Приложение 6.7.9. Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении

Приложение 6.7.9

Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении

Идентичен международному документу OECD TG N 443 "Extended One-Generation Reproductive Toxicity Study" (ОЭСР Руководство N 443 "Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении"). Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/OECD) 28 июля 2011 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод расширенного изучения репродуктивной токсичности на одном поколении предназначен для получения информации о воздействии испытуемого вещества на репродуктивную функцию самцов и самок, а также на репродуктивную функцию и развитие потомства и, при необходимости, выявления потенциальной нейротоксичности и иммунотоксичности вещества для потомства первого поколения.

2. Общие положения

2.1. Основная цель расширенного изучения репродуктивной токсичности на одном поколении - оценить специфические периоды жизни, не охватываемые другими типами изучения токсичности, и выявить эффекты, которые могут быть результатом пре- и постнатального химического воздействия. При изучении репродуктивной функции как первый шаг в выявлении эффектов на репродуктивные органы самцов и самок должно предусматриваться использование доступной информации из других исследований с воздействием повторных доз (включая скрининговые исследования репродуктивной токсичности), или из кратковременных скрининговых испытаний эндокринных дисрапторов (например, исследование утеротропного действия; и исследование по Хершбергеру). Это может включать сперматогенез (гистопатологию семенников) у самцов и эстральные циклы, подсчет фолликулов/созревание ооцитов, состояние яичников (гистопатологию) у самок. Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении служит критерием оценки репродуктивной функции и включает взаимосвязь самцов и самок, самок и эмбрионов, самок и потомства поколения до и после полового созревания.

2.2. Метод предназначен также для оценки пре- и постнатальных эффектов химических веществ на развитие путем оценки системной токсичности для беременных и кормящих самок и молодого и взрослого потомства. Детальное исследование ключевых показателей развития, таких как жизнеспособность потомства, неонатальное здоровье, статус развития при рождении и физическое и функциональное развитие до взросления, создает предпосылки для выявления специфических органов-мишеней у потомства. В исследовании дополнительно может быть получена и/или подтверждена информация о действии изучаемого вещества на целостность и работу репродуктивных систем взрослых самцов и самок. Как правило, но не только, рассматриваются следующие параметры: функция гонад, астральный цикл, созревание спермы в эпидидимисе, поведение во время спаривания, зачатие, беременность, роды и лактация. Кроме того, информация, полученная при оценке нейротоксичности и иммунотоксичности на развивающемся потомстве, будет характеризовать потенциальные эффекты на соответствующие системы. Данные, полученные в таких исследованиях, позволяют определить уровни вещества, при которых не наблюдаются неблагоприятные эффекты (NOAELs), минимальные уровни вещества, при которых наблюдаются неблагоприятные эффекты (LOAELs), и/или провести бенчмаркинг доз для различных видов эффектов, и/или используются для характеристики эффектов, обнаруженных в предыдущих исследованиях с повторным введением вещества, и/или служат ориентиром для последующих исследований.

2.3. Клинические наблюдения и исследования патологии проводятся на всех животных для выявления токсичности с особым акцентом на целостности и эффективности репродуктивных систем самцов и самок и здоровье, росте и развитии потомства. После прекращения материнского питания из части потомства формируются специфические подгруппы (когорты 1-3, рис. 1) для дальнейших исследований, включая половую зрелость, целостность и функцию репродуктивных органов, нейрологические и поведенческие показатели и иммунные функции.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Метод включает детальное описание проведения расширенного изучения репродуктивной токсичности на одном поколении. Метод содержит описание трех когорт животных.

- Когорта 1: оценивает показатели репродуктивности и развития потомства; эта когорта может быть расширена включением поколения.

- Когорта 2: оценивает потенциальный эффект воздействия химического вещества на развивающуюся нервную систему.

- Когорта 3: оценивает потенциальный эффект воздействия химического вещества на развивающуюся иммунную систему.

3.1.2. Решение о том, анализировать ли второе поколение или исключить когорту с изучением нейротоксичности и/или когорту с изучением иммунотоксичности, должно отражать существующие знания об исследуемом веществе, так же, как запросы различных контролирующих органов. Цель метода - представить в деталях, как может проводиться исследование и рассмотреть, как должна оцениваться каждая когорта.

3.1.3. Схема ведения протокола представлена на рисунке.

3.1.4. Исследуемое вещество вводится длительно в определенных дозах нескольким группам половозрелых самцов и самок. Родительское поколение (Р) получает вещество в период, предшествующий спариванию (продолжительность воздействия выбирается на основе доступной информации об изучаемом веществе, но не менее двух недель), и в течение двух недель в период спаривания. Р самцы затем получают вещество по крайней мере до прекращения материнского питания . Продолжительность введения вещества Р самцам должна быть не менее 10 недель. Они могут получать вещество более длительное время, если создается необходимость в уточнении эффектов вещества на репродуктивную функцию. Введение вещества Р самкам продолжается во время беременности и лактации до ее окончания и отлучения помета от материнского питания (8-10 недель воздействия). потомство продолжает получать исследуемое вещество и после прекращения материнского питания до взрослого состояния. Если исследуется второе поколение, потомство получает вещество до прекращения материнского питания или до окончания исследования.

3.2. Животные

Выбор вида и линии животных

3.2.1. Выбор вида животных для изучения репродуктивной токсичности должен проводиться с осторожность и с учетом всей имеющейся информации. Однако для лучшего использования исходных данных и для сопоставимости с тестами общей токсичности предпочтение обычно отдается крысам, и критерии и рекомендации, приведенные в данном методе, относятся именно к этому виду животных. Если используются другие виды животных, необходимо дать этому обоснование и внести соответствующие изменения в протокол исследований. Линии с низкой плодовитостью или с хорошо известной высокой частотой спонтанных дефектов развития использоваться не должны.

Возраст, масса тела и другие критерии

3.2.2. В исследованиях должны использоваться здоровые животные-родители, ранее не подвергавшиеся экспериментальным процедурам. Должны изучаться и самцы, и самки, самки должны быть нерожавшими и небеременными. Р животные должны быть половозрелыми, близкими по весу (в пределах групп одного пола) в начале воздействия, близкими по возрасту (около 90 дней) при спаривании и типичными для вида и линии животных, выбранных для исследования. Животные должны быть акклиматизированы в течение не менее 5 дней после привоза. Животные произвольно отбираются для контрольных и опытных групп так, чтобы в результате средняя масса тела в группах оказалась сопоставимой ( от средней).

Условия содержания и кормления

3.2.3. Температура в экспериментальной комнате для животных должна быть . Относительная влажность воздуха должна быть в пределах 30-70%, идеальный диапазон - 50-60%. Освещение должно быть искусственным, с последовательным чередованием: 12 часов света и 12 часов темноты. Особое внимание должно быть уделено содержанию в рационе фитоэстрогенов, поскольку высокие уровни фитоэстрогенов в корме могут повлиять на некоторые показатели репродуктивности. Рекомендуются стандартизованные корма с известным составом, в которых снижено содержание эстрогенных веществ. На выбор корма может повлиять необходимость обеспечить его хорошее смешение с изучаемым веществом, если оно вводится алиментарным путем. Содержание, гомогенность и стабильность изучаемого вещества в корме должны быть проверены. Корм и питьевая вода должны регулярно анализироваться на загрязнения. Образцы каждой партии корма, используемого в исследованиях, должны храниться в соответствующих условиях (например, заморожены при -20°С) до завершения отчета на случай, если результаты потребуют дальнейших анализов ингредиентов рациона.

3.2.4. Животные должны быть размещены в клетках небольшими группами одного пола и уровня воздействия. Для предупреждения возможности повреждений, они могут быть размещены в клетках по отдельности (например, самцы после периода спаривания). После подтверждения коитуса самки, предположительно беременные, размещаются изолированно в клетках для родов, где они обеспечиваются подходящими и нужными для обустройства гнезда материалами. Пометы содержатся вместе с их матерями до прекращения материнского питания. животные должны содержаться небольшими группами одного пола и уровня воздействия с момента прекращения материнского питания до конца исследований. При необходимости животные могут содержаться индивидуально. Уровень фитоэстрогенов, обнаруживаемый при выборочных исследованиях материала подстилки, должен быть минимальным.

Количество и идентификация животных

3.2.5. Каждая экспериментальная и контрольная группы должна содержать достаточное количество животных, чтобы получить не менее 20 беременных самок на каждую дозовую группу. Целью является получение достаточно беременностей для обеспечения значимой оценки возможного влияния вещества на фертильность, беременность, материнское поведение животных поколения Р, а также рост и развитие потомства в период от зачатия до зрелости. Неудача с достижением намеченного количества беременных животных не обязательно делает исследование недействительным, а его результаты должны оцениваться в каждом конкретном случае с рассмотрением возможных причинных связей с изучаемым веществом.

3.2.6. Каждое Р животное до начала воздействия вещества получает индивидуальный идентификационный номер. Если ретроспективные данные лабораторных наблюдений свидетельствуют о том, что значительное количество самок могут не иметь регулярного (4 или 5 дней) эстрального цикла, то рекомендуется оценка эстральных циклов до начала воздействия вещества. В качестве варианта может быть увеличен размер групп так, чтобы гарантировать, что не менее 20 самок в каждой группе будут иметь регулярные (4 или 5 дней) эстральные циклы к началу воздействия вещества. Все потомство индивидуально маркируется во время первого осмотра новорождённых в первый постнатальный день (PND) 0 или 1. Индивидуальные записи для каждого помета должны продолжаться в течение всего исследования для всех животных и, если нужно, для животных .

3.3. Изучаемое вещество

Имеющаяся информация об изучаемом веществе

3.3.1. Обзор существующей информации важен для выбора способа введения, растворителя, вида животных, доз и возможных модификаций частоты введения вещества. Поэтому вся информация, имеющая отношение к изучаемому веществу, а именно физико-химические, токсикокинетические (включая видо-специфический метаболизм), токсикодинамические свойства, зависимости структура-активность (SARs), метаболические процессы in vivo, результаты предыдущих исследований токсичности и информация о структурных аналогах должна приниматься во внимание при планировании расширенного изучения репродуктивной токсичности на одном поколении. Предварительная информация об абсорбции, распределении, метаболизме и выведении, биоаккумуляции может быть получена, исходя из химической структуры, физико- химических данных, изучения степени связывания протеина плазмы или токсикокинетики (ТК), в то время как результаты исследований токсичности дают дополнительную информацию, например, о NOAEL, метаболизме или индукции метаболизма.

Значимость токсикокинетических данных

3.3.2. Хотя это и не обязательно, ТК данные из ранее проведенных оценок дозовых зависимостей или других исследований исключительно полезны при планировании проведения исследования, выбора уровней доз и интерпретации результатов. Особенно полезны данные, которые 1) подтверждают воздействие на развивающийся плод или детенышей изучаемого вещества (или соответствующих метаболитов), 2) обеспечивают оценку внутренней дозиметрии и 3) оценивают возможность зависимого от дозы насыщения кинетических процессов. Дополнительные ТК данные, такие как метаболические профили, кривые концентрация-время и т.д. также должны рассматриваться при их наличии. Дополнительные ТК данные могут быть также собраны во время основного исследования, если только это не создает помех сбору и интерпретации результатов основного исследования.

Как общий ориентир может использоваться следующий набор ТК данных:

- поздние сроки беременности (например, 20 день) - материнская кровь и кровь плода;

- середина лактации (PND 10) - материнская кровь, кровь детенышей и/или молоко;

- вскоре после прекращения материнского питания (например, PND 28) - образцы крови отъемышей.

Выбор конкретных веществ для исследований (например, исходного вещества и/или метаболитов) и схем отбора проб должен быть гибким. Например, количество и время отбора проб в заданный день может зависеть от способа введения вещества и предварительной информации о характеристиках ТК у небеременных животных. В исследованиях с введением вещества с кормом достаточно отбирать пробы ежедневно однократно в установленное время, в то время как введение вещества с помощью зонда может потребовать повторного отбора проб в течение дня для более надежной оценки диапазона внутренних доз. Тем не менее, нет необходимости получать полные кривые концентрация-время для каждого из дней отбора проб. При необходимости кровь изучаемого помета может быть объединена в пределах групп каждого пола для фетального и неонатального анализов.

Способ введения

3.3.3. Выбор способа введения должен проводиться с учетом пути (путей) поступления, характерного(ных) для воздействия вещества на человека. Хотя протокол предназначен для введения изучаемого вещества с пищей, он может быть модифицирован для ведения вещества другими способами (с питьевой водой, зондом, ингаляционно, через кожу) в зависимости от характеристик вещества и требующейся информации.

Выбор растворителя

3.3.4. При необходимости изучаемое вещество растворяется или суспензируется в подходящем растворителе. Рекомендуется, по возможности, отдавать предпочтение использованию водного раствора/суспензии, только потом рассматривать использование масляного раствора/суспензии (например, в кукурузном масле). Для растворителей (кроме воды) должны быть известны характеристики токсичности. Использование потенциально токсичных растворителей (например, ацетона, ДМСО) должно исключаться. Должна быть определена стабильность изучаемого вещества в растворителе. Если для введения вещества используется растворитель или другая добавка, должны рассматриваться такие характеристики их, как: влияние на абсорбцию, распределение, метаболизм или задержку изучаемого вещества; эффекты на химические свойства изучаемого вещества, которые могут изменить характеристики его токсичности; влияние на потребление пищи или воды, или на статус питания животных.

3.4. Выбор доз

3.4.1. Как правило, исследование должно включать не менее 3-х дозовых уровней и контроль. При выборе дозовых уровней исследователь должен рассмотреть всю имеющуюся информацию, включая информацию о дозах в предыдущих исследованиях, данные ТК для небеременных животных, степень выделения с молоком и оценку воздействия на людей. Если имеющиеся ТК данные свидетельствуют о зависимом от дозы насыщении ТК процессов, необходимо позаботиться о том, чтобы избежать использования высоких дозовых уровней, при которых отчетливо проявляется насыщение, при условии, конечно, что ожидаемые уровни воздействия на людей будут значительно ниже точки насыщения. В таких случаях наивысший уровень доз должен соответствовать или быть чуть выше точки перегиба кривой при переходе ТК к нелинейному поведению.

3.4.2. При отсутствии надежных ТК данных дозовые уровни должны основываться на токсических эффектах, если нет ограничений, обусловленных физико-химической природой изучаемого вещества. Если дозовые уровни базируются на токсичности, наивысшая доза должна выбираться с целью вызвать системную токсичность, но не гибель или тяжелые страдания животных.

3.4.3. Градация дозовых уровней должна выбираться таким образом, чтобы выявить зависимость эффекта от дозы и установить NOAELs (недействующие уровни) или дозы, близкие к ним, чтобы иметь возможность для установления бенчмарк-дозы для наиболее чувствительного показателя (показателей). Во избежание большого разброса между NOAELs и LOAELs часто достаточно двух- или четырехкратного интервала между дозами. Дополнительная 4-я группа животных часто предпочтительнее использования очень большого интервала (например, более чем 10-кратного) между дозами.

3.4.4. За исключением введения изучаемого вещества, контрольная группа животных содержится идентично опытным группам животных. Эта группа не подвергается никакому воздействию либо воздействие имитируется, либо контрольные животные получают растворитель, если растворитель используется для введения изучаемого вещества. Если применяется растворитель, контрольная группа должна получать его в наибольшем из используемых в исследовании объеме.

3.5. Испытание с предельной дозой

3.5.1. Если токсичность не выявлена в исследованиях с повторным введением вещества в дозе не менее 1 000 мг/кг веса тела/день, или если токсичности быть не должно, исходя из данных для соединений, близких по структуре или метаболизму, и если эти данные свидетельствуют о сходстве in vivo/in vitro метаболических свойств, исследования с использованием нескольких дозовых уровней могут быть не обязательными. В таких случаях расширенное изучение репродуктивной функции на одном поколении может быть проведено с использованием контрольной группы и единственной дозы не менее 1 000 мг/кг веса тела/день. Однако если в этой единственной дозе будет выявлена репродуктивная или связанная с развитием токсичность, могут потребоваться дальнейшие исследования с меньшими дозами для определения NOAEL. Эти соображения относительно сокращенного исследования применимы только если воздействие на людей не свидетельствует о необходимости изучения более высоких дозовых уровней.

3.6. Процедуры исследования

Воздействие на потомство

3.6.1. Добавление в корм является предпочтительным методом воздействия вещества. Если изучаемое вещество вводится с помощью зонда, следует обратить внимание на то, что детеныши обычно получают вещество только опосредованно с молоком до тех пор, пока прямое введение вещества не начнется для них с момента прекращения материнского питания. В исследованиях с поступлением вещества с кормом или питьевой водой детеныши дополнительно получают изучаемое вещество, когда они начинают самостоятельно питаться на последней неделе периода лактации. Модификации в проведении исследования должны рассматриваться, если выделение изучаемого вещества с молоком незначительно и если нет уверенности в том, что воздействие вещества на потомство продолжается. В таких случаях прямое воздействие на детенышей во время периода лактации должно рассматриваться на основе имеющейся ТК информации, токсичности вещества для потомства или изменений био-маркеров. Тщательное рассмотрение преимуществ и недостатков должно предшествовать проведению исследований с прямым воздействием вещества на детенышей-сосунков.

График воздействия вещества и введение доз

3.6.2. Информация об эстральных циклах, гистопатологии репродуктивного тракта самцов и самок и анализы тестикулярной/эпидидимальной спермы могут быть получены из предыдущих исследований токсичности с повторным введением вещества адекватной продолжительности. Длительность воздействия до спаривания в расширенном изучении репродуктивной токсичности на одном поколении связана с выявлением эффектов или функциональных изменений, которые могут нарушать поведение при спаривании и зачатие. Введение вещества до спаривания должно быть достаточно длительным для достижения стационарного состояния условий воздействия на Р самцов и самок. 2-недельное введение вещества в большинстве случаев рассматривается как адекватное и для самцов, и для самок. Для самок это включает 3-4 полных эстральных цикла и должно быть достаточным для выявления неблагоприятных эффектов на цикличность. Для самцов это эквивалентно времени, необходимому для эпидидимального транзита созревающих сперматозоидов и должно обеспечить выявление посттестикулярных эффектов на сперматозоиды (во время финальных стадий сперматогенеза и созревания эпидидимальной спермы) при спаривании. К моменту умерщвления, когда планируется исследование тестикулярной и эпидидимальной гистопатологии и анализ параметров спермы, Р и самцы будут находиться под воздействием изучаемого вещества по крайней мере в течение полного процесса сперматогенеза.

3.6.3. Сценарии воздействия вещества до спаривания для самцов могут быть перестроены, если в предыдущих исследованиях были выявлены тестикулярная токсичность (ухудшение сперматогенеза) или действие на целостность или функцию сперматозоидов. Аналогично для самок известные эффекты изучаемого вещества на эстральный цикл и, таким образом, на сексуальную восприимчивость оправдывают использование других сценариев воздействия. В особых случаях приемлемо, что воздействие на Р самок начинается только после обнаружения сперматозоидов в мазке.

3.6.4. После определения периода воздействия вещества до спаривания, изучаемое вещество должно вводиться животным постоянно 7 дней в неделю до умерщвления. Метод введения вещества должен быть одинаковым для всех животных. Воздействие должно продолжаться в течение 2-х недель в период спаривания и, для Р самок, в течение беременности и лактации до умерщвления после прекращения материнского питания. Самцы должны получать вещество таким же образом до умерщвления в то время, когда животные перестают получать материнское питание. При вскрытии приоритет должен отдаваться самкам, которые должны быть вскрыты в один и тот же (или близкий) день лактации. Вскрытие самцов может быть отсрочено на большее число дней в зависимости от возможностей лаборатории. За исключением уже инициированного во время периода лактации, прямое воздействие вещества на выбранных самцов и самок должно начинаться с момента прекращения материнского питания и продолжаться до вскрытия по графику в зависимости от назначения когорт.

3.6.5. Для веществ, вводимых с диетой или питьевой водой, важно убедиться, что используемые количества изучаемого вещества не нарушают нормальное питание или водный баланс. Если изучаемое вещество вводится с диетой, может использоваться либо постоянная концентрация, либо постоянный уровень доз в переводе на массу тела животного, выбор должен быть точно определен.

3.6.6. Если вещество вводится зондом, объем жидкости, вводимый одномоментно, не должен превышать 1 мл/100 г веса тела (максимум для масла, например, кукурузного - 0,4 мл/100 г веса тела). Для изучаемых веществ, за исключением едких и раздражающих, у которых обычно при увеличении концентрации раздражающие эффекты усугубляются, вариабельность объема должна быть минимизирована подбором концентраций так, чтобы все дозовые уровни вводились в одном и том же объеме. Вещество должно вводиться каждый день в одно и то же время. Доза для каждого животного должна основываться на самом последнем определении индивидуального веса тела и устанавливаться по крайней мере еженедельно для взрослых самцов и взрослых небеременных самок, каждые 2 дня для беременных самок и для животных при введении вещества до прекращения материнского питания и в течение 2 недель после прекращения материнского питания. Если ТК данные свидетельствуют о низком плацентарном переносе изучаемого вещества, может возникнуть необходимость в коррекции дозы, вводимой зондом, в течение последней недели беременности для предупреждения введения дозы, чрезмерно токсичной для материнского организма. В день родов самок не следует запаивать зондом или вводить им вещество каким-либо другим способом, при котором животных нужно брать в руки; пропуск введения изучаемого вещества в этот день предпочтительнее нарушения процесса рождения.

Спаривание

3.6.7. Каждая Р самка помещается с одним произвольно выбранным не родственным самцом из той же дозовой группы (спаривание 1:1) до подтверждения коитуса или до истечения двух недель. Если нет уверенности в надежности самцов, например, из-за гибели самцов перед спариванием, тогда могут быть повторно использованы самцы, которые уже участвовали в спаривании (1:1), так, чтобы оказались спаренными все самки. День беременности 0 определяется как день, в который спаривание подтверждается обнаружением вагинальной пробки или спермы. Животные должны быть размещены раздельно как можно скорее после установления факта спаривания. Если спаривания не произошло в течение 2 недель, то животные должны быть размещены раздельно без дальнейшей возможности спаривания. Спарившиеся животные должны быть четко идентифицированы в данных.

Размер помета

3.6.8. На 4-й день после рождения размер каждого помета может быть отрегулирован уничтожением лишних детенышей так, чтобы сохранить в приплоде пять самцов и пять самок. Выборочное удаление детенышей, например, на основании величины массы тела, не требуется. Если количество детенышей - самцов или самок не позволяет сформировать помет в соотношении пять самцов/пять самок, можно ограничиться частичным соответствием (например, шесть самцов и четыре самки).

Выбор детенышей для исследований после прекращения материнского питания

3.6.9. После прекращения материнского питания (около 21 PND) детеныши из всех имеющихся пометов по 20 на одну дозируемую группу и контроль выбираются для дальнейших исследований и содержатся до половой зрелости (если не требуется более раннее завершение эксперимента). Детеныши выбираются произвольно, за исключением малорослых животных (с массой тела более чем на два стандартных отклонения меньше средней массы соответствующего помета), которые, не являясь репрезентативными, не должны в дальнейшем использоваться в исследовании.

На 21 PND отобранные детеныши произвольно распределяются в три когорты.

Когорта 1 (1А и 1Б) = изучение репродуктивной токсичности и токсического действия на развитие.

Когорта 2 (2А и 2Б) = изучение нейротоксичности для развивающегося организма.

Когорта 3 = изучение иммунотоксичности для развивающегося организма.

Когорта 1А: один детеныш-самец и один детеныш-самка/помет/группу (20 животных каждого пола в группе): первоочередной выбор для первичной оценки эффектов на репродуктивные системы и общей токсичности.

Когорта 1Б: одна группа детенышей-самцов и одна группа детенышей-самок (20 животных каждого пола в группе): первоочередной выбор для последующей оценки репродуктивных характеристик путем спаривания животных и для получения дополнительных гистопатологических данных в случаях, если изучается вещество, предположительно влияющее на репродуктивную или эндокринную системы, или если результаты в когорте 1А вызывают сомнение.

Когорта 2А: всего 20 детенышей на группу (10 самцов и 10 самок на группу; один детеныш-самец и один детеныш-самка/помет) предназначены для нейроповеденческих исследований с последующей оценкой нейрогистопатологии у взрослых.

Когорта 2Б: всего 20 детенышей на группу (10 самцов и 10 самок на группу; один детеныш-самец и один детеныш-самка/помет) предназначены для оценки нейрогистопатологии после прекращения материнского питания (PND 21 или PND 22). Если количество животных недостаточно, предпочтение отдается распределению животных в Когорту 2А.

Когорта 3: всего 20 детенышей на группу (10 самцов и 10 самок на группу; один детеныш на помет, где возможно). Дополнительные животные могут потребоваться из контрольной группы в качестве позитивного контроля в исследовании реакции Т-клеток зависимых антител на PND .

3.6.10. Если количество детенышей в помете недостаточно для включения во все когорты, преимущество имеет когорта 1, поскольку она может быть использована для получения поколения . Дополнительные животные могут потребоваться для любой когорты в особых случаях, например, если вещество предположительно является нейротоксикантом, иммунотоксикантом, или способно нарушать репродуктивную функцию. Эти детеныши могут использоваться для исследований в разные временные точки или для оценки дополнительных показателей. Детеныши, не включенные в когорты, могут быть направлены на клиническую биохимию и некропсию.

Повторное спаривание Р животных

3.6.11. Повторное спаривание Р животных обычно не рекомендуется, поскольку в его процессе утрачивается важная информация о числе имплантаций первого помета (и, таким образом, данных о постимплантационных и перинатальных потерях, индикаторах возможного тератогенного потенциала). При необходимости подтвердить или объяснить эффект воздействия вещества на самок лучше расширить исследование за счет включения спаривания поколения животных. Тем не менее второе спаривание Р самцов с интактными самками представляет возможность для уточнения сомнительных результатов или дальнейшей характеристики эффектов на фертильность, наблюдавшихся при первом спаривании.

Прижизненные наблюдения

3.7. Клинические наблюдения

3.7.1. Общие клинические наблюдения за Р и выбранными животными проводятся один раз в день. В случае введения вещества зондом, клинические наблюдения должны проводиться до и после введения (для выявления возможных признаков токсичности, связанных с пиком концентрации вещества в плазме). Изменения поведения при родах, признаки трудных или длительных родов и все признаки токсичности должны быть зафиксированы. Дважды в день, а в выходные дни - один раз в день, все животные должны осматриваться для выявления тяжелой интоксикации, заболевания или гибели.

3.7.2. Дополнительно проводится еженедельное более детальное обследование всех Р и животных (после прекращения материнского питания), которое может совмещаться со взвешиванием, что минимизирует стресс, возникающий у животного при взятии его в руки. Осмотры должны проводиться с осторожностью и регистрироваться с использованием систем, определенных исследовательской лабораторией. Необходимо убедиться, что вариации условий исследования минимальны. Отмечаемые признаки интоксикации должны включать, не ограничиваясь этим, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, наличие секреции и экскреции и автономной активности (например, слезотечение, пилоэрекцию, размер зрачка, необычные дыхательные движения). Изменения в походке, позе, отношении к уходу, наличие клонических или тонических движений, стереотипия (например, слишком интенсивный груминг, повторяющиеся круговые движения) или странное поведение (например, самоповреждение, движение задом наперед) также должны фиксироваться.

Масса тела и потребление пищи/воды

3.7.3. Р животных взвешивают в первый день начала введения вещества и затем, по крайней мере, раз в неделю. Р самок взвешивают в течение лактации по тем же дням, что и детенышей из их пометов. Всех животных взвешивают индивидуально в день прекращения материнского питания (PND 21) и затем не менее раза в неделю. Масса тела определяется также в день достижения половой зрелости (завершение отделения крайней плоти или раскрытие вагины). Все животные взвешиваются при умерщвлении.

3.7.4. Во время исследования потребление пищи и воды (в случае, если изучаемое вещество вводится с питьевой водой) учитывается еженедельно в тот же день, когда животные взвешиваются. Потребление пищи каждой клеткой животных учитывается еженедельно, начиная с формирования когорт.

Эстральный цикл

3.7.5. Предварительная информация о влиянии изучаемого вещества на эстральный цикл уже может иметься в предыдущих исследованиях с повторным введением вещества и может использоваться при разработке специфических для данного вещества условий расширенного исследования репродуктивной токсичности. Обычно оценка эстральной цикличности (по вагинальной цитологии) начинается с момента начала воздействия вещества и продолжается до успешного спаривания или до истечения 2 недель периода спаривания. Если самки до начала воздействия вещества были отсортированы по нормальным эстральным циклам, то полезно продолжать мазки после начала введения вещества, но если с началом воздействия вещества появляются неспецифические эффекты (такие, как снижение потребления пищи), тогда может потребоваться время для адаптации животных к воздействию вещества в течение около двух недель до начала 2-недельного периода взятия мазков, предшествующего спариванию. Если период воздействия на самок, таким образом, увеличивается (т.е. до 4 недель перед спариванием), должно быть обращено внимание на использование более молодых животных и на увеличение времени воздействия вещества на самцов перед спариванием. При взятии вагинальных/цервикальных клеток следует проявлять осторожность, чтобы не вызвать повреждения слизистой с последующей индукцией псевдобеременности.

3.7.6. Вагинальные мазки должны исследоваться ежедневно у всех самок когорты 1А с момента раскрытия вагины до первого обнаружения ороговевших чешуек в мазке для определения интервала между этими двумя событиями. Эстральные циклы для всех самок в когорте 1А должны также наблюдаться в течение двухнедельного периода, начиная примерно с PND 75. Кроме того, если возникает необходимость спаривания поколения , исследования вагинальной цитологии в когорте 1Б проводятся с момента образования пар животных до подтверждения спаривания.

Спаривание и беременность

3.7.7. В дополнение к стандартным показателям (таким как масса тела, потребление пищи, клинические наблюдения, включая регистрацию смертности/заболеваемости) фиксируются даты образования пар, даты оплодотворения и родов, рассчитываются прекоитальный интервал (образование пары - оплодотворение) и длительность беременности (оплодотворение - роды). Р самки должны тщательно исследоваться во время ожидаемых родов для выявления каких-либо признаков дистоции. Любые аномалии в гнездовом поведении или в уходе за потомством должны быть зарегистрированы.

3.7.8. День наступления родов - день лактации 0 (LD 0) для материнских особей и постнатальный день 0 (PND 0) для потомства. Как вариант, все сравнения могут также быть основаны на пост-коитальном времени для исключения искажения данных постнатального развития из-за различий в продолжительности беременности; тем не менее, должна также проводиться регистрация времени родов. Это особенно важно, если изучаемое вещество оказывает влияние на продолжительность беременности.

Параметры потомства

3.7.9. Каждый помет должен быть исследован как можно скорее после родов (PND 0 или 1) для установления числа и пола детенышей, мертворождённых и живорождённых, наличия явных аномалий (внешне видимые уродства, такие как волчья пасть, подкожные геморрагии, анормальная окраска или текстура кожи, наличие пуповины, отсутствие молока в желудке, наличие высохших выделений). Кроме того, первое клиническое обследование новорождённых должно включать качественную оценку температуры тела, степени активности и реакции на взятие в руки. Детеныши, найденные мертвыми день PND 0 или позднее, должны быть исследованы на возможные дефекты и причину смерти. Живые детеныши подсчитываются и взвешиваются индивидуально на PND 0 или PND 1, а затем регулярно, по крайней мере, на 4, 7, 14 и 21 дни после рождения. Клинические обследования, соответствующие возрасту животных, должны повторяться при взвешивании потомства или более часто, если при рождении были обнаружены специфические изменения. Отмеченные симптомы могут включать, не ограничиваясь этим, внешние уродства, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых, наличие выделений и автономной активности. Изменения в походке, позе, отношении к взятию в руки, наличие клонических или тонических движений, стереотипия или странное поведение также должны фиксироваться.

3.7.10. Аногенитальное расстояние (AGD) у каждого детеныша должно быть измерено хотя бы один раз в период от PND 0 до PND 4. Детеныши должны быть взвешены в день измерения AGD и полученное значение AGD должно быть стандартизовано с размерами детенышей, предпочтительно через корень кубический из массы тела. Наличие сосков/околососковых кружков у детенышей-самцов должно контролироваться на PND 12 или 13.

3.7.11. Все отобранные животные ежедневно исследуются на отделение слизистой оболочки препуция от основания полового члена/раскрытие вагины для самцов и самок, соответственно, исследования начинаются раньше дня ожидаемого изменения этих показателей с тем, чтобы выявить раннее наступление сексуальной зрелости. Должны отмечаться любые аномалии половых органов, такие как персистентные вагинальные нити, гипоспадия или расщепление полового члена. Сексуальная зрелость животных сравнивается с физическим развитием путем определения возраста и массы тела при отделении слизистой оболочки препуция от основания полового члена или раскрытии вагины для самцов и самок, соответственно.

Последующее изучение потенциальной репродуктивной токсичности (когорта 1Б)

3.7.12. Когорта 1Б животных может получать изучаемое вещество до PND 90 и, если необходимо, использоваться для получения поколения . Самцы и самки из одной дозовой группы должны быть попарно размещены (избегая спаривания потомства одних и тех родителей) на 2 недели, начиная с PND 90 или позже, но не позднее PND 120. Процедура должна быть аналогичной спариванию Р животных. Однако доказано, что достаточно наблюдать за потомством до PND 4, не продлевая эксперимент до прекращения материнского питания или более.

3.8. Оценка потенциальной нейротоксичности на развивающемся организме
(когорты 2А и 2Б)

3.8.1. Десять самцов и 10 самок когорты 2А животных и 10 самцов и 10 самок когорты 2Б животных из каждой группы, получающих изучаемое вещество (для каждой когорты: 1 самец и 1 самка на помет; все пометы представлены по крайней мере 1 детенышем; выбираются произвольно) должны использоваться для нейротоксикологических исследований. Когорта 2А животных должна использоваться для изучения слухового испуга, моторной активности, функциональных наблюдений и нейропатологических оценок. Необходимо позаботиться, чтобы вариации условий эксперимента были минимальными и не имели постоянной связи с воздействием вещества. На поведение животных могут влиять такие условия, как уровень шума, температура, освещенность, запахи, время дня и отвлекающие внимание факторы окружающей среды. Результаты нейротоксикологических оценок должны интерпретироваться с учетом соответствующих исходных контрольных уровней. Когорта 2Б используется для оценки нейропатологии нa PND 21 или PND 22.

3.8.2. Изучение слухового испуга должно выполняться на PND 24 с использованием когорты 2А. День исследования должен быть уравновешен среди экспериментальных и контрольных групп. Каждая сессия состоит из 50 опытов. При выполнении теста слухового испуга средняя амплитуда ответа должна определяться для каждого блока из 10 опытов (5 блоков по 10 опытов) в условиях тестирования, оптимальных для привыкания внутри сессии. Эти процедуры должны соответствовать OECD TG 426.

3.8.3. В соответствующее время между PND 63 и PND 75 когорта 2А животных исследуется с помощью батареи функциональных наблюдений и автоматизированного теста моторной активности. Эти процедуры должны соответствовать OECD TG 424 и 426. Батарея функциональных наблюдений включает полное описание внешнего вида животного, поведения и функциональной целостности. Это изучается посредством наблюдений животного в домашней клетке, после переноса на стандартную арену наблюдений (открытое поле), где животное свободно передвигается, и посредством манипуляционных тестов. Тестирование должно идти от менее к более интерактивному. Перечень показателей приведен в прилож. А. Все животные внимательно наблюдаются опытными наблюдателями, не имеющими данных об уровнях воздействия вещества на животных, и использующими стандартизованные процедуры для минимизации влияния на животных. По возможности постоянно проводить тестирование должны одни и те же наблюдатели. Если это невозможно, требуется доказательство возможности замены наблюдателя без снижения надежности получаемых данных. Для каждого параметра батареи должны использоваться точно экспериментально установленные шкалы и критерии расчета. По возможности должны использоваться точные количественные оценки результатов наблюдений. Моторная активность каждого животного изучается индивидуально. Сессия должна быть достаточно длительной для подтверждения приспособления контрольных животных к режиму исследований. Моторная активность должна измеряться аппаратом автоматической регистрации активности, способным выявлять и возрастание, и снижение активности (т.е. базовый уровень активности, измеряемый устройством, не должен быть ни столь низким, чтобы не давать возможности определения снижения активности, ни столь высоким, чтобы не давать возможности определения роста активности). Каждое устройство должно быть тестировано по стандартным процедурам, чтобы гарантировать, насколько возможно, надежность работы, как для разных приборов, так и разных дней исследований. Группы животных, получающих изучаемое вещество, должны, по возможности, быть сбалансированы по времени исследований так, чтобы избежать влияния на активность циркадных ритмов.

3.8.4. Если существующая информация указывает на необходимость применения других функциональных тестов (сенсорных, социальных, когнитивных), это должно быть сделано без помех для других тестов, используемых в исследовании. Если новые тесты выполняются на тех же животных, что и вышеперечисленные стандартные тесты, они должны быть спланированы так, чтобы не нарушать целостности стандартных тестов. Дополнительные процедуры могут оказаться особенно полезными, если эмпирические наблюдения, ожидаемые эффекты или механизм действия указывают на специфический тип нейротоксичности.

3.9. Оценка потенциальной иммунотоксичности на развивающемся организме (когорта 3)

3.9.1. На PND 56 ( дня) 10 самцов и 10 самок когорты 3 животных, из каждой из экспериментальных групп (1 самец и 1 самка на помет, все пометы представлены хотя бы 1 детенышем, произвольно выбранным) должны использоваться в исследовании Т-клеточно-зависимой реакции антител, т.е. первичного иммунного ответа IgM-антител на Т-клеточно-зависимый антиген, например, эритроциты овцы (SRBC) или гемоцианин фиссуреллы (KLH), в соответствии с общепринятыми процедурами изучения иммунотоксичности. Реакция может быть оценена подсчетом специфических бляшко-образующих клеток (PFC) в селезенке или определением титра SRBC- или KLH- специфичных IgM-антител в сыворотке методом иммуноферментного анализа ELISA на пике реакции. Реакция, как правило, достигает пика на 4-й (PFC) или 5-й (ELISA) день после внутривенного введения. Если первичный иммунный ответ оценивается посредством подсчета бляшко-образующих клеток, допустимо оценивать подгруппы животных в разные дни при условии, что иммунизация и умерщвление подгрупп распределены во времени так, чтобы PFC подсчитывались на пике реакции, и что подгруппы содержат равное число самцов и самок из потомства всех дозовых групп, включая контроль, и что животные в подгруппах примерно одного постнатального возраста. Воздействие изучаемого вещества продолжается до дня, предшествующего отбору селезенок для реакции PFC или сыворотки ELISA анализа.

3.10. Исследования при умерщвлении животных

3.10.1. Клиническая биохимия/гематология.

3.10.1.1. Системные эффекты должны контролироваться у всех Р животных. Кровь, взятая при умерщвлении у 10 произвольно выбранных Р самцов и самок из каждой экспериментальной группы, используется для частичного или полного гематологического анализа, клинической биохимии, анализа Т4 или TSH или исследований, предлагаемых профилем известных эффектов изучаемого вещества. Должны быть исследованы следующие гематологические параметры: гематокрит, концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, общий лейкоцитоз и лейкоцитарная формула, количество тромбоцитов и время свертываемости крови. Исследования плазмы или сыворотки должны включать: глюкозу, общий холестерин, мочевину, креатинин, общий белок, альбумин и не менее двух ферментов - индикаторов гепатоцеллюлярных эффектов (таких как аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гамма глютамил транспептидаза и сорбитол дегидрогеназа). Измерение дополнительных ферментов и желчных кислот при определенных условиях может дать полезную информацию. Дополнительно кровь от всех животных может быть взята и храниться для возможных анализов в последующее время для того, чтобы прояснить неоднозначные эффекты или получить данные внутреннего воздействия. Если не предусматривается второе спаривание Р животных, образцы крови забираются сразу до или во время умерщвления. Если эксперимент продолжается, образцы крови должны отбираться за несколько дней до второго спаривания животных. Если существующие данные исследований с повторным введением вещества не свидетельствуют о том, что вещество на этот параметр не влияет, до умерщвления животных должен быть проведен анализ мочи по следующим показателям: внешний вид, объем, осмотическое давление и удельный вес, рН, белок, глюкоза, кровь и клетки крови, клетки некротической ткани. Моча также может собираться для мониторинга экскреции изучаемого вещества и/или его метаболита(ов).

3.10.1.2. Системные эффекты должны также отслеживаться у животных. Кровь, взятая натощак при умерщвлении у 10 произвольно выбранных в когорте 1А самцов и самок из каждой экспериментальной группы, используется для стандартной клинической биохимии, включая оценку уровня в сыворотке гормонов щитовидной железы (Т4 и TSH), гематологию (общий лейкоцитоз и лейкоцитарная формула плюс количество эритроцитов) и анализ мочи.

3.10.1.3. Излишек детенышей на PND 4 является предметом некропсии и может использоваться для измерения концентраций в сыворотке гормона Т4 щитовидной железы. При необходимости неонатальная (PND 4) кровь пометов объединяется для биохимических анализов или определения гормонов щитовидной железы. Кровь для анализов Т4 и TSH отбирается также при некропсии на PND 22 ( детеныши, не включенные в когорты).

3.10.2. Параметры спермы.

3.10.2.1. Параметры спермы должны быть измерены у всех самцов поколения Р, если только нет данных об отсутствии эффектов на сперму в 90-дневном опыте. Исследования параметров спермы должны проводиться во всей когорте 1А самцов.

3.10.2.2. При умерщвлении регистрируется масса семенников и эпидидимисов всех Р и (когорта 1А) самцов. По крайней мере, один семенник и один эпидидимис сохраняются для гистопатологического изучения. Оставшиеся эпидидимисы используется для определения резервов сперматозоидов в хвосте эпидидимиса. При этом сперма из хвоста эпидидимиса забирается с использованием методов, минимизирующих повреждения, изменяющие подвижность и морфологию сперматозоидов.

3.10.2.3. Подвижность сперматозоидов может оцениваться или непосредственно по умерщвлению, или сохраняется для позднейших анализов. Процент активно двигающихся сперматозоидов может определяться или субъективно, или объективно с помощью компьютерных методов анализа. Для оценки морфологии сперматозоидов образец эпидидимальной спермы изучается в фиксированном препарате и не менее 200 сперматозоидов классифицируются как нормальные или анормальные. Примеры морфологических аномалий спермы могут включать слипание, отсутствие хвоста, деформации головок и хвостов. Деформация или увеличение головок сперматозоидов свидетельствуют о дефектах сперматогенеза.

3.10.2.4. Если образцы спермы замораживаются, изучение подвижности проводится во время некропсии, анализы могут быть проведены только для контрольных самцов и получавших наивысшую дозу вещества. Однако, если выявляются эффекты, связанные с воздействием изучаемого вещества, образцы спермы должны исследоваться и в группах, получавших меньшие дозы вещества.

3.11. Некропсия

3.11.1. В момент умерщвления или гибели во время эксперимента все Р и животные исследуются макроскопически для выявления структурных аномалий или патологических изменений. Особое внимание должно уделяться органам репродуктивной системы. Детеныши, которые были из гуманных соображений умерщвлены в состоянии агонии, и погибшие детеныши должны быть подсчитаны и при отсутствии мацерации исследованы для выявления возможных дефектов и/или причины гибели, а затем фиксированы.

3.11.2. У взрослых Р и самок в день некропсии исследуются вагинальные мазки для выявления фазы эстрального цикла и корреляции с гистопатологией репродуктивных органов. Матки всех З самок (и самок, если необходимо) изучаются на наличие и число мест имплантации способом, не нарушающим гистопатологических оценок.

Масса органов и фиксирование тканей - Р и животные

3.11.3. Во время умерщвления масса тела и масса органов, перечисленных ниже, всех животных Р и всех взрослых животных из соответствующих когорт (как это описано ниже) определяется как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Органы должны быть консервированы при соответствующих условиях. Если нет специальных указаний, парные органы могут быть взвешены индивидуально или совместно, в зависимости от обычной практики в лаборатории, проводящей исследования.

- Матка (с трубами и шейкой), яичники.

- Семенники, эпидидимисы (целиком и хвосты для образцов, используемых для подсчета сперматозоидов).

- Простата (дорзолатеральная и вентральная части вместе). Выделение комплекса простаты должно проводиться с осторожностью, чтобы избежать повреждения семенных пузырьков, наполненных жидкостью. В случае связанного с воздействием вещества изменения общей массы простаты, дорзолатеральный и вентральный сегменты должны быть тщательно выделены после фиксации и взвешены раздельно.

- Семенные пузырьки с коагулирующими железами и их жидкости (как одна единица).

- Головной мозг, печень, почки, сердце, селезенка, вилочковая железа, щитовидная железа (после фиксации), гипофиз, надпочечники и известные критические органы или ткани.

3.11.4. В дополнение к органам, перечисленным выше, образцы периферических нервов, мышц, спинного мозга, глаз со зрительными нервами, желудочно-кишечного тракта, мочевого пузыря, легких, трахеи (с прикрепленными щитовидной и паращитовидной железами), костного мозга, семявыводящих протоков (самцы), молочных желез (самцы и самки) и вагины должны быть консервированы в соответствующих условиях.

3.11.5. В когорте животных 1А все органы взвешиваются и сохраняются для гистопатологических исследований.

3.11.6. Для выявления индуцированных пре- и постнатальных иммунотоксических эффектов 10 самцов и 10 самок когорты 1А из каждой экспериментальной группы (1 самец и 1 самка на помет, все пометы представлены, по крайней мере, 1 детенышем, произвольно выбранным) исследуются при умерщвлении следующим образом:

- взвешивание лимфоузлов, ассоциированных и не ассоциированных с путем поступления вещества в организм (в дополнение к весу надпочечников, вилочковой железы и селезенки, уже измеренному у всех животных когорты 1А);

- анализы субпопуляции лимфоцитов селезенки (CD4+ и CD8+ Т лимфоцитов, В лимфоцитов и клеток киллеров) с использование 1/2 селезенки, вторая половина селезенки сохраняется для гистопатологических исследований.

Анализы субпопуляций лимфоцитов селезенки у неиммунизированных животных (когорта 1А) могут определить, связано ли воздействие вещества с изменением в иммунологическом равновесном состоянии распределения "хелперов" (CD4+) или с цитотоксичностью (CD8+) лимфоцитов вилочковой железы, или с естественными киллерами (NK) клеток (быстрая ответная реакция на опухолевые клетки и патогенны).

3.11.7. В когорте 1Б животных должны быть взвешены следующие органы и подвергнуты анализу соответствующие ткани, представленные в перечне:

- вагина (не взвешивается);

- матка с шейкой;

- яичники;

- семенники (не менее одного);

- эпидидимисы;

- семенные пузырьки и коагулирующие железы;

- простата;

- гипофиз;

- выявленные органы-мишени.

Гистопатология в когорте 1Б изучается, если результаты, полученные для когорты 1А, вызывают сомнение, или вещество предположительно является репродуктивным или эндокринным токсикантом.

3.11.8. Когорты 2А и 2Б: Изучение нейротоксичности (PND 21 или PND 22 и взрослое потомство). Животные когорты 2А умерщвляются после изучения поведенческих реакций, проводится определение массы головного мозга и полное нейрогистопатологическое исследование для выявления нейротоксичности. Когорта животных 2Б умерщвляется на PND 21 или PND 22, проводится определение массы головного мозга и микроскопическое изучение головного мозга для выявления нейротоксичности. Перфузионная фиксация требуется для когорты 1А, но не обязательна для когорты 2Б (по OECD TG 426).

Взвешивание органов и сохранение тканей - отъемыши

3.11.9. Детеныши, которые не были отобраны в когорты, включая самых маленьких и слабых, умерщвляются после прекращения материнского питания на PND 22, если результаты не свидетельствуют о необходимости дальнейших прижизненных исследований. Умерщвленные животные используются для некропсии, включая исследование репродуктивных органов, как это описано выше. Примерно у 10 детенышей каждого пола и каждой экспериментальной группы из как можно большего числа пометов должны быть взвешены головной мозг, селезенка, вилочковая железа и сохранены в соответствующих условиях. Кроме того, ткани молочных желез этих детенышей, и самцов и самок, могут быть законсервированы для последующих микроскопических анализов (см. GD 151). Явные аномалии и органы-мишени должны сохраняться для возможного гистологического исследования.

3.12. Гистопатология

Гистопатология - Р животные

3.12.1. Полное гистопатологическое исследование органов проводится для всех животных, получавших максимальную дозу вещества, и контрольных Р животных. Органы, в которых выявлены изменения, связанные с воздействием изучаемого вещества, должны также исследоваться у животных, получавших вещество в меньших дозах, с целью установления NOAEL. В дополнение к этому, репродуктивные органы всех животных с потенциально низкой фертильностью, например, тех, которые оказались не способны к спариванию, оплодотворению, осеменению или рождению здорового потомства, или тех, у которых выявлены нарушения эстральной цикличности или количества, подвижности или морфологии сперматозоидов, а также все явные патологические изменения должны быть предметом гистопатологического анализа.

Гистопатология - животные

Когорта животных 1

3.12.2. Полное гистопатологическое исследование органов проводится для всех животных, получавших максимальную дозу вещества, и контрольных взрослых животных когорты 1. Все пометы должны быть представлены хотя бы одним животным каждого пола. Органы и ткани, в которых выявлены изменения, связанные с воздействием изучаемого вещества, как и все явные патологические изменения, должны исследоваться также у животных, получавших вещество в меньших дозах, с целью установления NOAEL. Для оценки пре- и постнатальных эффектов воздействия вещества на лимфоидные органы, должны быть проведены гистопатологические исследования образцов лимфатических узлов и костного мозга, отобранных у 10 самцов и 10 самок когорты 1А, наряду с гистопатологической оценкой вилочковой железы, селезенки и надпочечников уже проведенной для всех 1А животных.

3.12.3. Репродуктивные и эндокринные ткани всех животных когорты 1Б в соответствии с вышеприведенным перечнем должны исследоваться гистопатологически в случаях, когда изучаемые вещества являются потенциальными репродуктивными и эндокринными токсикантами. Когорта 1Б должна также подвергаться гистопатологическому исследованию, если результаты, полученные для когорты 1А, вызывают сомнение.

3.12.4. Яичники взрослых самок должны содержать примордиальные и растущие фолликулы, а также желтые тела, гистопатологическое исследование должно быть направлено на количественную оценку примордиальных, мелких растущих фолликулов и желтых тел у самок; выбор срезов яичников и размер срезов должны соответствовать используемой процедуре статистической оценки. Подсчет фолликулов может в начале быть проведен у контрольных животных и в группе животных, получавших максимальную дозу вещества, а в случае выявления неблагоприятного действия у последних, соответствующие исследования проводятся и у животных, получавших меньшие дозы вещества. Исследования должны включать подсчет количества примордиальных фолликулов, которые могут быть объединены с мелкими растущими фолликулами для сравнения яичников контрольных и опытных животных (см. GD 151). Оценка желтых тел должна проводиться параллельно с изучением эстральной цикличности так, чтобы стадия цикла могла приниматься во внимание при исследовании. Маточная труба, матка и вагина изучаются в плане соответствующего органо-типического развития.

3.12.5. Детальное изучение тестикулярной гистопатологии проводится у самцов для выявления вызванных воздействием изучаемого вещества эффектов на дифференцировку и развитие семенников и на сперматогенез. Если возможно, должны исследоваться срезы гайморовой сети каналов. Головка, корпус и хвост эпидидимиса и семявыводящий проток исследуются на соответствующее органо-типическое развитие в дополнение к параметрам, необходимым для Р самцов.

Когорта животных 2

3.12.6. Нейрогистопатологические исследования выполняются для всех животных, получавших максимальную дозу вещества, и контрольных животных когорты 2А обоего пола по завершении нейроповеденческого тестирования (после PND75, но не позднее PND90). Гистопатологическое изучение головного мозга проводится для всех животных, получавших максимальную дозу вещества, и контрольных животных когорты 2Б обоего пола на PND21 или PND22. Органы и ткани, в которых обнаружены изменения, связанные с действием изучаемого вещества, исследуются и у животных, получавших вещество в меньших дозах, для определения NOAEL. В когорте 2А и 2Б животных исследуются многослойные срезы головного мозга для изучения обонятельных луковиц, коры больших полушарий, гиппокампа, базальных ядер, таламуса, гипоталамуса, среднего мозга (цекум, покрышка, ножки мозга), ствола головного мозга и мозжечка. В когорте 2А исследуются только глаза (сетчатка и зрительный нерв) и образцы периферических нервов, мышц и спинного мозга. Все нейрогистологические процедуры должны соответствовать требованиям OECD TG 426.

3.12.7. Морфометрические (количественные) оценки должны проводиться на репрезентативных участках головного мозга (гомологичные срезы тщательно отбираются на основе надежных точек микроскопирования) и могут включать линейные и/или ареальные измерения конкретных областей головного мозга. Не менее трех последовательных срезов каждой точки (уровня) должно быть сделано для выбора наиболее репрезентативного среза для изучения конкретного участка головного мозга. Нейропатолог должен принять компетентное решение, являются ли срезы, приготовленные для измерений, гомологичными другим срезам в серии образцов и поэтому пригодными для включения, ибо линейные измерения, в частности, могут измениться на относительно небольшом расстоянии. Негомологичные срезы использоваться не должны. Несмотря на требование проанализировать все образцы, взятые у всех животных, предназначенных для этих оценок (10 каждого пола на каждый дозовый уровень), все же может быть адекватным использование меньшего числа образцов. Однако образцы от меньшего числа, чем 6 животных каждого пола на дозовый уровень, как правило, рассматриваются как недостаточные для целей таких исследований. Стереология может использоваться для идентификации связанных с воздействием вещества эффектов на такие параметры, как объем или количество клеток в отдельных нейроанатомических областях. Все аспекты приготовления образцов тканей, от фиксации тканей, приготовления срезов образцов тканей, проводки тканей и окрашивания препаратов, должны быть сбалансированными так, чтобы каждая партия содержала репрезентативные образцы для каждой из дозовых групп. Если морфометрический и стереологический анализы не используются, то ткани головного мозга животных всех дозовых уровней должны быть в одно и то же время залиты подходящей средой для избежания артефактов сморщивания, связанных с длительным хранением в фиксаторе.

4. Отчет

4.1. Данные исследований

4.1.1. Данные представляются в отчете индивидуально и обобщаются в табличной форме. Если возможно, для каждой экспериментальной группы и каждого поколения должны быть представлены следующие данные: число животных в начале исследования, число животных, найденных погибшими в течение эксперимента или умерщвленных из гуманных соображений, время гибели или умерщвления в течение эксперимента, число фертильных животных, число беременных самок, число самок, родивших живых детенышей, и число животных с признаками интоксикации. В отчете должно быть также приведено описание токсического действия, включая время, длительность и тяжесть его проявления.

4.1.2. Количественные результаты должны быть оценены соответствующим общепринятым статистическим методом. Статистические методы должны быть выбраны как часть плана экспериментального исследования и должны быть пригодны для оценки данных с распределением, отличающимся от нормального (например, счетных данных), усеченных данных (например, ограниченное время наблюдения), оценки зависимостей (например, действие на приплод и повторные измерения) и неодинаковой дисперсии. Обобщенные линейные модели смешанного типа и модели дозозависимого эффекта охватывают широкий класс способов анализа, которые могут быть пригодны для обработки данных, полученных в соответствии с настоящими Методическими рекомендациями. Отчет должен включать достаточную информацию об использованных методах анализа и компьютерных программах, так чтобы независимый рецензент/статистик мог оценить их или провести повторные анализы.

4.2. Оценка результатов

4.2.1. Показатели должны оцениваться в единицах измерения наблюдавшихся эффектов, включая данные некропсии и микроскопии. Оценка включает выявление зависимостей или их отсутствия между дозой и наличием, частотой возникновения и выраженностью нарушений, в том числе явных патологических изменений. Критические органы, фертильность, клинические нарушения, показатели репродуктивности и плодовитости, изменения массы тела, гибель и другие токсические эффекты, действие на развитие потомства должны быть также оценены. Особое внимание должно быть обращено на изменения, связанные с полом животных. Физико-химические свойства изучаемого вещества и, при возможности, ТК данные, включая плацентарный перенос, выделение с молоком, должны приниматься во внимание при оценке результатов исследования.

4.3. Отчет об исследовании

Отчет должен включать следующую информацию, полученную в настоящем исследовании на Р, животных и животных (если необходимо).

4.3.1. Изучаемое вещество:

- вся имеющая отношение к веществу доступная информация, токсикокинетические и токсикодинамические характеристики изучаемого вещества;

- идентификационные данные;

- чистота.

4.3.2. Растворитель (если применялся):

- обоснование выбора растворителя, отличного от воды.

4.3.3. Используемые животные:

- вид/линия, использованные в эксперименте;

- число, возраст и пол животных;

- источник, условия содержания, диета, материалы для гнезда и т.д.;

- индивидуальная масса животных в начале исследования;

- результаты вагинальных мазков для Р самок перед началом воздействие вещест- ва (если данные в это время были собраны);

- сведения о спаривании Р поколения с указанием пар самцов и самок, участвовавших в спаривании, и тех пар, у которых спаривание оказалось успешным;

- исходные подсчеты детенышей для взрослого поколения животных.

4.3.4. Условия исследования:

- аргументация выбора уровней доз;

- детали подготовки вещества для изучения/приготовление диеты, полученные концентрации;

- стабильность и гомогенность вещества в растворителе или несущей среде (например, в диете, питьевой воде), в крови /или в молоке в условиях использования и хранения между использованиями;

- детали введения изучаемого вещества;

- пересчет концентраций изучаемого вещества в диете/питьевой воде (ррm) на дозы (мг/кг массы тела/день), если нужно;

- детали качества корма и воды (включая состав диеты, если известен);

- детальное описание процедуры рандомизации отбраковки детенышей и распределения в экспериментальные группы;

- условия окружающей среды;

- список персонала, включая профессиональное обучение.

4.3.5. Результаты (обобщение и индивидуальные данные в зависимости от пола и дозы):

- потребление пищи, потребление воды, если требуется, эффективность питания (привес массы тела на грамм потребления пищи, исключая периоды сообитания и лактации) и поступление изучаемого вещества (для введения с кормом/питьевой водой) для Р и животных;

- данные об абсорбции вещества (если имеются);

- данные о массе тела для Р животных;

- данные о массе тела для животных, выбранных после прекращения материнского питания;

- время гибели во время исследования или умерщвления выживших животных в конце исследования;

- природа, тяжесть и длительность клинических нарушений (обратимых или необратимых);

- данные гематологии, анализов мочи и клинической химии, включая TSH и Т4 ;

- фенотипический анализ клеток селезенки (Т-, В-, NK-клетки);

- насыщенность клетками костного мозга;

- данные токсических реакций;

- число Р и животных с нормальной и нарушенной длительностью эстрального цикла;

- время спаривания (прекоитальный интервал, число дней между образованием пар и спариванием);

- токсический и другие эффекты на репродукцию, включая число и процент животных, которые завершили спаривание, беременность, роды и лактацию, а также самцов, оплодотворивших самок, и самок с признаками дистоции/длительных или трудных родов;

- длительность беременности и, при наличии, родов;

- число имплантаций, размер помета и процент детенышей - самцов;

- число и процент пост-имплантационных потерь, живорождений и мертворождений;

- масса помета и масса детенышей (самцов, самок раздельно и вместе), число детенышей со слишком малым весом, если такие были;

- число детенышей с явными видимыми аномалиями;

- токсический и другие эффекты на потомство, постнатальное развитие, жизнеспособность и т.д.;

- данные о физических показателях детенышей и другие данные постнатального развития;

- данные о половом созревании животных;

- данные о функциональных наблюдениях у детенышей и взрослых, если требуются;

- масса тела при умерщвлении и абсолютная и относительная масса органов для Р и животных;

- данные некропсии;

- детальное описание всех гистопатологических данных;

- общее количество сперматозоидов в хвосте эпидидимиса, процент поступательно движущихся сперматозоидов, процент морфологически нормальных сперматозоидов, процент сперматозоидов с каждой из выявленных аномалий для Р и самцов;

- число и стадии созревания фолликулов в яичниках Р и самок, если требуется;

- подсчет желтых тел в яичниках самок;

- статистическая обработка результатов, если возможно.

Параметры когорты 2:

- детальное описание процедур, использованных для стандартизации наблюдений, и, в том числе, процедур операционного определения количественных оценок данных исследования;

- перечень всех использованных процедур с обоснованием их использования;

- детали использованных поведенческих/функциональных, нейропатологических и морфометрических процедур, включая информацию и детали, касающиеся автоматических приборов;

- процедуры для калибровки и подтверждения эквивалентности приборов и сбалансированности экспериментальных групп в процедурах тестирования;

- краткое обоснование, объясняющее любой вывод, требующий профессиональной оценки;

- детальное описание всех поведенческих/функциональных, нейропатологических и морфометрических показателей для самцов и самок экспериментальных групп, включая как их увеличение, так и снижение по сравнению с контролем;

- масса головного мозга;

- любые диагнозы, установленные по неврологическим признакам и повреждениям, включая естественно встречающиеся болезни или состояния;

- фотографии примеров экспериментальных данных;

- фотографии с малым увеличением для оценки гомологии срезов, использованных для морфометрии;

- статистическая обработка результатов, включая статистические модели, использованные при анализе данных, и результаты, независимо от того, были они достоверными или нет;

- связь любых других токсических эффектов с выводом о нейротоксическом потенциале изучаемого вещества в соответствии с полом и введенной дозой вещества;

- вклад любой токсикокинетической информации в выводы;

- данные, подтверждающие надежность и чувствительность методов исследования (позитивные и исторические контрольные данные);

- связи, если наблюдались, между нейропатологическими и функциональными эффектами;

- NOAEL или бенчмарк-доза для животных-родителей и потомства в зависимости от пола и введенной дозы;

- обсуждение общей интерпретации данных, основанное на результатах, включая вывод о том, обладает или не обладает вещество нейротоксичностью, и NOAEL.

Параметры когорты 3:

- титры сывороточных IgM-антител (сенсибилизация к SRBC или KLH) или единицы IgM PFC селезенки (сенсибилизация к SRBC);

- использование метода TDAR должно быть утверждено как часть оптимизационного процесса для лаборатории, впервые проводящей такое исследование, и периодически (например, ежегодно) для всех лабораторий;

- обсуждение общей интерпретации данных, основанное на результатах, включая вывод о том, обладает или не обладает вещество иммунотоксичностью для развивающегося организма, и NOAEL.

4.3.6. Обсуждение результатов.

4.3.7. Выводы, включая уровни NOAEL, и эффекты для животных-родителей и потомства.

Вся информация, не являющаяся итогом экспериментов, но имеющая значение для интерпретации результатов (например, сходство выявленных эффектов с действием известных нейротоксикантов), также должна быть охвачена.

4.4. Интерпретация результатов

4.4.1. Расширенное изучение репродуктивной токсичности на одном поколении при необходимости обеспечивает получение информации об эффектах повторного введения вещества в течение всех фаз репродуктивного цикла. В частности, исследование предоставляет информацию о влиянии на репродуктивную систему, на развитие, рост, выживаемость и функциональные показатели потомства до PND90.

4.4.2. При интерпретации результатов должна приниматься во внимание вся доступная информация о веществе, включая физико-химические, ТК и токсикодинамические свойства, доступную и релевантную информацию о структурных аналогах и результаты ранее проведенных исследований токсичности изучаемого вещества (например, острой токсичности, токсичности при повторном введении, механизмов действия вещества и исследований по оценке достоверности качественных и количественных видовых различий метаболических свойств in vivo/in vitro). Результаты вскрытия и определения массы органов должны, при возможности, оцениваться в контексте с результатами наблюдений, полученными в других исследованиях с повторным введением вещества. Снижение роста потомства может рассматриваться во взаимосвязи с влиянием изучаемого вещества на состав молока.

Когорта 2 (нейротоксичность в развивающемся организме)

4.4.3. Результаты исследования нейроповенческой патологии и нейропатологии должны интерпретироваться в контексте всех выявленных изменений с использованием подхода совокупности доказательств с экспертной оценкой. Особенности поведенческих реакций и морфологических данных, если они имеются, так же как наличие зависимостей доза-ответ должны быть рассмотрены. Оценки нейротоксичности для развивающегося организма, включая данные эпидемиологических исследований населения или историй болезни и экспериментальные исследования на животных (например, токсикокинетические данные, информация о зависимостях структура-активность, данные других исследований токсичности) должны быть включены в характеристику. Оценка результатов должны включать обсуждение как их биологической, так и статистической значимости. Оценка должна включать зависимости, если они выявлены, между нейропатологическими и поведенческими нарушениями. Методические основы интерпретации результатов изучения нейротоксичности для растущего организма изложены в OECD 426.

Когорта 3 (иммунотоксичность для развивающегося организма)

4.4.4. Подавление или активация иммунных функций, выявленные с помощью TDAR (Т-клетоточно-зависимой реакции антител), должны быть оценены в контексте всех сделанных наблюдений. Значимость результатов TDAR может быть подтверждена другими эффектами на связанные с иммунологией индикаторы (например, насыщенность клетками костного мозга, масса и гистопатология лимфоидных тканей, распределение субпопуляций лимфоцитов). Эффект, выявленный в TDAR, может быть менее значимым в случае, если другие проявления токсичности наблюдались при воздействии более низких концентраций вещества.

4.4.5. Для интерпретации результатов изучения репродуктивной и нейротоксичности следует обращаться за справками к Руководящему документу ОЭСР 43.