Приложение 6.7.12. Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенной активности

Приложение 6.7.12

Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенной активности

Идентичен международному документу OECD TG N 453 "Combined Chronic Toxic- ity\Carcinogenicity Studies" (ОЭСР Руководство N 453 "Комбинированные исследования хронической токсичности и канцерогенности"). Принят 7 сентября 2009 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию токсичности и канцерогенности широкого спектра химических веществ, включая пестициды и промышленные химикаты, но имеют ряд отличий от требований, предъявляемых к тестированию канцерогенности фармацевтических препаратов (см. Руководство S1B Международной конференции по гармонизации).

1.2. Метод обеспечивает получение информации о хронической токсичности/канцерогенности вещества при пероральном, ингаляционном и накожном путях введения. Выбор способа введения зависит от физических и химических свойств тестируемого вещества, а также от основного пути введения в организм человека. Дополнительная информация по выбору способа введения приведена в Руководстве N 116.

2. Общие положения

2.1. Основное внимание в настоящем методе уделяется пероральному способу введения как наиболее распространенному в исследованиях хронической токсичности и канцерогенности. Для оценки риска здоровью человека и/или по определенным нормативным требованиям также могут быть востребованы долгосрочные исследования, включающие накожный или ингаляционный пути введения. Такие исследования нужно разрабатывать для каждого случая отдельно. Рекомендации для оценки и анализа хронической токсичности и канцерогенности при пероральном введении могут быть положены в основу ингаляционного и/или дермального исследований (в отношении рекомендаций по срокам терапии, клиническим и патологическим показателям и т.д.), но руководства ОЭСР по введению тестируемых веществ ингаляционным и накожным способами TG 412 и TG 413, вместе с методическим документом ОЭСР по исследованию острой аспирации, должны быть приняты во внимание при разработке более длительных исследований, затрагивающих ингаляционный способ введения, a TG 410 - в случае тестирования, осуществляемого дермальным путем.

2.2. Комбинированные исследования хронической токсичности/канцерогенности дают информацию о возможной опасности для здоровья, которая может возникнуть в результате повторяющегося воздействия в течение всего жизненного цикла подопытных видов и позволяют получить данные о токсическом воздействии вещества, включая потенциальную канцерогенность, органы-мишени и возможность кумуляции; дать оценку наименьшего уровня наблюдаемого вредного воздействия для токсичных воздействий и в случае негенотоксичных канцерогенов для опухолевых реакций, которые могут быть использованы для установления критериев безопасности для введения человеку. При этом следует подчеркнуть необходимость тщательного клинического наблюдения за животными для получения максимально возможного количества информации.

2.3. Цели исследований хронической токсичности/канцерогенности включают:

- установление канцерогенных свойств химических веществ, проявляющихся в повышении процента новообразований, в увеличении доли злокачественных новообразований или сокращение времени появления новообразований, по сравнению с параллельными контрольными группами;

- определение времени появления новообразований;

- определение хронической токсичности химических веществ;

- определение органов-мишеней хронической токсичности и канцерогенности,

- описание зависимости доза-реакция;

- определение наименьшего уровня наблюдаемого вредного воздействия (NOAEL) или исходной точки для установления минимальной дозы (BMD);

- экстраполяция канцерогенного влияния на человека при низких уровнях воздействия;

- прогнозирование воздействия хронической токсичности на уровне человеческого организма;

- предоставление данных для проверки гипотез относительно механизма действия.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Схема исследования состоит из двух параллельных фаз: хронической и канцерогенности. Тестируемое вещество обычно вводится перорально, хотя возможно накожное и ингаляционное введение. Для хронической фазы тестируемое вещество вводят ежедневно градуированными дозами нескольким группам тестируемых животных, один уровень дозы на группу, как правило, в течение 12 месяцев, хотя может быть выбрана большая или меньшая продолжительность в зависимости от нормативных требований. Такая продолжительность достаточна для любых проявлений кумулятивной токсичности и исключает проявления возрастных изменений. План исследования может также включать одно или несколько промежуточных забоев, например к 3-му и 6-му месяцам. Во время канцерогенной фазы исследуемое вещество вводят ежедневно нескольким группам подопытных животных в течение большей части их жизненного цикла. В обеих фазах животные тщательно изучаются на предмет выявления признаков токсического воздействия и развития опухолевых поражений. Животным, которые умерли или были умерщвлены в ходе тестирования, проводится аутопсия. По окончании исследования производят забой выживших животных и также проводят аутопсию.

3.1.2. В оценке и анализе возможной канцерогенности и хронической токсичности химического вещества до начала проведения исследования испытательной лабораторией должна быть рассмотрена вся доступная информация по исследуемому веществу для оптимизации плана исследования и минимизирования использования животных. Информация и рассмотрение способа действия предполагаемого канцерогена особенно важна, так как оптимальный план может отличаться в зависимости от того, известно ли, что вещество является генотоксическим канцерогеном или это только предполагается. Дальнейшие указания по оценке способа действия можно найти в MP 116.

3.1.3. Данные, которые будут содействовать разработке исследования, включают: идентичность, химическую структуру и физико-химические свойства исследуемого вещества; любая информация о механизме действия; результаты любых in vitro и in vivo исследований токсичности, включая тесты на генотоксичность; предполагаемое использование и вероятное воздействие на человеческий организм; доступные данные испытаний (Q)SAR на мутагенность/генотоксичность, канцерогенность и другие токсикологические свойства структурно родственных веществ; имеющиеся токсикокинетические данные (однократная доза, а также кинетика повторной дозы, при наличии) и данные, полученные из других исследований повторного воздействия. Измерение хронической токсичности может быть проведено после получения первоначальных данных о токсичности от 28-дневного и 90-дневного исследований. Также полезную информацию дают краткосрочные исследования стимуляции и активизации рака. Поэтапный подход к исследованию на канцерогенность следует рассматривать как часть общей оценки возможного неблагоприятного воздействия на здоровье определенного химического вещества.

3.1.4. Статистические методы, наиболее подходящие для анализа результатов с учетом экспериментального плана и цели, должны быть установлены до начала исследования. При их выборе следует определить, должна ли статистика включать в себя корректировку для выживаемости, анализ рисков кумулятивной опухоли относительно продолжительности выживания, анализ времени возникновения опухоли и анализ в случае преждевременного прекращения жизни одной или нескольких групп. Руководство по соответствующим статистическим исследованиям и ключевые ссылки на международно признанные статистические методы приведены в MP 116, а также в MP 35 по анализу и оценке исследования хронической токсичности и канцерогенности.

3.1.5. При проведении исследования канцерогенности должны выполняться принципы и соображения, изложенные в стандарте по вопросам распознавания, оценки и использования клинических симптомов как гуманных критериев оценки для подопытных животных, используемых в оценке безопасности, в частности в исследованиях с многократным введением дозы, когда животное демонстрирует прогрессирующие клинические признаки, что приводит к дальнейшему ухудшению состояния, необходимо принять решение умертвлять животное из гуманных соображений или нет. Решение должно учитывать соотношение ценности информации, которая будет получена при дальнейшем использовании этого животного в исследовании, и его общее состояние. Если будет принято решение оставить животное в исследовании, частота наблюдений должна быть увеличена по мере необходимости. Также, можно без ущерба для целей тестирования временно прекратить введение дозы, если это облегчит боль или мучение, или уменьшить тест-дозу.

3.1.6. Подробные правила и обсуждение принципов выбора дозы для исследований хронической токсичности и канцерогенности можно найти в MP 116, а также в публикациях двух Международных институтов биологических наук. Метод выбора основной дозы зависит от первоначальных целей или задач исследования. В выборе подходящего уровня дозы должен быть достигнут баланс между риском отсева с одной стороны и характеристикой ответных реакций на низкие дозы и их значимость - с другой, что особенно актуально в случае комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности.

3.1.7. Проведение комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности требует большего анализа в сравнении с исследованиями хронической токсичности (MP 452) и канцерогенности (MP 451), проводимыми раздельно. Комбинированное исследование дает большую эффективность с точки зрения времени и стоимости и небольшое сокращение подопытных животных, в сравнении с проведением двух отдельных исследований, без ущерба для качества данных как в хронической фазе, так и в фазе канцерогенности. Тем не менее необходимо внимательно отнестись к принципам выбора дозы при проведении комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Раздельные исследования могут являться необходимыми по определенным нормативным требованиям. Дальнейшие указания по разработке исследования комбинированной хронической токсичности и канцерогенности для достижения максимальной эффективности исследования с точки зрения возможности сокращения численности подопытных животных, а также через упорядочение различных экспериментальных методик можно найти в MP 116.

3.1.8. Для повышения качества исследования и минимизации количества привлеченных животных вся имеющаяся информация об исследуемом препарате должна находиться в распоряжении экспериментальной лаборатории до начала эксперимента. Информация, которая может помочь при выборе необходимых для испытания концентраций, включает тождественность, химическую структуру и физико-химические свойства испытуемого вещества; результаты опытов на токсичность in vivo или in vitro; предполагаемую область применения и вероятность воздействия на человека; если имеются, то данные (Q)SAR и сведения о токсичности структурно родственных препаратов.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование. Хотя использование мышей в тестировании на канцерогенность может иметь ограниченное применение, по некоторым действующим нормативным документам все же требуется исследование канцерогенности на мышах.

Подготовка

3.2.2. Следует использовать животных обоих полов. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте до 8 недель, диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать от средней массы животных. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволяет идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее 7 дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям. Животным также необходимо дать короткое время приспособиться к исследуемому прибору до начала испытания с целью уменьшить стресс от попадания в новую среду. Опытные и контрольные группы должны состоять не менее чем из 10 животных для этапа изучения токсичности и не менее 50 для канцерогенного этапа. Допустимы промежуточные забои животных через 6 (для оценки динамики неканцерогенных эффектов, если такие данные не были получены в предшествующих опытах и данная процедура научно обоснована) и 12 месяцев (для канцерогенных эффектов). При этом группы должны быть увеличены пропорционально количеству планируемых к забою животных. Также в фазе хронической токсичности могут быть составлены дополнительные (вспомогательные) группы для контроля обратимости токсических эффектов (могут быть ограничены группой с максимальным уровнем дозы в исследовании и контрольной группой) и индикаторные группы (обычно по 5 животных каждого пола) для отслеживания стадии заболевания. Прочие указания по разработке исследования, включающего промежуточные забои вспомогательных и индикаторных животных, при сведении к минимуму количества животных, используемых в целом, содержатся в MP 116.

Содержание

3.2.3. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять , оптимальный уровень относительной влажности - 30-70%. В исследовании одного уровня концентрации животных можно поместить в одну камеру, но число животных в камере не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из-за каннибализма и борьбы. Свойства исследуемого препарата или токсичность (способность вызывать заболевание, возбуждать ЦНС) могут указывать на необходимость содержания животного в индивидуальной камере, чтобы предотвратить каннибализм. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания, за исключением периода экспозиции испытуемого препарата, во время которого для животного необходимо обеспечить неограниченное потребление питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 часов при свете/12 часов в темноте.

3.3. Группы доз и дозировка

3.3.1. Указания по всем аспектам выбора дозы и интервалов между дозами содержится в MP 116. Следует использовать, как минимум, три уровня доз и параллельный контроль, для хронической и канцерогенной фаз. Чаще всего уровни дозы основываются на результатах краткосрочных исследований повторной дозы или исследованиях обнаружения диапазона. Необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные по тестируемому или родственным тестируемому веществам.

3.3.2. В фазе исследования хронической токсичности полное исследование с использованием трех уровней доз не является необходимым, если можно предположить, что тестирование на одной дозе, эквивалентной не менее 1 000 мг/кг массы тела/сутки, вряд ли даст эффекты воздействия. Это предположение должно быть основано на информации из предварительных исследований и из оценки, что токсичность не предполагается, исходя из данных по структурно родственным веществам. Может применяться ограничение 1 000 мг/кг массы тела/сутки за исключением тех случаев, когда воздействие на человека указывает на необходимость использования более высокого уровня дозы.

3.3.3. Если нет ограничений по физико-химической природе или биологическому воздействию исследуемого вещества, должна быть выбрана самая высокая доза для определения основных органов-мишеней и токсических эффектов. Однако следует избегать страданий, тяжелой интоксикации, болей или смерти. Самый высокий уровень дозы следует выбрать для получения доказательств токсичности, как, например, о токсичности свидетельствует невозможность набрать массу тела (примерно 10%). Однако в зависимости от целей исследования верхняя доза ниже, чем доза, подтверждающая наличие токсичности, может быть выбрана, например, если доза вызывает токсическое действие, которое, тем не менее, слабо отражается на продолжительности жизни или массе тела.

3.3.4. Уровни доз и интервалы между дозами могут быть выбраны для установления дозозависимого эффекта и в зависимости от механизма действия испытуемого вещества NOAEL или других предполагаемых результатов исследования, например BMD. Условия, которые должны быть приняты во внимание при установлении нижней дозы, включают: предполагаемый наклон кривой дозовой зависимости; дозы, при которых могут происходить важные изменения в метаболизме или механизме токсического действия, когда пороговая величина предполагается, или когда предполагается исходная точка для экстраполяции низкой дозы. При проведении комбинированного исследования канцерогенности/хронической токсичности, основная цель заключается в получении информации об оценке рисков канцерогенности, а информация о хронической токсичности, как правило, является вторичной задачей. Это должно быть учтено при выборе доз и интервалов между дозами для исследования.

3.3.5. Избранная разница в уровне доз будет зависеть от целей исследования и параметров тестируемого вещества и не может быть прописана в этом стандарте. Но интервалы доз, отличающиеся в 2-4 раза, оптимальны для установления уровней более низких доз, а при использовании очень больших интервалов (например, диапазон примерно 6-10) между дозировками предпочтительно добавление четвертой тестируемой группы. В целом следует избегать использования диапазона выше 10, а его применение должно быть обосновано.

3.3.6. Согласно MP 116, при выборе дозы следует учитывать:

- знания или предположения о нелинейностях или точках перегиба в зависимости доза-ответ;

- токсикокинетику и диапазон доз, когда имеет место или отсутствует метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между внешними и внутренними дозами;

- признаки поражения, влияния или показатели воздействия на основные биологические процессы;

- основные (или предполагаемые) проявления механизма действия, такие как дозы, от которых начинает увеличиваться цитотоксичность, нарушается гормональный уровень, подавляется гомеостатический механизм и т.д.;

- интервалы кривой доза-эффект, где необходима чрезвычайно надежная оценка, например, в пределах ожидаемых BMD (исходная точка для установления минимальной дозы) или предполагаемых пороговых величин;

- уровни анализа предполагаемого воздействия на организм человека, особенно в выборе средних и низких доз.

3.3.7. Контрольная группа не должна получать исследуемое вещество или может получать, если она используется при введении тестируемого вещества. За исключением введения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться тем же способом, что и с экспериментальными группами. Если используется среда, контрольная группа должна получать ее в максимальном объеме от используемого в экспериментальных группах. Если исследуемое вещество вводится с пищей и тем самым заметно снижает потребление пищи из-за снижения ее вкусовых качеств, будет полезна контрольная, получающая такое же питание и служащая для более адекватного контроля.

3.4. Подготовка доз и введение исследуемого вещества

3.4.1. Как правило, исследуемое вещество вводится перорально: с пищей, с питьевой водой или через зонд. Дополнительная информация о способах и методах введения содержится в MP 116. Способ и метод введения зависят от цели исследования, физических/химических свойств вещества, его биологической усвояемости и основного способа и метода введения в человеческий организм. Должно быть дано обоснование выбранного способа и метода введения. Как правило, в интересах благополучия животных, способ введения с помощью зонда следует выбирать только для тех веществ, которые предполагают данный способ и метод введения человеку (например, лекарственные препараты). Для веществ в составе продуктов питания или загрязняющих химических веществ, включая пестициды, введение обычно осуществляется через пищу или питьевую воду. Однако для некоторых сценариев воздействия, например при профессиональном воздействии, введение другими способами может быть более подходящим.

3.4.2. При необходимости исследуемое вещество растворяется или вносится в соответствующую среду. Следует при необходимости уделить внимание следующим характеристикам среды или других вспомогательных веществ: влияние на абсорбцию, распределение, метаболизм или задержку исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, которые могут повысить его токсические свойства; влияние на потребление пищи или воды или обусловленное питанием состояние животных. Рекомендуется, где возможно, использовать в первую очередь водные растворы/суспензии, затем рассматривать раствор эмульсии в масле (например, кукурузное масло), и затем искать возможное использование других сред. Для сред, отличных от воды, должны быть известны их токсические свойства. Должна иметься информация о стабильности исследуемого вещества и однородности растворов с дозой или пищей (при необходимости) в условиях введения (например, пища).

3.4.3. Для веществ, вводимых с пищей или питьевой водой, важно убедиться, что включенное количество исследуемого вещества не препятствует нормальному питанию или потреблению воды. В долгосрочных исследованиях токсичности, использующих введение с пищей, концентрация химического вещества в пище не должна в норме превышать ограничение в 5% от общего количества потребляемой пищи, чтобы избежать пищевого дисбаланса. Когда тестируемое вещество вводится в пищу, могут использоваться или постоянная концентрация в пище (мг/кг или ррm), или постоянный уровень дозы в показателях массы тела животного (подсчитывается еженедельно). Другое использование должно быть описано.

3.4.4. В случае перорального введения животные получают дозу исследуемого вещества ежедневно (семь дней в неделю), как правило, в течение 12 (хроническая фаза) или 24 месяцев (фаза канцерогенности). Любой другой режим дозирования, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован. В случае нанесения на кожу животные, как правило, подвергаются воздействию исследуемого вещества в течение не менее 6 часов в сутки, 7 дней в неделю, как указано в MP 410, сроком на 12 месяцев (хроническая фаза) или 24 месяца (фаза канцерогенности). Воздействие ингаляционным способом длится 6 часов в день, 7 раз в неделю, но может быть использовано воздействие 5 часов в день, если это обосновано. Общая длительность воздействия обычно составляет 12 месяцев (хроническая фаза) или 24 месяца (фаза канцерогенности). Если воздействию "только через нос" подвергаются виды грызунов, отличные от крыс, длительность воздействия может быть изменена, чтобы минимизировать видоспецифичные тяжелые недомогания. Воздействие продолжительностью менее 6 часов должно быть обосновано. См. также MP 412.

3.4.5. Когда исследуемое вещество вводится животным через зонд, следует использовать желудочный зонд или подходящую полую трубку в одно и то же время ежедневно. Как правило, одна доза будет вводиться раз в день. Когда состав вызывает раздражение, можно поддерживать ежедневную дозировку путем введения небольших доз (дважды в день). Максимальный объем жидкости, который может быть введен единовременно, зависит от размеров подопытного животного. Объем должен держаться как можно ниже и не превышать 1 мл/100 г массы грызунов. Колебания в тестовом объеме должны быть сведены к минимуму путем корректировки концентрации до обеспечения постоянного объема всех уровней дозы. Потенциально разъедающие или раздражающие вещества являются исключительным случаем. Их необходимо разбавлять, чтобы избежать тяжелых локальных поражений. Тестирований при концентрациях, которые могут разъедать или раздражать желудочно-кишечный тракт, следует избегать.

3.5. Продолжительность исследования

3.5.1. Период дозирования и продолжительность хронической фазы этого исследования, как правило, 12 месяцев, хотя метод исследования позволяет сокращать (например, 6 или 9 месяцев) или увеличивать (например, 18 или 24 месяцев) продолжительность исследования, в зависимости от определенных нормативных требований или для конкретных целей. Отклонения от продолжительности воздействия в 12 месяцев должны быть обоснованы, особенно в случае сокращения сроков. Введение доз, отнесенных в этой фазе, должно быть завершено в назначенное время для оценки хронической токсичности и неопухолевых патологий. Вспомогательные группы, включенные для наблюдения за обратимостью любых токсикологических изменений и стимулируемые химическим веществом, следует держать без дозировок не менее 4 недель, но не более одной трети от общего периода исследования после прекращения воздействия.

3.5.2. Продолжительность фазы канцерогенности этого исследования будет, как правило, длиться 24 месяца для грызунов, являясь большей частью нормального жизненного цикла подопытных животных. Более короткие или более длительные исследования могут быть использованы в зависимости от продолжительности жизни видов животных в исследовании, но должны быть обоснованы. Для определенных видов мышей, например, виды AKR/J, C3H/J или C57BL/6J, продолжительность в 18 месяцев может являться наиболее подходящей. Ниже приводятся некоторые рекомендации по продолжительности, окончании исследования и выживаемости; прочие указания, включая рассмотрение вопроса о приемлемости исследования отрицательной канцерогенности, относящейся к выживаемости в исследовании, приведены в MP 116:

- следует рассмотреть прекращение исследования, если число выживших в группах с низкой дозой или контрольной группе ниже 25%;

- в случае когда только в группах с высокой дозой умирают преждевременно вследствие токсичности, исследование не прекращается;

- выживаемость каждого пола следует рассматривать отдельно;

- исследование не должно длиться дольше того момента, когда данные, получаемые от него, уже недостаточны для статистически достоверной оценки.

4. Фаза хронической токсичности

4.1. Наблюдение

4.1.1. В начале и в конце каждого дня, включая выходные и праздники, необходимо осуществлять контроль заболеваемости и смертности всех животных, а также токсикологически значимые признаки. Общее клиническое наблюдение должно осуществляться, как минимум, один раз в день, предпочтительно в одно и то же время, принимая во внимание период максимума предполагаемого воздействия дозы в случае применения введения через зонд.

4.1.2. Подробное клиническое обследование должно быть проведено, как минимум, один раз до начала воздействия (учитывая предмет исследования), к концу первой недели исследования и впоследствии ежемесячно. Протокол наблюдений должен быть согласован так, чтобы обеспечить минимальную разницу между отдельными наблюдателями, и независимость от тестовой группы. Эти обследования необходимо делать вне клетки постоянного пребывания, каждый раз в одном месте, в одно и то же время. Их следует тщательно фиксировать, желательно использовать систему количественных показателей, четко оговоренную испытательной лабораторией. Необходимо следить за тем, чтобы варьирование в условиях наблюдения было минимальным. Отмеченные признаки должны включать: изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреции и экскреции и автономной активности (например, слезоотделение, пилоэрекция, размер зрачка, патологическое дыхание) и т.д. Изменения в походке, положении тела, реакции на прикосновение, как и наличие клонических или тонических движений, стереотипы поведения (например, чрезмерное умывание, однообразные движения по кругу) или аномальное поведение (например, членовредительство, хождение задом наперед) также должны регистрироваться.

4.1.3. Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента следует проводить всем животным до первого введения исследуемого вещества. По окончании исследования этот осмотр желательно провести всем животным, но, как минимум, группе с высокой дозой и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена.

4.1.4. Для химических веществ, предварительные исследования которых на токсичность с повторным приемом дозы через 28 дней и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать нейротоксическое воздействие, сенсорную реактивность к раздражителям различного типа (например, слуховые, визуальные и проприоцептивные раздражители), оценку силы схвата и двигательной активности можно проводить по выбору до начала исследования и в 3-месячный период после начала исследования, вплоть до 12 месяцев, а также по окончании исследования (если оно длится более 12 месяцев). Дополнительные сведения о возможных последующих процедурах приведены в списке литературы соответственно. Однако можно использовать и другие, не приведенные в списке процедуры.

4.1.5. Для химических веществ, где предварительные исследования на токсичность с повторным приемом дозы через 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать иммунотоксическое воздействие, дальнейшие исследования этого результата могут, по желанию, проводиться по окончании исследования.

4.2. Масса тела, потребление пищи/воды

Все животные должны взвешиваться в начале эксперимента, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется.

4.3. Гематология и клиническая биохимия

4.3.1. В исследованиях, при которых задействуются грызуны, гематологические исследования необходимо проводить всем исследуемым животным (10 самцам и 10 самкам каждой группы), на 3, 6 и 12 месяцы, а также при прекращении исследования (если оно длится более 12 месяцев). В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные для того, чтобы проводить все необходимые гематологические исследования (см. п. 19). В исследованиях с негрызунами пробы будут браться у меньшего количества животных (например, 4 особи каждого пола каждой группы в случае с исследованием собак), во время промежуточного взятия проб и по окончании исследования, как описано для грызунов. Нет необходимости проводить измерения ни у грызунов, ни у негрызунов в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на гематологические параметры. Пробы крови следует брать из указанных мест, например, сердечная пункция или из ретро-глазной пазухи под анестезией.

4.3.2. Необходимо исследовать приведенный список параметров: общая и дифференциальная лейкоцитарная формула, содержание эритроцитов, содержание тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит (гематокритное число), среднее гематокритное число (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН), концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), протромбиновое время и время образования и активности тромбопластина. Другие гематологические параметры, такие как тельца Гейнца или другая атипичная морфология эритроцитов и метгемоглобина, могут быть измерены по мере необходимости в зависимости от токсичности вещества. В целом в зависимости от наблюдаемого и/или ожидаемого эффекта от данного вещества должен использоваться гибкий подход. Если химические вещества оказывают влияние на кроветворную систему, можно также измерить число ретикулярных клеток и сделать цитологию костного мозга, хотя они не обязательны для регулярного проведения.

4.3.3. Клинические биохимические измерения для исследований основного токсического воздействия на ткани, и особенно влияние на почки и печень, следует проводить на пробах крови, полученных от, как минимум, 10 самцов и 10 самок каждой группы за одинаковые временные интервалы, как предписано для гематологических исследований, всегда используя одних и тех же животных. В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные для того, чтобы провести все необходимые клинические биохимические исследования. В исследованиях с не-грызунами, образцы будут браться у меньшего количества животных (например, 4 животных каждого пола в каждой группе при исследованиях собак), во время промежуточного взятия проб и по окончании исследования, как описано для грызунов. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, ни у грызунов, ни у негрызунов, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на клинические биохимические параметры. Рекомендуется* голодание для животных (за исключением мышей) вечером накануне забора крови. Необходимо исследовать приведенный список параметров: глюкоза, моча (азот мочевины), креатинин, общий белок, альбумин, кальций, натрий, калий, общий холестерин, как минимум, два анализа на гепатоцеллюлярный анализ (аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, глютаминатдегидрогеназа, желчные кислоты) и, как минимум, два анализа на гепатобилиарный анализ (щелочная фосфатаза, гамма-глутаминтрансфераза, 5'-ну- клеотидаза, общий билирубин, желчные кислоты). Другие клинические химические показатели, такие как триглицерид натощак, специфические гормоны и холинэстераза могут быть измерены в случае необходимости в зависимости от токсичности вещества. В целом необходим гибкий подход в зависимости от наблюдаемого и/или ожидаемого воздействия каждого конкретного вещества.

4.3.4. Анализ мочи должен проводиться у всех исследуемых животных (10 самцов и 10 самок каждой группы) на образцах, собранных за одинаковые промежутки времени, как и в случае с гематологией и клинической химией. Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне дозы не наблюдалось воздействия на мочу. В экспертные рекомендации по исследованию клинической патологии был включен следующий список параметров: внешний вид, объем, осмотическая концентрация раствора или относительная плотность, рН, общий белок и глюкоза. Другие исследования включают кетон, уробилиноген, билирубин и скрытую кровь. Дополнительные исследования могут быть использованы при необходимости расширить изучение наблюдаемых воздействий.

4.3.5. Как правило, считается, что основные гематологические и клинические биохимические параметры необходимо определять до начала терапии при исследованиях собак, но нет необходимости их определять в исследованиях грызунов. Однако, если исторические исходные данные недостаточны, следует уделить внимание созданию таких данных.

4.4. Патология (макроскопическая аутопсия)

4.4.1. Все животные в исследовании, как правило, подвергаются полной, детальной макроскопической аутопсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудных и брюшных полостей и их содержимого. При этом может быть сделан резерв (в группах для промежуточных умерщвлений или во вспомогательных группах) для измерений, ограниченных отдельными важными показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность. Этих животных не нужно подвергать аутопсии и дальнейшим процедурам, описанным в последующих пунктах. Индикаторные животные могут требовать аутопсии в каждом отдельном случае на усмотрение руководителя исследования.

4.4.2. Значимые органы следует собрать у всех животных, исключая тех, которые упомянуты выше. Надпочечник, мозг, придатки яичка, сердце, почки, печень, яичники, селезенка, яички, щитовидная железа (оценив постфиксацию, с паращитовидной железой) и матка всех животных (кроме тех, что были найдены падшими и/или были промежуточно умерщвлены) должны быть отсечены, если необходимо, от прилегающих тканей и взвешены как можно быстрее после отсечения для предотвращения высыхания.

4.4.3. Следующие ткани должны быть законсервированы в наиболее подходящем средстве фиксации в качестве образца ткани для запланированного дальнейшего микроскопического исследования (ткани, указанные в квадратных скобках, являются необязательными для исследования):

- все макроскопические повреждения
- мозг (включая полушария головного мозга, мозжечок и мозговой слой / варолиев мост)	- толстая кишка
- гипофиз	- слепая кишка
- глазные яблоки (включая сетчатку)	- [прямая кишка]
- слезные железы (эксорбитальные)	- поджелудочная железа
- гардерова железа	- печень
- шея	- желчный пузырь (для видов, отличных от крыс)
- спинной мозг (трех уровней: шейный, средне-грудной и поясничный)	- селезенка
- часть костного мозга и/или свежий пунктат костного мозга	- почки
- [обонятельная луковица]	- лимфатические узлы (и поверхностные, и глубокие)
- [верхний респираторный тракт, включая носовую раковину и параназальные синусы]	- скелетные мышцы
- [язык]	- периферический нерв
- [зубы]	- [бедро с суставами]
- слюнные железы	- [грудная кость]
- легкие	- кожа
- трахея	- мочевой пузырь
- сердце	- [мочеточник]
- аорта	- [уретра]
- щитовидная железа	- молочные железы (обязательно для самок, если имеются видимые изменения - у самцов)
- паращитовидная железа	- матка (включая шейку)
- вилочковая железа	- яичники
- надпочечники	- влагалище
- пищевод	- предстательная железа
- желудок (кардиальный отдел желудка, железистый желудок)	- яичко
- двенадцатиперстная кишка	- семенной пузырек
- тонкая кишка	- свертывающая железа
- подвздошная кишка	- придаток семенника

4.4.4. В случае с парными органами, например почки, надпочечники, следует сохранять оба органа. Клинические и другие данные могут потребовать изучения дополнительных тканей. Любые другие органы, считающиеся на основе известных свойств исследуемого вещества возможными органами-мишенями, также следует сохранить. В исследованиях, где используется накожный способ введения, должны быть сохранены те же органы, что установлены в списке для перорального введения, а также необходимо сохранить образцы кожи с места нанесения. В ингаляторных исследованиях список сохраняемых и исследуемых тканей дыхательных путей должен следовать рекомендациям из MP 412 и MP 413. Для других органов/тканей (и в дополнение к отдельно сохраняемым тканям из дыхательных путей) список органов, как он установлен для перорального введения, должен быть пересмотрен.

4.5. Гистопатология

4.5.1. Имеется руководство по наработанным методам в рамках токсикологических патологических исследований. Минимальными гистопатологическими анализами должны быть:

- все ткани из группы с высокой дозой и контрольной группы;

- все ткани животных, падших или умерщвленных в течение исследования;

- все ткани, имеющие макроскопические аномалии;

- ткани органов-мишеней или ткани, демонстрирующие связанные с проводимой терапией изменения, в группе с высокой дозировкой и всех животных всех других групп;

- в случае с парными органами, например почки, надпочечники, должны быть исследованы оба органа;

5. Фаза канцерогенности

5.1. Наблюдение

5.1.1. Должны контролироваться заболеваемость или смерть всех животных, а также особые токсикологически значимые признаки, обычно в начале и в конце каждого дня, включая выходные и праздники. Животные должны дополнительно проверяться раз в день для выявления конкретных признаков токсикологического значения. В случае исследований с использованием зонда, животные должны быть проверены непосредственно после введения дозы. Особое внимание следует обратить на развитие опухолей. Время появления опухоли, расположение, размеры, внешний вид и развитие каждой видимой или ощутимой опухоли должны быть зарегистрированы.

5.1.2. Все животные должны взвешиваться в начале терапии, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду.

5.1.3. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется.

5.2. Гематология, клиническая биохимия и другие измерения

5.2.1. В целях извлечения как можно большего количества информации, полученной в исследовании, особенно для анализа способа воздействия, для гематологии и клинической биохимии могут браться образцы крови, хотя это остается на усмотрение руководителя исследования. Целесообразным может быть анализ мочи. Данные по животным, используемым в фазе исследования хронической токсичности, как правило, длящегося 12 месяцев, обеспечат информацию по этим параметрам. Дальнейшие рекомендации по важности сбора таких образцов как части исследования канцерогенности содержатся в MP 116. Если решено брать образцы крови, они должны быть собраны в конце периода исследования, непосредственно перед или как часть процедуры умерщвления животных. Они должны быть взяты из указанного места, например путем сердечной пункции или из ретро-орбитальной пазухи под наркозом. Также может быть подготовлен для изучения клинический анализ крови, особенно если органом-мишенью оказался костный мозг, хотя значение исследования клинического анализа крови в фазе канцерогенности для оценки канцерогенных/онкогенных потенциалов находится под сомнением.

5.3. Патология (макроскопическая аутопсия)

5.3.1. Все животные, участвующие в исследовании, кроме пробных животных и других вспомогательных животных, как правило, подвергаются полной, детальной макроскопической аутопсии, которая включает тщательное исследование наружной поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудных и брюшных полостей и их содержимого. Индикаторным животным и другим вспомогательным животным в отдельных случаях может требоваться аутопсия, по усмотрению руководителя исследования. Взвешивание органов обычно не является частью исследования канцерогенеза, так как возрастные изменения, а на более поздних стадиях - развитие опухолей, искажают ценность измерения веса органов. Они, однако, могут иметь решающее значение для определения оценки обоснованности доказательства, и особенно для анализа способа воздействия. Если они являются частью вспомогательного исследования, они должны собираться не позднее одного года после начала исследования.

5.3.2. Следующие ткани должны быть законсервированы в наиболее подходящем средстве фиксации в качестве образца ткани для запланированного дальнейшего микроскопического исследования (ткани, указанные в квадратных скобках, являются необязательными для исследования):

- все макроскопические повреждения
- мозг (включая полушария головного мозга, мозжечок и мозговой слой / варолиев мост)	- толстая кишка
- гипофиз	- слепая кишка
- глазные яблоки (включая сетчатку)	- [прямая кишка]
- слезные железы (эксорбитальные)	- поджелудочная железа
- гардерова железа	- печень
- шея	- желчный пузырь (для видов, отличных от крыс)
- спинной мозг (трех уровней: шейный, средне-грудной и поясничный)	- селезенка
- часть костного мозга и/или свежий пунктат костного мозга	- почки
- [обонятельная луковица]	- лимфатические узлы (и поверхностные, и глубокие)
- [верхний респираторный тракт, включая носовую раковину и параназальные синусы]	- скелетные мышцы
- [язык]	- периферический нерв
- [зубы]	- [бедро с суставами]
- слюнные железы	- [грудная кость]
- легкие	- кожа
- трахея	- мочевой пузырь
- сердце	- [мочеточник]
- аорта	- [уретра]
- щитовидная железа	- молочные железы (обязательно для самок, если имеются видимые изменения - у самцов)
- паращитовидная железа	- матка (включая шейку)
- вилочковая железа	- яичники
- надпочечники	- влагалище
- пищевод	- предстательная железа
- желудок (кардиальный отдел желудка, железистый желудок)	- яичко
- двенадцатиперстная кишка	- семенной пузырек
- тонкая кишка	- свертывающая железа
- подвздошная кишка	- придаток семенника

5.3.3. В случае с парными органами, например почки, надпочечники, следует сохранять оба органа. Клинические и другие данные могут потребовать изучения дополнительных тканей. Любые другие органы, считающиеся на основе известных свойств исследуемого вещества возможными органами-мишенями, также следует сохранить. В исследованиях, где используется дермальный способ введения, должны быть сохранены те же органы, что указаны в списке для перорального введения, а также необходимо сохранить образцы кожи с места нанесения. В ингаляторных исследованиях список сохраняемых и исследуемых тканей дыхательных путей должен следовать рекомендациям из OECD TG 412 и 413. Для других органов/тканей (и в дополнение к отдельно сохраняемым тканям из дыхательных путей) список органов, как он установлен для перорального введения, должен быть пересмотрен.

5.4. Гистопатология

5.4.1. Имеется руководство по наработанным методам в рамках токсикологических патологических исследований. Минимальными гистопатологическими анализами должны быть:

- все ткани из группы с высокой дозой и контрольной группы;

- все ткани животных, падших или умерщвленных в течение исследования;

- все ткани, имеющие макроскопические аномалии;

- ткани органов-мишеней или ткани, демонстрирующие связанные с проводимой терапией изменения, в группе с высокой дозировкой и всех животных всех других групп;

- в случае с парными органами, например почки, надпочечники, должны быть исследованы оба органа.

6. Данные и отчет

6.1. Данные об испытании

6.1.1. Данные по каждому животному должны быть представлены по всем оцениваемым параметрам в табличной форме с указанием для каждой исследуемой группы: количества животных в начале исследования; количества животных, найденных мертвыми во время исследования или умерщвлённых по гуманным соображениям и время смерти или любого гуманного умерщвления; количества демонстрируемых признаков токсичности; описания наблюдаемых признаков токсичности, в том числе время начала, продолжительность и тяжесть любого токсического воздействия; количества животных с поражениями, типы поражений и процент животных относительно каждого типа поражения. Сводные данные таблицы должны обеспечить средние и стандартные отклонения (для непрерывных данных теста), показывающие токсические эффекты или повреждения, в дополнение к классификации поражений.

6.1.2. Данные контроля предыдущих исследований могут быть полезны при интерпретации результатов исследования, например, в случае когда имеются признаки того, что данные, представленные параллельными наблюдениями, существенно отличаются от последних данных контрольных животных той же исследовательской лаборатории/колонии.

6.1.3. Данные контроля предыдущих исследований, если оцениваются, должны предоставляться из той же лаборатории, относиться к животным того же возраста и вида, быть созданы в течение пяти лет, предшествовавших спорному исследованию.

6.1.4. При необходимости численные результаты должны быть оценены надлежащим и в целом приемлемым статистическим методом. Статистические методы и данные для анализа должны выбираться в ходе разработки исследования. Выбор должен предусматривать корректировки для выживаемости, если это необходимо.

6.2. Отчет об испытании

Отчёт об исследовании должен содержать следующую информацию:

Исследуемое вещество:

- физические природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные;

- источник вещества;

- номер партии;

- сертификат химического анализа.

Среда (при необходимости):

- обоснование выбора среды (если это не вода).

Подопытные животные:

- вид/род и обоснование сделанного выбора;

- число, возраст, пол в начале исследования;

- происхождение, условия содержания, питание и так далее;

- вес каждого животного в начале исследования.

Данные об условиях проведения исследования:

- обоснование метода введения и выбора дозы;

- по необходимости, статистические методики, используемые для анализа данных;

- подробное описание приготовления состава тестируемого вещества/пищи;

- аналитические данные по достигнутой концентрации, стабильности и гомогенности препарата;

- способ введения вещества и подробное описание введения исследуемого вещества;

- при ингаляционных исследованиях: был ли задействован только нос или все тело;

- фактическая доза (мг/кг в день) и переводной коэффициент от концентрации исследуемого вещества в пище/питьевой воде к фактической дозе, если возможно;

- качество пищи и воды.

Результаты (сводные таблицы данных и персональных данных животных)

Общие:

- данные о выживших;

- масса/изменения массы;

- потребление еды, подсчёт энергетической ценности, если проведён, и потребление воды, если возможно;

- токсикокинетические данные (если возможно)

- офтальмология (если возможно);

- гематология (если возможно);

- клиническая химия (если возможно).

Клинические результаты:

- признаки токсичности;

- охват (и, если выявлена, тяжесть) любой аномалии;

- характер, точность и продолжительность клинических наблюдений (были они промежуточными или постоянными).

Данные аутопсии:

- конечная масса тела;

- вес органов и их соотношения, если это необходимо;

- результаты аутопсии; распространённость и тяжесть нарушений.

Гистопатология

- неопухолевые гистопатологические данные;

- опухолевые гистопатологические данные;

- корреляция между общими и микроскопическими данными;

- детальное описание всех связанных с лечением гистопатологических результатов, в том числе строгость градуировки;

- информация о любом сравнительном исследовании мазков.

Статистическая обработка результатов (при необходимости)

Изучение результатов, включающее:

- изучение возможности моделирования;

- соотношение зависимости доза-ответ;

- данные исторического контроля;

- рассмотрение любой формы воздействия;

- определение BMD, NOAEL или LOAEL;

- значимость для человека.

Выводы.