Приложение 6.7.5. Оценка токсического действия на пренатальное развитие

Приложение 6.7.5

Оценка токсического действия на пренатальное развитие

Идентичен международному документу OECD TG N 414 "Prenatal Developmental Toxicity Study" (ОЭСР Руководство N 414 "Оценка токсического действия на пренатальное развитие"). Принят 22 января 2001 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования предназначен для получения общей информации о воздействии химических веществ и продукции на их основе на беременных экспериментальных животных и развивающиеся организмы на пренатальной стадии.

1.2. Данное исследование включает в себя изучение воздействия на материнский организм, а также гибели, структурных аномалий или изменений в развитии плода.

2. Общие положения

2.1. Изучение репродуктивной токсичности является обязательным элементом токсикологической оценки химических веществ.

2.2. Целью данного метода является изучение влияния химических соединений на органогенез, процессы развития плода.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество вводят беременным животным, начиная с момента имплантации до дня, предшествующего дню запланированного умерщвления животных, который должен быть как можно ближе ко дню нормальных родов и не приводить к риску потери данных в результате досрочных родов.

3.1.2. Настоящий метод предназначен не только для изучения периода органогенеза (дни 5-15 у грызунов, дни 6-18 у кроликов), но и эффектов, начиная с момента преимплантации, при необходимости на протяжении всего периода беременности до проведения кесарева сечения.

3.1.3. Незадолго до проведения кесарева сечения женских особей умерщвляют, изучают содержимое матки и оценивают изменения мягких тканей и скелета плода.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо проводить испытания на наиболее подходящих видах животных. Как правило, используются стандартные лабораторные виды, которые обычно применяются в испытаниях пренатальной токсичности. Наиболее предпочтительным видом грызунов является крыса, негрызунов - кролик. Использование других видов должно быть обосновано.

Подготовка

3.2.2. В испытании используются здоровые интактные особи, прошедшие процесс адаптации к лабораторным условиям в течение 5 дней. Экспериментальных животных необходимо идентифицировать по виду, источнику, полу, массе и возрасту. Животные всех экспериментальных групп должны быть одинаковой массы и возраста. Для каждого уровня дозы должны использоваться молодые взрослые нерожавшие женские особи. Женские особи должны быть спарены с мужскими особями того же вида, инбридинга (спаривания особей из одного потомства) необходимо избегать. Для грызунов за день 0 беременности принимается день, когда у животного обнаруживается вагинальная пробка и/или сперма; для кроликов за день 0 принимается день полового акта или искусственного оплодотворения, если используется данный метод. Оплодотворенные самки должны быть произвольно распределены на экспериментальные и контрольные группы. Клетки устанавливаются таким образом, чтобы возможное влияние, связанное с размещением клетки, было минимизировано. Каждому животному присваивается уникальный идентификационный номер. Если самок оплодотворяют по партиям, животные из каждой партии должны быть произвольно распределены по группам.

Содержание

3.2.3. Температура в лабораторном помещении должна составлять для грызунов и кроликов. Несмотря на то что относительная влажность должна быть как минимум 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки помещения, оптимальное значение составляет 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении используется обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Процедуры спаривания проводятся в клетках, подходящих для этой цели. Индивидуальное содержание оплодотворенных животных является предпочтительным, содержание небольшими группами также приемлемо.

3.3. Процедура испытания

Количество и пол животных

3.3.1. Каждая экспериментальная и контрольная группы должны содержать достаточное число женских особей для получения примерно 20 самок с имплантацией для аутопсии. Группы, состоящие из менее чем 16 животных с имплантацией, могут быть неприемлемы.

3.3.2. Материнская смертность, не превышающая 10%, не влияет на результаты исследования.

Подготовка доз

3.3.3. При использовании растворителя или других добавок для облегчения дозирования необходимо уделять внимание следующим его характеристикам: влияние на поглощение, распределение, метаболизм и удержание/выведение исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсические свойства; и влияние на потребление воды и пищи или порядок питания животных. Растворитель не должен обладать репродуктивной токсичностью или токсичностью для развивающегося организма.

Дозирование

3.3.4. Исследуемое вещество необходимо вводить ежедневно после имплантации (на 5-й день после спаривания) до дня, предшествующего дню запланированного кесарева сечения. Если проведенные предварительные исследования не указывают на высокий потенциал предимплантационной гибели, исследование продлевается на весь период беременности, от спаривания до дня, предшествующего запланированному умерщвлению.

3.3.5. Ненадлежащее обращение и стресс во время беременности могут привести к пренатальной потере (выкидышу). Поэтому необходимо избегать воздействия факторов, не связанных с экспериментом, таких как: ненадлежащее обращение с беременными животными, стрессы от внешних факторов, шум и т.д. Здоровые животные произвольно распределяются на экспериментальные и контрольные группы.

3.3.6. Необходимо использовать, как минимум, три уровня доз и параллельную контрольную группу. Уровни доз необходимо выбирать с учетом возможности дальнейшей градации токсических эффектов. Если не ограничиваться физико-химическими или биологическими свойствами исследуемого вещества, наиболее высокая доза должна выбираться с целью индуцировать определенную токсичность для развивающегося организма и/или материнской особи (клинические признаки или снижение массы тела), но не смерть или тяжелые страдания. Как минимум, один промежуточный уровень дозы должен приводить к появлению минимальных наблюдаемых токсичных эффектов. Наименьший уровень дозы не должен приводить к появлению каких-либо признаков токсичности для развития плода или материнской особи. Убывающая последовательность доз должна быть выбрана так, чтобы продемонстрировать любое соотношение доза-ответ и уровень, при котором не наблюдаются негативные эффекты (NOAEL), или доз, близких пределу обнаружения эффекта, которые позволяют определить критическую дозу. Двух-/четырехкратные интервалы являются оптимальными для установления убывающей последовательности доз, и добавление четвертой тестовой группы предпочтительнее использования очень больших интервалов (более чем 10-кратных) между дозами. Несмотря на то, что получение NOAEL для материнской особи является целью испытания, исследования, в которых не определяется данный показатель, также могут быть приемлемы.

3.3.7. Уровни доз следует выбирать с учетом любых существующих данных о токсичности, а также дополнительной информации о метаболизме и токсикокинетике исследуемого вещества или близких к нему веществ. Подобная информация будет способствовать демонстрации соответствия режима дозирования.

3.3.8. В испытании необходимо использовать параллельную контрольную группу. Данная группа должна подвергаться фиктивному воздействию или воздействию растворителем, если растворитель используется для введения исследуемого вещества. Для всех групп должен использоваться одинаковый объем исследуемого вещества или растворителя. Животные из контрольной группы (групп) должны содержаться идентично животным из экспериментальных групп. Для контрольных групп, подвергающихся воздействию растворителя, необходимо использование самой высокой дозы растворителя (как для группы с наименьшей дозой исследуемого вещества).

3.4. Испытание с предельной дозой

3.4.1. Если испытание с одной дозой в 1 000 мг/кг массы тела в день, вводимой перорально, с использованием представленных процедур не приводит к появлению признаков токсичности, и появление эффекта не ожидается согласно существующим данным (например, при исследовании структурно и/или метаболически родственных соединений), то полное исследование с использованием трех доз не является необходимым. Ожидаемое воздействие на организм человека может указывать на необходимость использования более высокого уровня пероральной дозы в испытании с предельной дозой.

3.4.2. Для других способов введения дозы, таких как ингаляционный или дермальный, физико-химические свойства исследуемого вещества часто могут указывать на максимально достижимый уровень воздействия (например, дермальное нанесение не должно вызвать серьезные местные поражения).

3.5. Введение экспериментальной дозы

3.5.1. Исследуемое вещество или растворитель вводят перорально посредством интубации. Если используется другой способ введения, необходимо представить обоснование и аргументировать выбор. Исследуемое вещество следует вводить каждый день примерно в одно и то же время.

3.5.2. Дозы для каждого животного выбираются на основании последнего индивидуального определения массы тела животного. Следует соблюдать осторожность при определении дозы в течение последнего триместра беременности. Для предотвращения появления избыточной токсичности для материнской особи при выборе дозы необходимо использовать существующие данные.

3.5.3. Если в ходе эксперимента отмечается чрезвычайно высокое токсическое воздействие на самок, их необходимо гуманно умертвить. Если несколько беременных животных проявляют признаки избыточной токсичности, следует рассмотреть возможность прекращения дозирования группы.

3.5.4. При введении вещества через желудочный зонд дозирование животным необходимо проводить с использованием желудочной трубки или подходящей интубационной канюли в виде разовой дозы.

3.5.5. Максимальный объем жидкости, которая может быть введена за один раз, зависит от размера экспериментального животного. Объем не должен превышать 1 мл на 100 г массы тела, за исключением водных растворов, когда можно использовать 2 мл на 100 г массы тела. Если в качестве растворителя используется кукурузное масло, объем не должен превышать 0,4 мл на 100 г массы тела. Изменения тестового объема должны быть сведены к минимуму путем регулирования концентрации для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз.

3.6. Обследование самок

3.6.1. Клинические наблюдения должны проводиться и регистрироваться, как минимум, один раз в день, предпочтительно в одно и то же время с учетом пикового периода ожидаемых эффектов после введения дозы. Состояние животных должно быть зарегистрировано, включая смертность, состояние агонии, соответствующие изменения в поведении и все признаки очевидной токсичности.

Масса тела и потребление пищи

3.6.2. Животных необходимо взвешивать в день 0 или не позднее дня 3, если оплодотворенные животные поставляются от стороннего производителя, в первый день воздействия, а затем каждые 3 дня в течение эксперимента и в день запланированного умерщвления.

3.6.3. Потребление пищи необходимо регистрировать с трехдневным интервалом, совпадающим с интервалом определения массы животных.

Обследование после вскрытия

3.6.4. Самки должны быть умерщвлены за один день до предполагаемых родов. Самок, у которых наблюдаются признаки выкидыша или признаки преждевременных родов до запланированного времени умерщвления, необходимо умертвить и подвергнуть тщательному макроскопическому обследованию.

3.6.5. В момент умерщвления или смерти во время исследования самки должны быть осмотрены макроскопически на наличие любых структурных аномалий или патологических изменений. Осмотр самок во время кесарева сечения и последующего анализа плода должен проводиться без информации о принадлежности к исследуемой группе в целях объективности.

Изучение содержимого матки

3.6.6. Незамедлительно после умерщвления или как можно скорее после смерти матки животных должны быть удалены и установлен статус беременности. Для маток, которые выглядят неоплодотворенными, необходимо проводить дальнейшие исследования (например, окрашивание сульфидом аммония для грызунов и окрашивание Салевски или альтернативный метод для кроликов) для подтверждения отсутствия беременности.

3.6.7. Беременные матки, в том числе шейки матки, должны быть взвешены. Масса беременных маток не определяется для животных, обнаруженных мертвыми в ходе исследования.

3.6.8. Для беременных животных необходимо определять количество желтых тел.

3.6.9. Содержание матки должно быть осмотрено на наличие погибших эмбриональных клеток или плодов и жизнеспособных плодов. Необходимо определять степень резорбции для оценки относительного времени смерти концептуса.

3.7. Осмотр плодов

3.7.1. Необходимо определить пол и массу каждого плода.

3.7.2. Каждый плод должен быть осмотрен на наличие внешних изменений.

3.7.3. Плоды должны быть осмотрены на наличие изменений мягких тканей и скелета (отклонения или пороки развития, или аномалии). Классификация изменений плода предпочтительна, но не обязательна. Если классификация проводится, то критерии для определения каждой категории должны быть четко установлены. Особое внимание следует обратить на изменения половых путей, которые необходимо осмотреть на наличие признаков изменений в развитии.

3.7.4. Для грызунов примерно половина плодов из каждого помета должна быть препарирована и осмотрена на наличие изменений скелета. Оставшиеся плоды должны быть препарированы и осмотрены на наличие изменений мягких тканей с использованием принятых или соответствующих методов последовательного сечения или методов аккуратного общего вскрытия.

3.7.5. Для негрызунов, например, кроликов, каждый плод необходимо осматривать на наличие изменений мягких тканей и скелета. Органы каждого плода после вскрытия осматривают на наличие изменений мягких тканей, при вскрытии могут использоваться процедуры для дальнейшего изучения внутренней структуры сердца. Головы половины осматриваемых плодов должны быть удалены и препарированы для проведения оценки изменений мягких тканей (глаза, головной мозг, носовые ходы и язык) с использованием стандартного последовательного метода сечений или равного чувствительного метода. Органы поврежденных и неповрежденных плодов должны быть препарированы и осмотрены на наличие изменений скелета.

4. Данные, оценка результатов и отчет

4.1. Данные об испытании

4.1.1. Данные должны быть представлены индивидуально и сведены в табличную форму, демонстрирующую для каждой экспериментальной группы и каждого поколения количество животных в начале испытания, количество животных, обнаруженных мертвыми в ходе испытания или умерщвленных из гуманных соображений, время любой гибели или умерщвления, количество беременных особей, количество животных с признаками токсичности, описание наблюдаемых признаков токсичности, в том числе время появления, продолжительность и тяжесть любых токсических эффектов, тип наблюдений плода и все соответствующие данные для помета.

4.1.2. Количественные результаты должны быть оценены соответствующим статистическим методом с использованием помета в качестве единицы для анализа данных. Должен использоваться общепринятый статистический метод; статистический метод необходимо выбирать как часть общей структуры испытания. Данные о животных, которые не доживают до запланированного умерщвления, также должны быть представлены. Эти данные могут быть включены в значения для групп в соответствующих случаях. Актуальность данных для таких животных, и, следовательно, включение или исключение из значений для любой группы должны рассматриваться на индивидуальной основе.

4.2. Оценка результатов

4.2.1. Результаты испытаний токсичности для пренатального развития должны оцениваться с точки зрения наблюдаемых эффектов.

4.2.2. Оценка будет включать в себя следующую информацию:

- результаты испытаний для материнской особи и плода, в том числе оценка соотношения или его отсутствие, между воздействием исследуемого вещества на животных и частотой и тяжестью всех эффектов;

- критерии, используемые для классификации внешних изменений, изменений мягких тканей и скелета плода, если такая классификация проводилась;

- при необходимости - контрольные данные предшествующих исследований для улучшения интерпретации результатов;

- численность, используемая для расчета всех процентов или показателей;

- приемлемый статистический анализ результатов исследования (при необходимости), который должен включать достаточную информацию о методе анализа, используя которую независимый эксперт может пересмотреть и реконструировать анализ.

4.2.3. Для любого испытания, в котором демонстрируется отсутствие токсических эффектов, должно быть предусмотрено проведение дальнейших исследований для оценки поглощения и биологической доступности исследуемого вещества.

4.3. Отчет об испытании

Отчет об испытании должен включать следующие данные:

Исследуемое вещество:

- физическая природа и при необходимости физико-химические свойства;

- идентификация, в том числе номер CAS, если он известен и/или установлен;

- чистота.

Растворитель (при необходимости):

- обоснование выбора растворителя, за исключением воды.

Экспериментальные животные:

- используемый вид;

- количество и возраст животных;

- источник, условия содержания и кормления и пр.;

- индивидуальная масса животных в начале испытания.

Условия проведения испытания:

- обоснование выбора уровня доз;

- подробности приготовления исследуемого вещества, подготовки диеты, достигаемые концентрации, стабильность и однородность вводимого препарата;

- подробности введения исследуемого вещества;

- перевод содержания исследуемого вещества в пище/питьевой воде (ррm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела в день) при необходимости;

- условия окружающей среды;

- качество пищи и воды.

Результаты испытания:

Ответ материнской особи на вводимые дозы, включая, но не ограничиваясь:

- количество животных в начале испытания, количество выживших животных, количество беременных животных, количество выкидышей и преждевременных родов;

- день гибели во время испытания или количество животных, доживших до умерщвления;

- данные животных, которые не доживают до запланированного умерщвления, необходимо сообщать, но не использовать для статистических сравнений между группами;

- день наблюдения любого аномального клинического признака и его последующее развитие;

- масса тела, изменение массы тела и массы беременной матки, в том числе при необходимости, изменение массы тела с поправкой на массу беременной матки;

- потребление пищи и воды, если проводились такие оценки;

- результаты аутопсии, в том числе масса матки;

- значения NOAEL токсичности для материнской особи и токсичности для развивающегося организма.

Показатели токсичности для развития помета с имплантатами, в том числе:

- количество желтых тел;

- количество имплантаций, количество и процент живых и мертвых плодов и резорбций;

- количество и процент потерь до и после имплантации.

Показатели токсичности по дозам для развития помета с живым плодом, в том числе:

- количество и процент живого потомства;

- соотношение полов;

- масса тела плода, предпочтительно с разбивкой по полу;

- пороки внешнего развития, развития мягких тканей и скелета и другие соответствующие изменения;

- критерии для классификации при необходимости;

- общее количество и процент плодов и помета с любыми внешними изменениями, изменениями мягких тканей или скелета, а также виды и случаи отдельных аномалий и других соответствующих изменений.

Обсуждение результатов. Выводы.

4.4. Интерпретация результатов

Исследование токсичности для пренатального развития позволит получить информацию о влиянии повторного перорального воздействия вещества в период беременности. Результаты исследования должны рассматриваться в совокупности с результатами испытаний субхронической токсичности, репродуктивной токсичности, токсикокинетических и других исследований. Поскольку внимание уделяется как общей токсичности, так и токсичности для развивающегося организма, результаты исследования позволят разделять эффекты для развития организма, происходящие в отсутствие общей токсичности, и эффекты, проявляющиеся только на уровнях, которые также являются токсичными для материнских особей.

Пример 3

- Одну группу из 20 детенышей/пол/уровень доз (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) используют для определения массы мозга и нейропатологической оценки в ПНД 11. Из этих животных 10 детенышей/пол/уровень дозы (т.е. 1 самец или 1 самка из помета) гуманно забиты в ПНД 11, мозг выделен, взвешен и обработан для гистопатологической оценки. Кроме того, данные взвешивания мозга собирают, используя нефиксированный мозг из оставшихся 10 самцов и 10 самок на каждом уровне дозы.

- Еще одну группу из 20 детенышей/пол/уровень доз (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) используют для определения поведенческого онтогенеза (двигательной активности) у подростков после отъема (двигательная активность и оценка возраста полового созревания) и тестируют когнитивные функции.

- Другую группу из 20 детенышей/пол/уровень доз (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) используют для исследования моторных и сенсорных функций (слуховой испуг) и подробных клинических наблюдений. Из этой группы 10 детенышей/пол/уровень доз (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) наркотизируют и фиксируют перфузией при окончании исследования (примерно, ПНД 70). После дополнительной фиксации in situ, мозг извлекают, взвешивают и обрабатывают для нейропатологической оценки.

- Другую группу из 20 детенышей/пол/уровень доз (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) используют для тестирования когнитивных функций у юношей. Из них 10 детенышей/пол/группа (т.е. 1 самец и 1 самка из помета) при окончании тестирования забивали, мозг извлекали и взвешивали.

Таблица

N детеныша*		Количество детенышей для тестирования	Показатель/Тест
самец	самка
1	5	10 с/м + 10 с/а	ПНД 11 масса мозга/невропатология/морфометрия
		10 с/м + 10 с/а	ПНД 11 масса мозга
2	6	20 с/ц + 20 с/а	Поведенческий онтогенез (двигательная активность)
		20 с/ц + 20 с/а	Двигательная активность
		20 с/ц + 20 с/а	Половое созревание
		20 с/ц + 20 с/а	Обучение и память (ПНД 27)
3	7	20 с/ц + 20 с/а	Слуховой испуг (подростки и юноши).
		20 с/ц + 20 с/а 10 с/м + 10 с/а	Подробные клинические наблюдения. Юноши: масса мозга/нейропатология/ морфометрия ~ ПНД 70
4	8	20 с/ц + 20 с/а	Обучение и память (юноши).
		10 с/м + 10 с/а	Юноши: масса мозга