Приложение 6.8.10. Генетическая токсикология: Метод оценки митотической рекомбинации на Saccharomyces cerevisiae

Приложение 6.8.10

Генетическая токсикология: Метод оценки митотической рекомбинации на Saccharomyces cerevisiae

Идентичен международному документу OECD TG N 481 "Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Mitotic Recombination Assay" (ОЭСР Руководство N 481 "Генетическая токсикология: Метод оценки митотической рекомбинации на Saccharomyces cerevisiae"). Принят 23 октября 1986 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Метод используется для анализа митотической рекомбинации (генная конверсия или кроссинговер) у дрожжей, эукариотического организма. Были разработаны штаммы Saccharomyces cerevisiae, которые выявляют эти события путем образования гомозиготных аллелей из гетерозиготных аллелей. Эти рекомбинации по существу являются обменами ДНК между участками гомологичных хроматид. Метод дает информацию о неспецифических повреждениях ДНК.

2. Общие положения

2.1. По изучаемому соединению представляют следующие данные:

- твердое, жидкое, парообразное или газообразное вещество;

- химическая идентификация вещества;

- чистота (примеси) вещества;

- растворимость;

- температура плавления/кипения вещества;

- рН (где необходимо);

- давление паров (если имеются данные).

3. Принцип метода

3.1. Митотический кроссинговер и митотическую генную конверсию можно исследовать на Saccharomyces cerevisiae.

3.2. Кроссинговер обычно оценивают по образованию гомозиготных рецессивных колоний или секторов, возникающих у гетерозиготных штаммов, тогда как генную конверсию - по образованию прототрофных ревертантов, возникающих в ауксотрофных гетероаллельных штаммах, несущих два разных дефектных аллеля одного гена. Для оценки митотической генной конверсии наиболее часто используют штаммы (гетероаллели по ade 2 и trp 5), (гетероаллели по arg 4), (гетероаллели по trp 5) и (гетероаллели по his 4 и trp 5). Митотический кроссинговер, выявляемый по образованию красных и розовых гомозиготных секторов, оценивают на штаммах или (который также позволяет оценивать генную конверсию и обратные мутации в ilv 1-92). Оба штамма - гетероаллели по локусу ade 2.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Исследуемые соединения

4.1.1. Растворы исследуемого соединения и положительного контроля следует готовить непосредственно перед тестированием, используя, когда это необходимо, соответствующий растворитель. Конечная концентрация растворителя не должна значимо влиять на клеточную выживаемость и характеристики роста.

Тест-штаммы

4.1.2. Наиболее часто используют диплоидные штаммы , , и . Также могут быть использованы другие штаммы.

Среды

4.1.3. Соответствующие культуральные среды используют для оценки клеточной выживаемости и митотической рекомбинации.

Метаболическая активация

4.1.4. Клетки обрабатывают исследуемым веществом в присутствии и в отсутствии соответствующей экзогенной системы метаболической активации.

4.1.5. Наиболее широко используется система, включающая постмитохондриальную фракцию печени грызунов, которых обработали фермент-индуцирующими соединениями, и кофакторы. Использование других видов животных, других тканей и постмитохондриальных фракций или других методик также допустимо.

4.2. Условия испытания

Концентрации соединений

4.2.1. Следует использовать по крайней мере 5 концентраций в адекватном диапазоне. Среди факторов, которые необходимо принимать во внимание, наиболее важны цитотоксичность и растворимость. Наименьшая концентрация не должна влиять на клеточную выживаемость. Для легко растворимых в воде соединений наивысшая концентрация определяется в каждом конкретном случае. Для токсичных соединений наивысшая концентрация не должна снижать выживаемость более чем на 5-10%. Плохо растворимые в воде соединения следует тестировать в пределах их растворимости, используя соответствующие методики.

Спонтанная частота митотической рекомбинации

4.2.2. Следует использовать только субкультуры, в которых частота митотических рекомбинаций находится в пределах нормальных колебаний.

Число повторов

4.2.3. Следует использовать минимум 3 чашки на концентрацию для оценки прототрофов, индуцированных генной конверсией, и для оценки выживаемости. При анализе рецессивных гомозигот, индуцированных митотическим кроссинговером, число чашек следует увеличить, чтобы получить адекватное число колоний.

Контроли

4.2.4. В каждый эксперимент должны быть включены положительные контроли с прямо действующими мутагенами и веществами, требующими метаболическую активацию. Следует ставить контроль с растворителем. Примеры соединений, которые могут использоваться как положительный контроль:

- метилметансульфонат, этилметансульфонат, 4-нитрохинолин-N-оксид (прямодействующие мутагены);

- циклофосфамид (мутаген непрямого действия).

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. Обработку Saccharomyces cerevisiae обычно проводят в жидкой среде, используя стационарные или растущие клетки. Первый опыт следует проводить на растущих клетках. клеток экспонируют с исследуемым веществом до 18 часов при 28-37°С, проводя встряхивание. Для опытов с метаболической активацией во время экспозиции веществом в смесь добавляется адекватное количество метаболической системы. По окончании экспозиции веществом клетки центрифугируют, отмывают и делают посев на соответствующую культуральную среду.

4.3.2. После инкубации в течение 4-7 дней при 28-30°С в темноте на чашках анализируют выживаемость и индукцию митотической рекомбинации. Чашки, в которых учитывают красные и розовые гомозиготные сектора, образующиеся в результате митотического кроссинговера, следует держать 1-2 дня в холодильнике (4°С) перед анализом, чтобы дать возможность развиться соответствующим пигментным колониям.

4.3.3. Если первый опыт дал отрицательный результат, следует провести второй опыт, используя клетки в стационарной фазе. Если в первом опыте получен положительный результат, это подтверждается соответствующим независимым опытом.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные следует представлять в табличной форме, указывая число подсчитанных колоний, число рекомбинантов, выживаемость и частоту рекомбинаций.

5.1.2. Обработку данных проводят соответствующими статистическими методами.

Оценка результатов

5.1.3. Существуют разные критерии определения положительного результата. Один из них - статистически значимое возрастание числа рекомбинантов с увеличением дозы.

5.1.4. Другой критерий основан на получении воспроизводимого и статистически значимого положительного ответа, по крайней мере на одной концентрации исследуемого соединения.

5.1.5. Соединение, которое не показало ни статистически значимого возрастания числа рекомбинантов с увеличением дозы, ни статистически значимого воспроизводимого положительного ответа в любой из испытанных концентраций, считается не вызывающим ДНК рекомбинацию в данной тест-системе.

5.2. Отчет

5.2.1. Отчет должен содержать следующую информацию:

- использованные штаммы;

- условия опыта: стационарные или растущие клетки, состав среды, температура и продолжительность инкубации, система метаболической активации;

- условия обработки, уровни экспозиции, процедура и длительность обработки, температура при экспозиции, положительные и отрицательные контроли;

- подсчитанное число колоний, число рекомбинантов, выживаемость и частоту рекомбинаций, зависимость доза-эффект (если есть), данные статистической обработки результатов;

- обсуждение результатов;

- интерпретация результатов.