Приложение 6.3.3. Изучение хронической токсичности при накожном поступлении

Приложение 6.3.3

Изучение хронической токсичности при накожном поступлении

Является частью международного документа OECD TG N 452 "Chronic Toxicity Studies" (ОЭСР Руководство N 452 "Исследования хронической токсичности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения исследования хронической токсичности химических веществ и продукции на их основе (далее - веществ) при накожном поступлении.

1.2. Исследование хронической токсичности позволяет получить информацию о возможной опасности для здоровья, вероятно, возрастающей от повторяющихся воздействий в течение большей части продолжительности жизни грызунов. Исследование направлено на выявление данных о токсическом воздействии вещества, определение органов-мишеней и выявление возможности накопления (аккумуляции). Также в ходе его определяют наивысший уровень воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), что может быть использовано для установления критерия безопасности воздействия на организм человека. Следует также подчеркнуть необходимость тщательного клинического наблюдения за животными для получения максимально возможного количества информации.

1.3. В проведении исследования хронической токсичности необходимо всегда придерживаться основополагающих принципов и соображений, изложенных в Руководстве ОЭСР N 19 [45], по распознаванию, оценке и использованию клинических признаков, таких как гуманное умерщвление подопытных животных, используемых в оценке безопасности.

1.4. Подробные правила и принципы выбора дозы для исследований хронической токсичности и канцерогенности отражены в Руководстве ОЭСР N 116. Метод выбора основной дозы зависит от первоначальных целей или задач исследования. При выборе уровня дозы должен быть достигнут баланс между риском гибели животных с одной стороны и характеристикой ответных реакций на низкие дозы и их значимостью - с другой. Это чрезвычайно важно в случае комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности.

1.5. Проведение комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности требует большего анализа в сравнении с исследованиями хронической токсичности и канцерогенности, проводимыми раздельно. Следует внимательно отнестись к принципам выбора при проведении комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Раздельные исследования могут являться необходимыми по определенным нормативным требованиям.

2. Общие положения

2.1. Данные методические рекомендации предназначены, прежде всего, для исследований, осуществляемых на грызунах. Если проведение таких исследований потребуется на особях другого вида, изложенные принципы и методы также могут быть использованы, с надлежащими изменениями, в соответствии с целями и руководством ОЭСР N 116.

2.2. До начала проведения исследования испытательной лабораторией должна быть проанализирована вся доступная информация по исследуемому веществу и с тем, чтобы сфокусировать план исследования на более успешное тестирование возможной хронической токсичности и минимизировать использование животных. Данные, которые будут содействовать проведению исследования, включают: идентификацию, химическую структуру и физико-химические свойства исследуемого вещества; любую информацию о механизме действия; результаты любых in vitro и in vivo исследований токсичности; предполагаемое использование и вероятное воздействие на человеческий организм; доступные данные испытаний (Q)SAR и токсические свойства структурно родственных веществ; имеющиеся токсикокинетические данные (однократная доза, а также кинетика повторной дозы, при наличии) и данные, полученные из других исследований повторного воздействия. Изучение хронической токсичности может быть проведено после получения первоначальных данных по изучению токсичности повторной дозы в течение 28 и/или 90 дней. Поэтапный подход к исследованию хронической токсичности следует рассматривать как часть общей оценки возможного неблагоприятного воздействия вещества на здоровье человека.

2.3. Цели исследований хронической токсичности при накожном поступлении, охватываемые настоящими методическими рекомендациями, включают:

- определение опасных свойств химических веществ;

- определение органов-мишеней;

- описание зависимости доза-ответ;

- определение наивысшего уровня воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект (NOAEL) или исходной данных для установления нижней 95%-й доверительной границы реперной дозы (BMD);

- прогнозирование хронической интоксикации человека при внутрижелудочном поступлении вещества;

- предоставление данных для проверки гипотез относительно механизма действия.

3. Принцип метода

3.1. Исследуемое вещество наносится на кожу ежедневно порциями нескольким группам подопытных животных в течение 12 месяцев, хотя можно также избрать более длительный или короткий периоды. Этот период был выбран в связи с тем, что он достаточен для того, чтобы стали очевидны любые проявления кумулятивной токсичности, не смешиваясь при этом с проявлениями возрастных изменений. Отклонение от продолжительности воздействия в 12 месяцев должно быть обосновано, особенно в случае сокращения срока. План исследования может также включать одно или несколько промежуточных умерщвлений, например, через 3 и 6 месяцев. Для этого необходимо добавить дополнительные группы животных. Животные, которые умерли или были умерщвлены в ходе тестирования, подвергаются аутопсии. По окончании исследования выживших животных умерщвляют и также проводят аутопсию.

4. Описание метода

4.1. Животные

Подбор видов животных

4.1.1. Данные методические рекомендации охватывают главным образом оценку и анализ хронической токсичности на грызунах, хотя подобные исследования на негрызунах могут понадобиться по определенным нормативным требованиям. Выбор вида животных должен быть обоснован. План и проведение исследования хронической токсичности на видах негрызунов, когда это необходимо, должны быть основаны на принципах, содержащихся в данном стандарте. Дополнительная информация по выбору вида и рода экспериментальных животных содержится в Руководстве ОЭСР N 116.

4.1.2. Предпочтительным видом грызунов являются крысы, хотя могут использоваться и другие виды, например, мыши. Крысы и мыши были выбраны в качестве экспериментальных моделей за их сравнительно короткую продолжительность жизни, широкое применение в фармакологических и токсикологических исследованиях, их восприимчивость к индукции новообразований и доступность этих хорошо изученных видов. Вследствие этих качеств, имеется большое количество информации об их психологии и патологии. Следует использовать молодых здоровых половозрелых животных лабораторных видов. Исследование хронической токсичности следует проводить на животных того же рода и того же происхождения, что и животные, использовавшиеся в предварительных токсикологических исследованиях небольшой продолжительности. Женские особи должны быть нерожавшими и небеременными.

Содержание и кормление

4.1.3. Животные должны находиться отдельно или содержаться в клетках небольшими группами одного пола. Отдельное проживание следует применять только, если это научно обосновано. Клетки надо размещать таким образом, чтобы свести к минимуму возможное влияние их местоположения. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не должна превышать 70% (если только не проводится уборка помещения) оптимальная влажность - 50-60%. Свет должен быть искусственным, с последовательностью: 12 ч. свет, 12 ч. темнота. Для кормления могут использоваться традиционные лабораторные диеты с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна отвечать всем потребностям в питании тестируемого вида. Содержание загрязняющих веществ, которые могут повлиять на результаты исследования (остатки пестицидов, стойкие органические загрязнители, фитоэстрогены, тяжелые металлы и микотоксины) должны быть по возможности минимизированы. Аналитические данные по питанию и уровню загрязняющих веществ в пище должны собираться периодически, как минимум в начале исследования и когда меняется используемая партия, и их следует включать в заключительный отчет. Должны также предоставляться аналитические данные по питьевой воде, используемой в исследовании.

Подготовка животных

4.1.4. Должны использоваться здоровые животные, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях как минимум в течение 7 дней и над которыми прежде не ставились эксперименты. В случае с грызунами воздействие следует начинать как можно раньше, после отлучения от матери и адаптации, желательно до того, как животным исполнится 8 недель. Тестируемые животные должны быть описаны по роду, виду, происхождению, полу, массе и возрасту. В начале исследования разница в массе подопытных животных должна быть минимальна и не превышать от средней массы всех животных, задействованных в исследовании, отдельно каждого пола. Животные должны быть случайным образом распределены на контрольную и тестовую группы. После распределения заметной разницы в средней массе между группами каждого пола быть не должно. Если же она имеется, следует, по возможности, повторить распределение. Каждое животное должно быть помечено индивидуальным идентификационным номером, и этот номер следует нанести на перманентной основе, с помощью татуировки, вживления микрочипа или другим соответствующим способом.

4.1.5. Приблизительно за 24 ч до начала исследования шерстка должна быть удалена - выстрижена или выбрита - со спинной части тела животного. При стрижке или бритье необходимо быть осторожным, чтобы не повредить кожу животного: это может повлиять на процесс всасываемости. Не меньше 10% поверхности тела должны быть очищены для нанесения испытываемого вещества.

4.2. Основное исследование

Количество и пол животных

4.2.1. Должны использоваться животные обоих полов. Следует использовать такое количество животных, чтобы по окончании исследования в каждой группе оставалось достаточное их количество для биологического и статистического анализов. Как правило, грызунов минимум 20 животных, а негрызунов, как минимум по 4 животных в каждой группе каждого пола для каждого уровня дозы. В исследованиях, где задействованы мыши, может возникнуть необходимость в дополнительных животных в каждой группе для проведения всех необходимых гематологических анализов. В зависимости от цели исследования можно увеличить статистическую значимость основных показателей, распределив неравномерно животных по уровням доз.

Резерв для промежуточных умерщвлений, вспомогательные группы и индикаторные животные

4.2.2. При исследовании необходимо сделать резерв для промежуточных умерщвлений, например, в 6 месяцев, для получения данных о развитии токсических изменений и данных о механизме воздействия, если это научно обосновано. Также нужно задействовать вспомогательные группы для отслеживания обратимости любых токсических изменений, вызванных химическими веществами при исследовании. Как правило, их распределяют на группу с самым высоким уровнем дозы и контрольную группу. Если запланировано промежуточное умерщвление, количество животных, включенных в план исследования, должно быть увеличено на число животных, которое планируется умертвить до завершения исследования. Этим животным следует провести такое же обследование (включая массу тела, потребление воды и пищи, гематологические и клинические биохимические показатели, выявление патологий), как и животным в стадии хронической токсичности основного исследования. Можно также сделать резерв (в группах промежуточного умерщвления) для измерений, ограниченных особыми, ключевыми показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность.

Группы доз и дозировка

4.2.3. Следует использовать как минимум три уровня доз и параллельный контроль, за исключением тех случаев, когда проводится исследование с максимально возможной дозой. Чаще всего при выборе уровней доз основываются на результатах краткосрочных исследований повторной дозы или исследованиях по обнаружению диапазона доз. Необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные по тестируемому или родственным ему веществам.

4.2.4. Если нет ограничений по физико-химической природе или биологическому воздействию исследуемого вещества, должна быть выбрана самая высокая доза для определения основных органов-мишеней и токсичных эффектов воздействия. Однако следует избегать страданий, тяжелой токсичности, болей или смерти. Самый высокий уровень дозы следует выбрать для получения признаков интоксикации, например, изменение уровня сывороточного фермента или невозможность набрать массу (примерно 10%).

4.2.5. Однако в зависимости от целей исследования может быть выбрана верхняя доза ниже, чем доза, подтверждающая наличие токсичности, например, если доза вызывает побочное действие, которое, тем не менее, слабо отражается на продолжительности жизни или массе тела.

4.2.6. Разница между уровнями доз должна быть направлена на определение зависимости доза-ответ и установление наивысшего уровня дозы, при которой не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), или других предполагаемых результатов исследования, например BMD при самом низком уровне дозы. Условия, которые должны быть приняты во внимание при установлении нижних доз, включают: предполагаемый наклон кривой зависимости доза-ответ, дозы, при которых могут происходить важные изменения в метаболизме, или вид токсического действия, когда предполагается пороговая величина, или когда предполагается исходная точка для экстраполяции низкой дозы.

4.2.7. Избранная разница в уровне доз зависит от параметров тестируемого вещества. Диапазон от 2 до 4 зачастую оптимален для установления снижения уровней доз, а при использовании очень больших интервалов (например, диапазон примерно 6-10) между дозами предпочтительно добавление четвертой тестируемой группы. При выборе доз и разницы в уровнях доз следует использовать Руководство ОЭСР N 116, но в целом следует избегать использования диапазона выше 10, а его применение должно быть обосновано.

4.2.8. При выборе дозы для проведения исследований хронической токсичности и канцерогенности необходимо учесть:

- знания или предположения о нелинейностях или точках изгиба зависимости доза- ответ;

- токсикокинетические закономерности, а также уровни доз, при которых происходят или не происходят метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между введенными и поглощенными дозами;

- признаки поражения, влияния или показатели воздействия на основные биологические процессы;

- основные (или предполагаемые) проявления механизма действия, как то дозы, при введении которых начинает увеличиваться цитотоксичность, нарушается гормональный уровень, подавляется гомеостатический механизм и т.д.;

- интервалы кривой доза-эффект, где необходима чрезвычайно надежная оценка, например, в пределах ожидаемых BMD или предполагаемых пороговых величин;

- уровни анализа предполагаемого воздействия на организм человека.

4.2.9. Контрольная группа не должна получать исследуемое вещество. С животными из контрольной группы следует обращаться также, как и с тестируемыми группами. Если используется растворитель, отличный от воды, контрольная группа должна получать его в максимальном объеме от используемого в опытных группах.

4.3. Подготовка доз, нанесение исследуемого вещества

4.3.1. Исследуемое вещество наносится на кожу. Если испытывается твердое вещество, которое можно измельчить, его надо измельчить и затем развести водой или, при необходимости, подходящим разбавителем, чтобы обеспечить лучшее проникновение через кожу животного. При использовании разбавителя необходимо учесть его влияние при воздействии испытываемого вещества на кожу. Жидкие тестируемые вещества, как правило, не разбавляют.

4.3.2. Необходимо уделять внимание следующим характеристикам среды или других вспомогательных веществ, в зависимости от конкретного случая: влиянию на абсорбцию, распределение, метаболизм или накопление исследуемого вещества; влиянию на химические свойства исследуемого вещества, которые могут повысить его токсические свойства; влиянию на потребление пищи или воды или обусловленное питанием, состояние животных. Рекомендуется, где возможно, использовать, в первую очередь, водные растворы/суспензии, затем рассматривать раствор эмульсии в масле (например, кукурузное масло), и затем искать возможное решение с использованием других сред. Для сред, отличных от воды, должны быть известны их токсические свойства. Следует определять стабильность исследуемого вещества к условиям введения.

4.3.3. При накожном воздействии животные получают дозу исследуемого вещества ежедневно (семь дней в неделю), как правило, в течение 1 года. Продолжительность ежедневной экспозиции составляет как минимум 6 ч. Любой другой режим дозы, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован. Животные должны содержаться в условиях, предотвращающих слизывание вещества с поверхности кожи. Более подробно условия нанесения вещества на кожу и содержания животных при исследовании дермальной токсичности при повторных воздействиях описаны в Руководствах ОЭСР N 410 и 411.

4.3.4. Как правило, одна доза наносится раз в день. Не следует наносить исследуемое вещество, о котором заведомо известно, что оно вызовет сильную боль и тяжелые нарушения в силу своих разъедающих (коррозионных) или раздражающих свойств. Их необходимо разбавлять, чтобы избежать тяжелых локальных поражений. Щелочной баланс растворов, содержащих дозу, как правило, лежит в интервале pH от 4 до 9.

4.4. Продолжительность исследования

4.4.1. Несмотря на то, что данный метод рассчитан на 12-месячное исследование хронической токсичности, план исследования допускает применение как более короткого (например, 6 или 9 месяцев), так и более длинного (например, 18 или 24 месяца) периода исследования в зависимости от целей и задач эксперимента. Отклонения от продолжительности воздействия в 12 месяцев должны быть обоснованы, особенно в случае сокращения сроков. Вспомогательные группы, включенные для наблюдения за обратимостью любых токсических изменений, вызванных химическим веществом, следует держать без дозировок не менее 4 недель, но не более одной трети от общего периода исследования после прекращения воздействия.

5. Наблюдения

5.1. Общее состояние животных (заболевание или гибель) с особым вниманием к токсикологически значимым признакам, в частности нейрофункциональным и нейроповеденческим реакциям, должны исследоваться в начале и конце каждого дня. Дополнительно животные должны проверяться как минимум один раз в выходные и праздничные дни. Общее клиническое наблюдение должно осуществляться как минимум один раз в день, предпочтительно в одно и то же время, принимая во внимание период максимума предполагаемого воздействия дозы. Клиническое состояние животных следует фиксировать.

5.2. Подробное клиническое наблюдение должно быть проведено как минимум один раз до начала воздействия (учитывая предмет исследования), к концу первой недели исследования и впоследствии ежемесячно. Протокол наблюдений должен быть согласован так, чтобы обеспечить минимальную разницу между отдельными наблюдателями и независимость от тестовой группы. Эти обследования необходимо делать вне клетки, каждый раз в одном месте, в одно и то же время. Их следует тщательно фиксировать, желательно используя систему количественных показателей, четко оговоренную испытательной лабораторией. Необходимо следить за тем, чтобы варьирование в условиях наблюдения было минимальным. Отмеченные признаки должны включать, но не только, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреции и экскреции и автономной активности (например, слезоотделение, пилоэрекция, размер зрачка, аномальный способ дыхания). Изменения в походке, положении тела, реакции на прикосновение, как и наличие клонических или тонических движений, стереотипах (например, чрезмерное умывание, однообразные движения по кругу) или аномалиях поведения (например, членовредительство, хождение задом наперед) также должны регистрироваться.

5.3. Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить всем животным до первого введения исследуемого вещества. По окончании исследования этот осмотр желательно провести всем животным, но, как минимум, группе с высокой дозой и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена.

5.4. Для химических веществ, для которых предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы в течение 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать нейротоксическое воздействие, сенсорную химическую активность к раздражителям различного типа (например, слуховые, визуальные и проприоцептивные раздражители) оценку силы захвата и двигательной активности можно проводить, по выбору, до начала исследования и затем в 3, 6, 9 и 12 месяцев. Однако можно использовать и другие, не приведенные в списке процедуры.

5.5. Для химических веществ, где предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы через 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать иммунотоксическое воздействие, дальнейшие исследования этого результата могут по желанию проводиться до 12 месяцев.

Масса тела, потребление пищи/воды и питательность пищи

5.6. Все животные должны взвешиваться в начале исследования, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду.

Гематология и клиническая биохимия

5.7. В исследованиях, в которых используются грызуны, гематологические исследования необходимо проводить как минимум на 10 самцах и 10 самках каждой группы в 3, 6 и 12 месяцев, всегда используя одних и тех же животных. В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные с тем, чтобы проводить все необходимые гематологические исследования. В исследованиях с негрызунами пробы берутся у меньшего количества животных (например, 4 особи каждого пола каждой группы в случае с исследованием на собаках). Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействие на гематологические параметры. Образцы должны быть собраны к концу запланированного периода исследования, в период исследования к 3 и 6 месяцам и к 12 месяцу непосредственно перед или во время процедуры умерщвления животных. Пробы крови следует брать из сердечной камеры или из ретроглазной пазухи и, по возможности, хранить в подходящих условиях. Необходимо исследовать приведенный список параметров: общая и лейкоцитарная формула, содержание эритроцитов, содержание тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит (гематокритное число), среднее гематокритное число (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН), концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), протромбиновое время и время образования и активности тромбопластина