Приложение 6.8.17. Генетическая токсикология: Методы оценки генных мутаций в соматических и половых клетках трансгенных грызунов

Приложение 6.8.17

Генетическая токсикология: Методы оценки генных мутаций в соматических и половых клетках трансгенных грызунов

Идентичны международному документу OECD TG N 488 "Genetic Toxicology: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays" (ОЭСР Руководство N 488 "Генетическая токсикология: Методы оценки генных мутаций в соматических и половых клетках трансгенных грызунов"). Принят 26 июля 2013 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. В руководствах OECD приведен широкий спектр методов оценки мутаций in vitro для определения хромосомных и/или генных мутаций. Представлены также методы оценки in vivo ряда мутагенных и генотоксических эффектов (хромосомные аберрации и внеплановый синтез ДНК). Однако нет методов анализа генных мутаций. Метод оценки мутаций у трансгенных грызунов (ТГ) является необходимым для практики широко применяемым тестом in vivo для учета генных мутаций.

2. Общие положения

2.1. Метод оценки мутаций у ТГ представлен в ряде обзоров. Используются трансгенные крысы и мыши, которые содержат множественные копии интегрированных в хромосомы плазмид или фаговых шатл-векторов. Трансгены содержат гены-репортеры для определения различных типов мутаций, индуцируемых исследуемыми веществами.

2.2. Мутации, возникающие у грызунов, выявляются при обратной мутации трансгена и анализируются фенотипически у бактерии-хозяина, дефицитной по гену-репортеру. Метод оценки мутаций у ТГ учитывает мутации, индуцируемые в генетически нейтральных генах, выделенных фактически из любой ткани грызуна. Этот метод обходит множество имеющихся ограничений, связанных с изучением генных мутаций в эндогенных генах (например, ограничения по подходящим для анализа тканям; отрицательная/положительная селекция мутаций).

2.3. Данные предполагают, что трансгены реагируют на мутагены так же, как и эндогенные гены. Это особенно относится к выявлению мутаций типа замены пар оснований, фраймшифт-мутаций и небольших делеций и вставок.

2.4. Международное совещание по генетическому тестированию (IWGT) предложило включить метод оценки мутаций у ТГ для выявления генных мутаций in vivo и рекомендовало протокол его проведения [15, 29]. Данное руководство основано на этих рекомендациях.

2.5. Ожидается, что в будущем возможна комбинация метода оценки мутаций у ТГ с анализом токсичности при повторном введении доз (Руководство ОЭСР N 407). Однако необходимо получить данные, показывающие, что чувствительность метода оценки мутаций у ТГ не меняется при однодневном периоде времени между последним введением (окончанием периода введения) и временем забора материала, как это проводится при исследовании токсичности при повторном введении доз, по сравнению с трехдневным интервалом, используемым в методе оценки мутаций у ТГ. Необходимы также данные, что проведение исследования с повторными дозами не искажается при использовании трансгенных штаммов животных по сравнению с традиционно используемыми штаммами. Когда эти данные будут собраны, этот вариант руководства будет принят.

2.6. Методы оценки мутаций у ТГ, для которых имеется достаточно данных для поддержки их внесения в данное Руководство, включают: lacZ бактериофаг мыши ; lacZ плазмида мыши; gpt delta (gpt and Spi) мыши и крысы; lacI мыши и крысы . Эти методы проводятся при стандартных условиях. Дополнительно метод cll позитивной селекции может использоваться для оценки мутаций на моделях и . Мутагенез у ТГ-моделей в норме оценивается как частота мутаций. Однако, если требуется, может быть получена дополнительная информация по молекулярному анализу мутаций (см. п. 4.2.5).

2.7. Данные методы оценки генных мутаций на грызунах in vivo особенно подходят для оценки мутагенной опасности, поскольку учитывают метаболизм in vivo, фармакокинетику, репарацию ДНК и синтез ДНК, хотя эти процессы могут варьировать у разных видов, между тканями и при разных типах повреждений ДНК. Метод оценки генных мутаций in vivo полезен при исследовании мутагенного эффекта, выявляемого в тест-системах in vitro, и при сопоставлении с результатами исследования в других тест-системах in vivo, учитывающих другие типы мутагенных и генотоксических эффектов.

2.8. В дополнение к причинной связи с индукцией рака, генные мутации могут быть использованы как непрямой индикатор ряда обусловленных мутациями нераковых заболеваний соматических тканей, а также заболеваний, возникающих в половых клетках и передающихся потомству.

2.9. Если имеются данные, что вещество или его метаболит не достигают любой интересующей исследователя ткани, то не следует использовать метод оценки мутаций у ТГ.

3. Принцип метода

3.1. В приведенных в п. 8 методах ген-мишень имеет бактериальное или бактериофагальное происхождение. Он восстанавливается из геномной ДНК грызуна путем инкорпорации трансгена в или шатл-вектор плазмиды. Методика включает экстракцию геномной ДНК из исследуемой ткани грызуна, обработку in vitro геномной ДНК (т.е. упаковку вектора или лигирование и электропорацию плазмид для восстановления шатл-векторов) и последующее определение мутаций у бактерии-хозяина при соответствующих условиях. В методе используются нейтральные гены, которые легко выделяются из большинства тканей.

3.2. Основной эксперимент оценки мутаций у ТГ включает обработку животного веществом определенный период времени. Вещество может вводиться любым путем, включая имплантацию (например, тестирование медицинских материалов). Общее время, в течение которого животное подвергается воздействию, обозначается как период воздействия. После окончания воздействия до забоя проходит период времени, в течение которого вещество не вводится, и в течение которого нерепарируемые повреждения ДНК фиксируются в стабильные мутации. В литературе этот период времени называется по разному: время манифестации, время фиксации или время экспрессии. Затем животных забивают, изолируют геномную ДНК из выбранных тканей и очищают.

3.3. Данные по одной ткани от животного из нескольких упаковок/лигирований обычно объединяют и частоту мутантов оценивают в интервале между и бляшкообразующих или колониеобразующих единиц. При использовании методов позитивной селекции общее число бляшкообразующих единиц определяется с использованием отдельного набора неселективных чашек.

3.4. Методы позитивной селекции разработаны для облегчения определения мутаций как в gpt гене [gpt delta мыши и крысы, gpf фенотип] и lacZ гене [ или lacZ плазмида мыши]. В то же время мутации в lacI гене у определяются неселективным методом, при котором мутанты идентифицируют через генерацию цветных (голубых) бляшек. Методология позитивной селекции используется также при определении точковых мутаций, возникающих в cll гене из шаттл-вектора бактериофага [ мыши и крысы и ] и делетационных мутаций в red и gam генах [ селекция у gpt delta мышей и крыс]. Частота мутаций рассчитывается путем деления числа бляшек/плазмид, содержащих мутации в трансгене, на общее число бляшек/плазмид, полученных из той же пробы ДНК. В исследованиях генных мутаций у ТГ частота мутантов - главный учитываемый параметр. Дополнительно может быть определена частота мутаций как доля клеток, несущих независимые мутации. При расчете необходима коррекция для клональной экспансии путем секвенирования восстановленных мутантов.

3.5. Мутации, учитываемые в методах оценки lacl, lacZ, cll и gtp точковых мутаций, преимущественно являются мутациями замены пар оснований, фраймшифт-мутациями и небольшими вставками/делециями. Доля этих типов мутаций среди спонтанных мутаций сходна с таковой в эндогенном Hprt гене. Большие делеции выявляются лишь в методах селекции и с lacZ плазмидой [24]. Наиболее интересны мутации in vivo, которые возникают у мышей и крыс. Мутации in vitro и ex vivo, которые могут возникать во время выделения фагов/плазмид, репликации и репарации, относительно редки, а в некоторых системах могут быть специфически идентифицированы или исключены при использовании бактериальной хозяин/позитивной системы селекции.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Выбор видов животных

4.1.1. В настоящее время имеется ряд моделей учета генных мутаций у трасгенных мышей. Эти системы используются более широко, чем модели трансгенных крыс. Если известно, что крысы более подходят в качестве модели, чем мыши (например, когда механизм канцерогенеза описан только для крыс, или при оценке корреляции с изучением токсичности у крыс, или если известно, что метаболизм вещества у крыс более соответствует метаболизму у человека).

Условия содержания и кормления

4.1.2. Оптимальная температура в комнатах с экспериментальными животными . Хотя относительная влажность должна быть не менее 30% и не выше 70% во время уборки помещения, оптимально поддерживать относительную влажность 50-60%. Освещение искусственное. Световой режим: 12 часов освещение, 12 часов темнота. Может быть использована стандартная лабораторная диета без ограничения питьевой воды. На выбор диеты может влиять необходимость приготовления особой смеси корма при введении вещества с кормом. Если не ожидается агрессивного поведения, животных одного пола следует содержать небольшими группами (не более, чем по пять животных). Возможно индивидуальное содержание животных, если это обосновано.

Работа с животными

4.1.3. Здоровые молодые животные (возраст 8-10 недель в начале воздействия) распределяются в опытные и контрольные группы случайным образом. Каждое животное идентифицируют. Животных акклиматизируют к лабораторным условиям по крайней мере в течение 5 дней. Клетки располагают таким образом, чтобы минимизировать возможные эффекты вследствие перемещения клеток. В начале эксперимента колебания массы животных должны быть минимальны, не превышая средней массы животных каждого пола.

Приготовление исследуемых соединений

4.1.4. Твердые соединения растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе и смешивают с кормом или водой при введении животным. Жидкие вещества можно вводить прямо или разводить перед введением. При ингаляционном введении в зависимости от физико-химических свойств исследуемое вещество может даваться как газ, пары или аэрозоль твердого вещества /жидкости/. Пока стабильность растворов исследуемого вещества при соответствующем хранении не будет показана, следует использовать свежеприготовленные препараты.

4.2. Условия испытания

Растворитель

4.2.1. Растворитель не должен вызывать токсические эффекты при использованных уровнях доз и не должен вступать в реакцию с исследуемым веществом. Если используется малоизвестный растворитель, его включение должно быть обосновано данными, указывающими на совместимость с исследуемым веществом. По возможности рекомендуется в первую очередь использовать водные растворы.

Положительные контроли

4.2.2. В норме должна быть группа животных положительного контроля. Для лабораторий, которые продемонстрировали опыт работы (см. п. 4.2.4) и рутинно используют эти методы, ДНК животных из предыдущих положительных контролей может быть включена в каждое исследование для подтверждения адекватности метода. ДНК предыдущих опытов должна быть получена от животных того же вида, тех же исследованных тканей и соответственно храниться (см. п. 4.3.12). При использовании в опыте группы положительного контроля нет необходимости вводить вещество тем же путем, что и исследуемое соединение. Однако должно быть известно, что положительные контроли индуцируют мутации в одной или более тканях, исследуемых в опыте с изучаемым соединением. Дозы веществ положительного контроля должны подбираться так, чтобы давать слабый или средний эффект, чтобы критически оценить эффективность и чувствительность метода. Примеры веществ положительного контроля и некоторые ткани-мишени при их введении представлены в таблице.

Таблица

Примеры веществ положительного контроля и некоторые ткани-мишени при их введении

Вещество и N CAS	Характеристики	Ткань-мишень мутаций
		Крысы	Мыши
N-метил-N- нитрозомочевина [CAS 759-73-9]	Мутаген прямого действия	Печень, легкие	Костный мозг, толстая кишка, эпителий толстой кишки, тонкая кишка, печень, легкие, селезенка, почки, гранулезные клетки яичника, половые клетки самцов
Этил карбамат [CAS 51-79-6]	Мутаген, требующий метаболической активации, но индуцирующий лишь слабые эффекты		Костный мозг, преджелудок, тонкая кишка, печень, легкие, селезенка
2,4-диаминотолуол [CAS 95-80-7]	Мутаген, требующий метаболической активации, также положителен в методе	Печень	Печень
Бенз(а)пирен [CAS 50-32-8]	Мутаген, требующий метаболизм	Печень, сальник	Костный мозг, молочная железа, толстая кишка, преджелудок, железистая часть желудка, сердце, печень, легкие, половые клетки самцов

Отрицательный контроль

4.2.3. Животные групп отрицательного контроля для каждой временной точки обрабатываются только растворителем или разбавителем тем же путем, что и экспериментальные группы. При отсутствии данных исторического контроля или опубликованных данных, показывающих, что вредные или мутагенные эффекты не индуцируются выбранным растворителем/разбавителем, группа контрольных животных без обработки также должна быть включена для каждого изученного временного интервала для того, чтобы установить приемлемость контроля с растворителем.

Верификация профессионализма лаборатории

4.2.4. Компетентность в использовании данного метода должна быть установлена путем воспроизведения ожидаемых результатов по опубликованным данным для: 1) частоты мутантов с веществами положительного контроля (включая слабые ответы), такими, которые приведены в таблице, не мутагенами и веществами отрицательного контроля (растворителями); 2) восстановления трансгена из геномной ДНК (т.е. эффективность упаковки).

Секвенирование мутантов

4.2.5. Для целей установления регламентов секвенирования ДНК мутантов не требуется, особенно в случаях получения четкого положительного или отрицательного результата. Однако данные секвенирования могут быть полезны при наблюдении высоких межиндивидуальных вариаций. В этих случаях секвенирование может быть использовано для исключения возможности джекпотов или клональных событий, идентифицируя долю уникальных мутантов из определенной ткани. Секвенирование приблизительно 10 мутантов на ткань на животное достаточно для простого выявления вклада клона мутантов в частоту мутаций. Секвенирование 25 мутантов необходимо, чтобы математически скорректировать на клональность частоту мутаций. Секвенирование мутантов также можно проводить, когда выявлено небольшое повышение частоты мутантов (т.е. на границе превышения над значениями у необработанного контроля). Различия в спектре мутантов между мутантными колониями у обработанных и необработанных животных могут поддержать предположение о мутагенном эффекте [29]. Также спектр мутаций полезен при анализе гипотез о механизме действия. При включении секвенирования в протокол исследования специальное внимание должно быть уделено регламенту таких работ, в особенности в отношении числа секвенированных мутантов на пробу, чтобы достичь адекватной силы, соответствующей используемой статистической модели (см. п. 5.1.4).

4.3. Проведение исследования

Число и пол животных

4.3.1. Количество животных на группу нужно определить заранее и при выбранной статистической мощности оно должно быть достаточным для выявления как минимум удвоения частоты мутантов. Размер групп составляет как минимум 5 животных, однако, если статистической мощности недостаточно, число животных должно быть увеличено до требуемого количества. Обычно используют самцов животных. Возможны случаи, когда обосновано использование только самок. Например, при исследовании лекарств, применяемых только женщинами, или при исследовании специфического для женщин метаболизма. Если имеются значимые различия между полами по показателям токсичности или метаболизма, необходимо использовать как самцов, так и самок.

Режим введений

4.3.2. Наблюдения о накоплении мутаций при каждом последующем введении указывают на необходимость режима повторных доз с ежедневными введениями вещества в течение 28 дней. Этот режим приемлем как в плане достаточного накопления мутаций при действии слабых мутагенов, так и для достижения адекватного временного периода для выявления мутаций в органах со слабой пролиферацией. Для ряда исследований могут подходить другие режимы воздействия. Эти режимы воздействия должны быть научно обоснованы в протоколе. Длительность воздействия не должна быть короче, чем время, требуемое для полной индукции всех участвующих в метаболизме ферментов. При более короткой продолжительности воздействия может возникать необходимость использования нескольких временных точек забора проб, которые подходят для органов с разной скоростью пролиферации. В любом случае, вся информация (т.е. общая токсичность или метаболизм и фармакокинетика) должна учитываться при обосновании протокола, особенно в случаях отклонения от представленных выше стандартных рекомендаций. Если это может повысить чувствительность, длительность воздействия больше 8 недель должна быть научно обоснована, поскольку длительное время воздействия может вызвать очевидное возрастание частоты мутаций через механизм клональной экспансии.

Уровни доз

4.3.3. Выбор уровней доз должен базироваться на результатах оценки дозовых зависимостей при оценке общей токсичности, которая проведена при том же пути введения, или на результатах проведенных ранее исследований подострой токсичности. Нетрансгенные животные той же линии грызунов могут быть использованы для определения уровня доз. В основном опыте для получения информации по дозовому режиму полное исследование включает группу отрицательного контроля (см. п. 4.2.3) и минимум три дозы с приблизительно равным интервалом, за исключением случаев, когда используется лимитирующая доза (см. п. 4.3.4). Верхняя доза берется на уровне максимально переносимой дозы (МПД). МПД определяется как доза, вызывающая признаки токсичности, такие, что при более высоком уровне доз при том же режиме воздействия ожидается летальный эффект. Вещества со специфической биологической активностью при низких нетоксичных дозах (например, гормоны и митогены) и вещества, которые проявляют насыщение токсикокинентических свойств, являются исключением по критериям установления доз и должны оцениваться в каждом случае специально. Уровень доз должен покрывать интервал от максимальной токсичности до минимальной или отсутствия токсичности.

Ограничения теста

4.3.4. Если эксперимент по определению уровня доз или имеющиеся данные по близким линиям животных показывают, что режим воздействия по крайней мере с использованием лимитирующей дозы (см. ниже) не вызывает токсического эффекта, и если генотоксичность не ожидается по данным о структурно-связанных соединениях, тогда полное исследование с тремя уровнями доз не является необходимым. Для периода воздействия 28 дней (т.е. 28 ежедневных введений) в качестве лимитирующей дозы принимается доза 1 000 мг/кг массы тела в день. Для периода воздействия 14 и менее дней за лимитирующую дозу принимается доза 2000 мг/кг массы тела в день. Интервал доз, отличающийся от 28-дневного воздействия, необходимо научно обосновать в протоколе (см. п. 4.3.2).

Введение вещества

4.3.5. Вещество обычно вводят внутрижелудочно, используя подходящую интубационную канюлю. В целом в опыте приемлем рекомендуемый для человека путь введения. Поэтому можно использовать другие пути воздействия (с питьевой водой, подкожный, внутривенный, местный, ингаляционный, интратрахеальный, с диетой или путем имплантации), когда они обоснованы. Внутрибрюшинное введение не рекомендуется, поскольку оно не физиологично и не соответствует экспозиции человека. Максимальный объем жидкости, вводимый однократно внутрижелудочно или путем инъекции, зависит от размера экспериментальных животных. Объем не должен превышать 2 мл на 100 г массы тела. Использование больших объемов должно быть обосновано. За исключением раздражающих и коррозивных материалов, которые в норме вызывают раздражающий эффект в высоких концентрациях, колебания объемов следует минимизировать путем расчета концентраций таким образом, чтобы был постоянный объем при всех уровнях доз.

Время забора материала

Соматические клетки

4.3.6. Время забора материала - критическая переменная, так как она определяется периодом, необходимым для фиксации мутаций. Этот период тканеспецифичен и связан со временем обновления клеточной популяции: костный мозг и кишечник - быстро обновляющиеся ткани, клетки печени обновляются намного медленнее. Приемлемым компромиссом определения частоты мутаций в быстро и медленно пролиферирующих тканях является ежедневное воздействие в течение 28 дней (как показано в п. 4.3.2) и забор проб через 3 дня после последнего введения; в этих условиях максимальная частота мутантов может быть не выявлена в медленно пролиферирующих тканях. Если медленно пролиферирующие ткани имеют особое значение, тогда более позднее время забора проб, чем через 8 дней, должно быть взято с добавлением дополнительного 28-дневного введения. В этом случае время забора замещает 3-дневный период забора проб и должно быть научно обосновано.

Половые клетки

4.3.7. Метод ТГ хорошо подходит для оценки индукции генных мутаций в половых клетках самцов, у которых хорошо изучены время и кинетика сперматогенеза. Низкое число пригодных для анализа яйцеклеток, даже после суперовуляции, и отсутствие синтеза ДНК в ооцитах препятствуют выявлению мутаций в половых клетках самок в экспериментах на трансгенных животных.

4.3.8. Время забора для половых клеток следует выбирать так, чтобы все стадии развития половых клеток были под воздействием и чтобы стадия, оцениваемая при заборе материала, получила достаточный уровень воздействия. Время развития половых клеток от стволовых сперматогоний до зрелых сперматозоидов, достигших семенного протока/протока эпидидимиса, составляет приблизительно 49 дней для мышей и приблизительно 70 дней для крыс. При экспозиции в течение 28 дней и последующем 3-дневном периоде забора проб, аккумулированная сперма, собранная из семенного протока/протока эпидидимиса, будет представлять популяцию клеток, охватывающих приблизительно последнюю половину сперматогенеза, которая включает мейотический и постмейотический периоды, но не периоды сперматогоний и стволовых клеток. Для того, чтобы собрать из семенного протока/протока эпидидимиса клетки, которые были экспонированы веществом на стадиях сперматогоний и стволовых клеток, требуется дополнительное время забора материала, соответствующее, как минимум, 7 неделям для мышей и 10 неделям для крыс после окончания воздействия.

4.3.9. Клетки, выделенные из семенных канальцев после экспозиции в течение дней, составляют смешанную популяцию, включающую все стадии развития половых клеток. Проба этих клеток для оценки генных мутаций не позволяет точно установить стадию половых клеток, в которых были индуцированы мутации, как это можно сделать на пробах сперматозоидов, собранных из семенного протока/протока эпидидимиса (поскольку имеется разброс в пробе по стадиям клеток, и в популяции присутствует некоторое количество соматических клеток). Однако в пробе клеток из семенных канатиков, в дополнение к сперматозоидам из семенного протока/протока эпидидимиса после -дневной экспозиции, можно исследовать клетки, прошедшие большинство фаз развития половых клеток. Это полезно при выявлении мутагенов для половых клеток.

Наблюдение

4.3.10. Общее клиническое наблюдение за животными следует проводить по меньшей мере один раз в день, преимущественно в один и тот же временной период, учитывающий пик времени проявления эффекта после вв