Приложение 6.1.2. Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом определения классов острой токсичности

Приложение 6.1.2

Оценка острой токсичности при внутрижелудочном поступлении методом определения классов острой токсичности

Идентичен международному документу OECD TG N 423 "Acute Oral Toxicity - Acute Toxic Class Method" (ОЭСР Руководство N 423 "Острая токсичность при внутрижелудочном поступлении - метод классов острой токсичности"). Принят 17 декабря 2001 г. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

Критерии для классификации исследуемых веществ с ожидаемыми величинами , превышающими 2 000 мг/кг, без необходимости проведения испытания.

Испытания доз свыше 2 000 мг/кг

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию острой токсичности при внутрижелудочном поступлении химических веществ и препаратов из них (далее - веществ) методом определения классов острой токсичности.

1.2. Метод основан на использовании фиксированных доз, обеспечивает получение информации об острой токсичности вещества при проглатывании и позволяет оценить и классифицировать его в соответствии с СГС.

2. Общие положения

2.1. Метод определения класса острой токсичности является поэтапным процессом с использованием трех животных одного пола на каждом этапе. В зависимости от смертности и/или от клинической картины отравления животных, в среднем, нужно 2-4 этапа для определения класса острой токсичности вещества. Эта процедура может быть легко произведена, требует небольшого числа животных и позволяет давать оценку веществам так же, как и другие методы определения острой токсичности. Метод определения класса острой токсичности основан на биометрических вычислениях с фиксированными дозами, адекватно разделенных для того, чтобы дать возможность оценить вещество для классификационных целей и для оценки опасности.

2.2. Данный метод не дает возможности точного расчёта , но дает возможность определить диапазон воздействия, в котором ожидается летальный исход, т.к. смерть определенной доли животных по-прежнему является конечной точкой эксперимента. Он делает возможным определение величины только тогда, когда как минимум две дозы дают летальный исход выше 0 и ниже 100%. Использование предопределенных доз, в независимости от тестируемого вещества, с классификацией, связанной только с количеством животных, находящихся в разных состояниях, улучшает согласованность и воспроизводимость результатов, полученных в разных лабораториях.

2.3. Проведению испытания должен предшествовать анализ информации об исследуемом веществе. Такая информация включает сведения о составе и химическом строении вещества; его физико-химических свойствах; результатах токсикологических испытаний in vivo и in vitro; а также токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация нужна для подтверждения того, что испытание необходимо для защиты здоровья человека и способствует выбору подходящей начальной дозы.

2.4. Принцип метода основывается на поэтапном процессе с использованием минимального количества животных на каждом этапе, который позволяет получить достаточную информацию об острой токсичности тестируемого вещества для его классификации. Группе животных из трех особей одного пола (в основном женского) вводится внутрижелудочно тестируемое вещество в одной из выбранных доз - 5, 50, 300 и 2 000 мг/кг. Отсутствие или наличие смертности животных, обусловленной веществом в дозе, введенной на одном этапе, определяют последующие действия, например: вещество в дальнейшем тестировании не нуждается; необходимо тестирование той же дозы еще на трех животных; необходимо тестирование большей или меньшей дозы еще на трех животных. Схема проведения поэтапного тестирования представлена в прилож. 1. Метод дает возможность отнести тестируемое вещество к одному из классов по острой токсичности с фиксированными пределами .

2.5. Исследуемые вещества не должны применяться в дозах, которые являются причиной возникновения выраженных болевых ощущений и недомоганий, оказывая разъедающее или сильно раздражающее действие. Агонизирующие животные или животные, испытывающие непереносимую боль или находящиеся в безнадежном физическом состоянии, должны быть умерщвлены гуманным способом и учтены при подведении результатов исследования так же, как и животные, погибшие во время исследования.

3. Описание тестового метода

3.1. Животные

Выбор вида

3.1.1. Наиболее предпочтительным видом грызунов является крыса, вместе с тем, возможно использование и других видов грызунов. В основном используются женские особи, так как они являются более чувствительными к воздействию токсикантов. Однако если токсикологические и токсикокинетические данные для структурно родственных веществ показывают, что мужские особи являются более чувствительными, следует использовать животных данного пола. Проведение испытания с использованием мужских особей должно быть научно обосновано.

3.1.2. В эксперименте должны быть использованы здоровые молодые половозрелые особи обычных лабораторных линий. Женские особи не должны быть беременными или рожавшими. Каждое животное на момент начала эксперимента должно быть в возрасте от 8 до 12 недель, а его масса должна составлять от средней массы ранее исследуемых животных.

Условия содержания и кормления

3.1.3. Температура в лабораторной комнате должна составлять . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки комнаты; оптимальное значение 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Животных можно содержать группами в клетках в зависимости от дозы, однако количество животных в клетке не должно препятствовать наблюдению за каждым из них.

Подготовка

3.1.4. Животные должны быть разделены на группы методом случайной выборки, помечены и содержаться в клетках не менее пяти дней до начала введения тестируемого вещества, что позволит им привыкнуть к лабораторным условиям.

3.2. Процедура испытания

Приготовление доз

3.2.1. Изучаемое вещество вводится в одинаковых объемах в диапазоне испытуемых доз путем изменения концентрации растворов. Изучаемые продукты в жидком состоянии целесообразно использовать для тестирования без разбавления, т.е. в фиксированной концентрации, это может быть важно для последующей оценки риска использования вещества. Максимальный разовый объем жидкости зависит от размера подопытного животного. Вводимый грызунам объем не должен превышать 1 мл/100 г массы тела: между тем, в случаях с водными растворами объем дозы может составить 2 мл/100 г массы тела. В любом случае максимальный объем вводимой дозы не должен быть превышен. Рекомендуется использовать водные растворы/суспензии/эмульсии химических продуктов, а для продуктов, нерастворимых в воде, - другие растворители, отдавая предпочтение растворам/суспензиям/эмульсиям на масляной основе (растительные масла). В случае использования растворителя, не являющегося водой, его токсикологические характеристики должны быть известны. Дозы должны быть приготовлены незадолго до введения с учетом стабильности изучаемого препарата в период исследования.

Введение дозы

3.2.2. Исследуемый препарат вводится однократной дозой через зонд: желудочную трубку или интубационную канюлю. Если однократное введение необходимой дозы невозможно, доза может быть введена частями в период, не превышающий 24 часа.

3.2.3. Перед введением дозы животных необходимо ограничить в пище (т.е. крыс не кормить с вечера перед введением дозы, но поить; мышей не кормить за 3-4 часа перед введением дозы, но поить). После голодания необходимо взвесить животных, затем ввести испытываемое вещество. После введения препарата крыс не кормить 3-4 часа, мышей - 1-2 часа. Если доза вводится порционно, в зависимости от периода введения дозы животным может потребоваться корм или питье.

Количество животных и уровень доз

3.2.4. Для каждого этапа используют по три животных. Начальная доза может быть выбрана из четырех фиксированных уровней: 5, 50, 300 и 2 000 мг/кг. Необходимо выбрать ту дозу, которая, скорее всего, приведет к смерти подопытных животных. В Приложении представлены схемы, описывающие требуемые процедуры при использовании каждой из начальных доз.

3.2.5. В том случае, если предварительный анализ информации о тестируемом веществе свидетельствует, что смертельный эффект маловероятен при самом высоком уровне дозирования (2 000 мг/кг), должно быть проведено испытание предельной дозы (5 000 мг/кг). Если информация о тестируемом веществе отсутствует, из соображений гуманного отношения к животным следует использовать дозу 300 мг/кг в качестве начальной.

3.2.6. Промежуток времени между введением тестируемых доз разным группам животных определяется началом, длительностью и выраженностью признаков интоксикации. Введение вещества следующей группе животных должно быть отложено до тех пор, пока не станет очевидной выживаемость предыдущей группы.

3.3. Испытание предельной дозы

3.3.1. В исключительных случаях, когда это обусловлено специфическими нормативными требованиями, может быть рассмотрено исследование дополнительного установленного уровня дозы в 5 000 мг/кг (прилож. 2). Из соображений гуманного отношения к животным, исследования доз (2 000-5 000 мг/кг - класс 5 СГС) нецелесообразны и могут проводиться, только если результаты подобных исследований имеют значение для здоровья человека, животных или безопасности окружающей среды.

3.3.2. Испытание предельной дозы проводится в случаях, когда исследователь обладает информацией о том, что вещество, вероятно, не является токсичным, например, обладает токсичностью только в дозах, превышающих предельные уровни. Информация о токсичности исследуемого вещества может быть получена из данных об исследовании родственных по физико-химическим свойствам веществ, смесей или продуктов с учетом того, что имеет значение наличие и процентное содержание компонентов. В тех случаях, когда информация о токсичности препарата отсутствует или недостаточна, или когда исследуемый препарат, вероятно, является токсичным, необходимо проводить основное исследование.

3.3.3. Испытание предельной дозы 2 000 мг/кг может быть проведено на 6 животных (по трое животных на каждый этап). В исключительных случаях может быть проведено испытание предельной дозы 5 000 мг/кг с использованием трех животных (см. прилож. 2). Если наблюдается смерть животных, обусловленная действием вещества, может понадобиться дальнейшее тестирование с меньшей дозой.

3.4. Наблюдение

3.4.1. Экспереминтальные животные должны наблюдаться индивидуально после введения дозы не менее одного раза в первые 30 минут, регулярно в течение первых 24 часов, причем особое внимание следует уделять первым четырем часам, и затем ежедневно в течение 14 дней, кроме случаев, когда они должны быть выведены из исследования и умерщвлены гуманным способом по медицинским показаниям или найдены мертвыми. Длительность наблюдения не должна быть жестко фиксирована. Она зависит от токсических реакций, начала и длительности периода восстановления; таким образом, наблюдение при необходимости может быть продолжено. Необходимо зафиксировать время появления и исчезновения симптомов интоксикации, особенно если есть тенденция к замедленному возникновению токсических симптомов. Результаты наблюдения, включающие отдельные отчеты о каждом животном, систематически регистрируются.

3.4.2. Может потребоваться дополнительное наблюдение, если признаки токсичности у животных не исчезают. В ходе наблюдений фиксируются изменения на коже и шерсти, в глазах и слизистых, в респираторной, кровеносной, вегетативной и центральной нервной системах, нарушения в соматомоторике и поведении. Внимание должно фокусироваться на явлениях тремора, конвульсий, слюноотделения, диареи, летаргии, сна и комы. Агонизирующие животные или животные, испытывающие непереносимую боль или находящиеся в безнадежном физическом состоянии, должны быть умерщвлены гуманным способом. Если животные умерщвлены из соображений гуманности или найдены мертвыми, время смерти должно быть зафиксировано максимально точно.

Масса тела

3.4.3. Масса тела животного должна быть определена незадолго до введения тестируемого вещества и контролироваться не менее чем раз в неделю после испытания. Изменения массы тела должны быть вычислены и зафиксированы. Выжившие по окончании испытания животные должны быть взвешены и умерщвлены гуманным способом.

Патологическая анатомия

3.4.4. Всех подопытных животных (включая погибших во время испытаний, а также исключенных по медицинским показателям) необходимо подвергнуть общей аутопсии. Для каждого животного должны быть зарегистрированы все общие патологические изменения. Следует учитывать также результаты микроскопического анализа органов у животных, проживших 24 и больше часов после первого приема тестируемого вещества.

4. Данные и отчет

4.1. Данные

4.1.1. На каждого животного должны быть собраны данные. Кроме того, все данные должны быть оформлены в виде таблиц на каждую подопытную группу, содержащих сведения о количестве животных с признаками интоксикации, количестве животных, погибших во время испытания или умерщвленных из соображений гуманности, время смерти каждого животного, описание и временной график токсического действия и восстановления, результаты вскрытия.

4.2. Отчет

Отчет об исследовании должен содержать следующую информацию:

Исследуемое вещество:

- физическая природа, чистота и, при необходимости, физико-химические свойства (включая изомеризацию);

- идентифицирующие данные, включая CAS-номер.

Растворитель (если используется):

- обоснование выбора растворителя в случае, если это не вода.

Подопытные животные:

- вид/род;

- микробиологический статус животных, если таковой известен;

- количество, возраст и пол животных (включая обоснование предпочтения самцов самкам);

- происхождение, условия содержания, кормление и пр.

Условия испытания:

- технология приготовления испытываемого вещества (включая физические параметры используемых компонентов);

- подробности о введении тестируемого вещества, включая дозировку, объем и время приема;

- подробности о качестве корма и воды (включая способ/источник корма и воды);

- обоснование выбора начальной дозы.

Результаты (отражают в отдельных таблицах):

- реакцию каждого подопытного животного на уровень введенной дозы вещества (т.е. животных с признаками интоксикации, в т.ч. летальный исход, изменение основных свойств, интенсивность и продолжительность токсикологически значимого эффекта);

- вес тела и изменения в весе тела;

- индивидуальную массу тела животного в день введения вещества, спустя неделю после введения вещества, на момент гибели или умерщвления;

- дату и время гибели, если она произошла раньше запланированного умерщвления;

- временной график появления признаков токсичности, сведения об обратимости признаков токсичности для каждого животного;

- результаты вскрытия и результаты гистопатологического исследования для каждого животного, если таковые имеются.

Обсуждение и интерпретация результатов.

Выводы.

Схема 6.1.2.1. Процедура тестирования с начальной дозой 5 мг/кг

Схема 6.1.2.2. Процедура тестирования с начальной дозой 50 мг/кг

Схема 6.1.2.З. Процедура тестирования с начальной дозой 300 мг/кг

Схема 6.1.2.4. Процедура тестирования с начальной дозой 2 000 мг/кг

Критерии для классификации исследуемых веществ с ожидаемыми величинами , превышающими 2 000 мг/кг, без необходимости проведения испытания

1. Критерии для определения класса опасности 5 призваны идентифицировать исследуемые вещества, относящиеся к относительно низкому классу острой токсической опасности, но при определенных условиях представляющие опасность для более уязвимых популяций. Для этих веществ уровень предположительно находится в диапазоне концентраций 2 000-5 000 мг/кг при пероральном или накожном воздействии и эквивалентных концентраций для других путей воздействия. Исследуемые вещества могут быть отнесены к данному классу опасности, определяемому дозами: 2 000 мг/кг < < 5 000 мг/кг (класс 5 в СГС), в следующих случаях:

а) если они попали в эту категорию в соответствии со схемами 6.1.2.1-6.1.2.4 тестирования прилож. 6.1.2, основываясь на уровне смертности;

б) если получены надежные доказательства, указывающие на отнесение к классу 5; или если другие исследования на животных или случаи острого токсического воздействия на человека свидетельствуют о влиянии на здоровье человека;

в) если посредством экстраполяции, оценки и измерения данных нет показаний к отнесению к классу более высокой опасности, и

- доступна надежная информация, указывающая на значительную токсичность для человека, или

- наблюдался любой смертельный исход, зарегистрированный во время испытания веществ, входящих в классы опасности до класса 4, и вводимых перорально, или

- если экспертная оценка подтверждает наличие клинических признаков токсичности при тестировании с дозами, превышающими указанные в классе 4, кроме случаев диареи, пилоэрекции или вялости, или

- в случаях, когда экспертная оценка подтвердит надежность информации, указывающей на потенциальную значимость выраженного воздействия из других исследований на животных.

Испытания доз свыше 2 000 мг/кг

2. Из соображений защиты животных исследования доз, относящихся к классу 5 СГС (2 000-5 000 мг/кг), нежелательны и могут проводиться, только если результаты подобных исследований имеют значение для здоровья человека или животных. Исследования в более высоких дозах не допускаются.

3. Если требуются испытания дозы 5 000 мг/кг, необходимо проводить их только в один этап (т.е. на трех животных). Если первое подопытное животное умирает, тогда дозирование продолжается при 2 000 мг/кг в соответствии со схемой 6.1.2.4. Если первое животное не умирает, дозирование при 5 000 мг/кг продолжается. Если только одно из трех животных умирает, значение , скорее всего, превысит 5 000 мг/кг. Если умирают два животных, дозирование продолжается при введении дозы 2 000 мг/кг.