырь, представительный лимфатический узел, (молочная железа самок), (мускулатура бедра), периферийный нерв, (глаза), (грудина с костным мозгом), (бедро, в том числе суставная поверхность), (спинной мозг в трех уровнях - шейном, среднегрудинном и поясничном) и (слезные железы). Ткани, упомянутые в скобках, исследуются в случаях наличия признаков токсичности или если это орган-мишень.

4.2. Гистопатология

4.2.1. Гистологическое исследование должно быть выполнено на нормальной коже и коже, подвергнувшейся воздействию, и на органах и тканях животных группы с высоким уровнем дозы и контрольной группы. Эти исследования могут быть распространены на животных групп с другими дозами, при необходимости, чтобы исследовать изменения, наблюдаемые в группах с высоким уровнем дозы.

4.2.2. Должны быть исследованы все макроскопические повреждения.

4.2.3. Органы-мишени должны быть исследованы во всех группах.

4.2.4. В случае использования крыс, нужно подвергнуть гистологическому осмотру легкие животных в группах с низкой и промежуточной дозой для выявления признаков инфекции, так как это обеспечивает надежную оценку состояния здоровья животных. Дальнейших гистопатологических исследований на обычной основе для животных в этих группах не требуется, но должны всегда осуществляться в органах, где выявлены признаки повреждений в группе с высокой дозой.

4.2.5. Животных вспомогательной группы следует обследовать гистологически, особо обращая внимание на те органы и ткани, в которых выявлены эффекты воздействия вещества в других экспериментальных группах.

5. Данные и отчет

5.1. Данные об исследовании

5.1.1. Данные могут быть представлены в табличной форме с указанием для каждой экспериментальной группы количества животных на начало испытания; количества животных, имеющих поражения; тип поражений и процент животных с каждым видом поражения.

5.1.2. Все наблюдаемые результаты, количественные и случайные, должны быть оценены соответствующим статистическим методом. Может быть использован любой общепринятый статистический метод. Статистические методы должны быть выбраны в ходе планирования исследования.

5.1.3. Результаты исследования субхронической токсичности при накожном поступлении следует оценивать совместно с результатами предыдущих исследований и рассматривать с точки зрения наблюдаемых токсических эффектов и результатов аутопсии и гистопатологических исследований. Оценка будет включать отношение между дозой исследуемого вещества и наличием или отсутствием, частотой и выраженностью нарушений, в том числе поведенческих и клинических нарушений, макроскопических повреждений, идентифицированных органов-мишеней, изменений массы тела, смертности и любых других общих или специфических токсических эффектов. Должным образом проведенное исследование субхронической токсичности должно обеспечить достаточную оценку уровня, при котором не наблюдается эффект.

5.1.4. Данное исследование кожной токсичности предоставляет информацию о последствиях повторяющегося воздействия на кожу того или иного вещества. Экстраполяция результатов исследования на человека действует в ограниченной степени, но она может дать полезную информацию о степени резорбции вещества через кожу, уровнях, при которых не наблюдается эффект, и уровнях допустимого воздействия на человека.

5.2. Отчет об исследовании

Отчёт об исследовании должен содержать следующую информацию:

- используемые виды/линии;

- данные о токсической реакции в зависимости от пола и дозы;

- время смерти в ходе исследования или количество животных, доживших до окончания эксперимента;

- токсические или другие эффекты;

- характер, точность и продолжительность наблюдений за каждым признаком нарушения и его последующее развитие (были выявленные изменения промежуточными или постоянными);

- данные о питании и массе тела животных;

- выполненные гематологические испытания и результаты по сравнению с исходными данными;

- выполненные клинические биохимические испытания и результаты по сравнению с исходными данными;

- данные аутопсии;

- подробное описание всех гистологических данных;

- статистическая обработка результатов (в случае необходимости).