Приложение 6.7.4. Исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза

Приложение 6.7.4

Исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза

Идентичен международному документу OECD TG N 426 "Developmental Neurotoxicity Study" (ОЭСР Руководство N 426 "Исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза"). Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает оценку и определение токсикологических характеристик химического вещества и продукции на их основе, таких как нейротоксичности, в процессе онтогенеза и позволяют оценить и классифицировать вещество в соответствии с СГС по данному виду воздействия.

2. Общие положения

2.1. Исследование нейротоксичности химических веществ и продукции на их основе на процесс онтогенеза необходимо для получения данных, таких как доза-эффект, потенциальные функциональные и морфологических отклонения в развитии нервной системы потомства, в результате их воздействия на эмбрион в утробе матери и в раннем возрасте.

2.2. Исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза может проводиться как отдельное исследование и/или может быть включено в изучение репродуктивной токсичности и/или исследование нейротоксичности взрослого и/или исследование пренатальной токсичности (например, Руководящие принципы испытаний 415, 416, 424, 414).

2.3. Если исследование нейротоксичности в процессе онтогенеза заключено в другое исследование, необходимо сохранить целостность обоих типов исследования.

2.4. Все исследования должны соответствовать действующим нормам и правилам использования лабораторных животных.

2.5. До проведения эксперимента необходимо рассмотреть всю доступную об исследуемом веществе информацию. Такая информация включает данные: идентичность и химическую структуру вещества, его физико-химические свойства, результаты любых других испытаний in vitro или in vivo, токсичность вещества; токсикологические данные о структурно родственных веществах; предполагаемое использование вещества. Эта информация необходима для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

3. Принцип метода

3.1. Тестируемое вещество вводят животным в период беременности и лактации.

3.2. Для оценки нейротоксических эффектов у беременных и кормящих самок, а также для получения сравнительной информации о матерях и потомстве исследуют самок-матерей.

3.3. Для оценки нейротоксичности у потомства животные выбираются случайным образом в пределах помета.

3.4. Оценка нейротоксического действия состоит из наблюдения для обнаружения грубых неврологических и поведенческих отклонений, включая оценку физического развития, поведенческий онтогенез, двигательную активность, моторные и сенсорные функции, обучение и память, а также для оценки массы мозга и невропатологий во время постнатального развития и зрелости.

3.5. Если исследование проводится самостоятельно, то дополнительные животные, имеющиеся в каждой группе, могут использоваться для проведения уточняющих нейроповеденческих, нейропатологических, нейрохимических или электрофизиологических исследований. Подобные исследования необходимы при эмпирическом наблюдении ожидаемых эффектов или при моделировании механизма действия. Дополнительные исследования, демонстрирующие конкретный тип нейротоксичности, могут быть использованы как для матерей, так и для детенышей.

4. Описание метода

4.1. Подопытные животные

4.1.1. Выбор видов животных.

Для проведения тестирования предпочтительным видом животных являются крысы, однако при необходимости могут использоваться другие виды животных.

Указанные в данном методе внутриутробные и послеродовые периоды являются специфическими для обычно используемых линий крыс, соответственно следует выбрать сопоставимые периоды, если используются другие виды или необычные линии животных.

Использование других видов животных должно быть документально подтверждено на основании токсикологических, фармакокинетических и/или других характеристик.

Обоснование должно включать наличие видоспецифичной послеродовой нейроповеденческой и нейропатологической оценок. Если ранее проведенный тест выявил обеспокоенность видом или линией животных, то его необходимо принять во внимание.

Из-за различных поведенческих свойств разных линий крыс необходимо наличие доказательств того, что выбранная для тестирования линия является адекватной по плодовитости и ответной реакции.

4.1.2. Содержание и условия кормления.

Микроклиматические условия в помещении, в котором содержатся животные, должны быть следующими: температура , относительная влажность воздуха - 30-70% (во время уборки комнаты 50-60%).

Освещение в помещениях искусственное с соблюдением последовательности 12 часов света, 12 часов темноты. Возможно также изменение светового цикла перед спариванием и в течение исследования для выполнения оценки функциональных и поведенческих показателей в темное время (при красном свете), т.е. в течение обычно активного периода животных. Любые изменения в цикле свет-темнота должны быть достаточно продолжительными для адаптации животных к новому циклу.

Животные должны содержаться с использованием соответствующей диеты и с неограниченным потреблением питьевой воды. Тип пищи и воды должны быть представлены в отчете и проанализированы на наличие загрязнений.

Экспериментальных животных содержат в клетках по отдельности или малыми группами одного пола. Процедуру спаривания следует проводить в клетках, подходящих для этой цели. После подтверждения копуляции или не позднее 15-го дня беременности пары животных должны содержаться в клетках отдельно в родовых или материнских клетках.

Беременных самок при приближающихся родах необходимо обеспечить материалами, необходимыми для образования гнезда.

Клетки должны быть расположены таким образом, чтобы возможные эффекты, связанные с перемещением клеток, были бы сведены к минимуму.

Для защиты потери плода от факторов, не связанных с введением тестируемого вещества, животные во время беременности должны быть ограждены от стрессов, вызываемых внешними факторами: следует избегать чрезмерных внешних шумов.

4.1.3. Подготовка животных.

Для исследования используются только здоровые, не подвергавшиеся ранее экспериментальным воздействиям животные, которые адаптировались в лабораторных условиях, одинакового веса и возраста в пределах нормального диапазона данного вида и линии (насколько это практически возможно). На каждом уровне дозы используются молодые половозрелые нерожавшие самки экспериментальных животных. В разных группах используется равное количество самок для оплодотворения и самцов. Не допускается спаривания братьев и сестер.

Каждое животное помечается с присвоением уникального идентификационного номера. Подопытные животные должны быть охарактеризованы: вид, линия, источник, пол, вес и возраст.

День наступления беременности (ДНБ): 0 - это день, в который наблюдается вагинальная пробка и/или сперма. При наступлении беременности животным предоставляется достаточное время для адаптации (например, 2-3 дня).

Беременные самки для контроля и введения тестируемого вещества равномерно распределяются между группами. Рекомендуется стратифицированная случайная процедура выборки, чтобы обеспечить равномерное распределение между всеми группами. Например, на основе массы тела.

4.2. Способ введения и дозы препарата

Тестируемое вещество вводится перорально ежедневно (7 дней в неделю), через желудочный зонд или с использованием желатиновых капсул.

Жидкости могут быть даны как в неразбавленном виде, так и растворенные в соответствующих растворителях, таких как кукурузное масло. Твердые частицы должны быть суспендированы, если это возможно, так как большие дозы твердых веществ в желатиновых капсулах могут не оказывать эффект.

Токсикологические характеристики неводных растворителей должны быть известны или определены до начала исследования.

4.3. Процедура испытания

4.3.1. Количество животных и группы тестирования.

Экспериментальные и контрольная группа должны содержать достаточное число беременных самок, чтобы произвести достаточное количество потомства для оценки нейротоксичности.

Для каждого уровня дозы рекомендуются 20 пометов. Допускается репликация и шахматный порядок дозирования в группах, если общее количество пометов в группе будет соответствовать статистической модели, используемой для учета повторов.

Для получения одинакового количества детенышей для всех пометов или перед постнатальным днем (ПНД 4) (день родов ПНД 0), размер каждого помета корректируют за счет устранения дополнительных детенышей случайным образом. Неприемлемо выборочное уменьшение количества детенышей, например на основе массы тела.

Размер помета не должен превышать 8-12 детенышей, средний уровень для линии использованных грызунов. Помет должен содержать равное количество детенышей-самцов и самок, насколько это возможно.

4.3.2. Распределение животных для функциональных и поведенческих тестов, оценки массы мозга и нейропатологической оценки.

А. Рекомендуются различные подходы по отношению к распределению животных, на которых воздействовали внутриутробно и через лактацию для функциональных и поведенческих тестов на половое созревание, определение веса мозга и нейропатологическую оценку.

Тесты нейроповеденческой функции (например, социальное поведение), нейрохимии и нейропатологии добавляются индивидуально, в каждом конкретном случае, при условии ненарушения целостности необходимых исследований.

После ПНД 4 для оценки конечного показателя отбирают детенышей из каждой экспериментальной группы. Выбор детенышей выполняется таким образом, чтобы детеныши обоих полов из каждого помета были представлены в каждой экспериментальной группе во всех тестах в равной степени.

Одна пара детенышей - самцов и самок - всех возрастов проверяется до отъема для тестирования двигательной активности. Для остальных тестов также отделяются пары самцов и самок.

Для изучения когнитивных функций отъемышей (по сравнению со взрослыми животными) во избежание смешанных эффектов возраста используются различные детеныши.

Детеныши (при отъеме ПНД 21), не выбранные для тестирования, подвергаются эвтаназии.

Любые изменения в распределении детенышей документируются и представляются в отчете. Статистической единицей измерения является помет, а не детеныш.

В. Подходы к отбору детенышей для исследований до отъема и после отъема (когнитивных тестов, для патологической экспертизы, и т.д., рисунок прилож. 6.7.4.1).

Минимальное рекомендуемое количество животных в каждой экспериментальной группе для исследования до отъема и после отъема:

Клинические наблюдения и масса тела	Все животные
Подробные клинические наблюдения	20/пол (1/пол/из помета)
Масса мозга (после фиксации) ПНД 11-22	10/пол (1/пол/из помета)
Масса мозга (нефиксированный) ПНД 70	10/пол (1/пол/из помета)
Нейропатология (фиксация погружением или перфузией) ПНД 11-22	10/пол (1 /пол/из помета)
Нейропатология (фиксация перфузией) ПНД 70	10 /пол (1/пол/из помета)
Половое созревание	20/пол (1/пол/из помета)
Другие ориентиры развития (необязательно)	Все животные
Поведенческий онтогенез	20/пол (1/пол/из помета)
Двигательная активность	20/пол (1/пол/из помета)
Моторные и сенсорные функции	20/пол (1/пол/из помета)
Обучение и память	10/пол (1/пол*/из помета)

- в зависимости от чувствительности тестов когнитивных функций, следует рассматривать количество оцениваемых животных более одного, например, от 1 самца и 1 самки в помете (прилож. 6.7.4.1). Подробные указания размера выборки представлены в Руководящем документе N 43.

4.3.3. Дозы для исследования.

Одновременно исследуются не менее трех доз и контроль. Уровни доз выбираются так, чтобы выявить градации токсических эффектов.

При отсутствии ограничений по физико-химическим или биологическим свойствам вещества, наиболее высокая доза должна вызывать выраженные токсические эффекты, унаследованные от матери (например, клинические признаки, снижение массы тела (не более 10%) и/или доказательство дозо-зависимых изменений в органе-мишени).

Высокая доза ограничивается до 1 000 мг/в день/кг веса тела. Исключением являются случаи, когда данные по воздействию вещества на человека указывают на необходимость использования более высоких уровней доз.

В предварительных исследованиях по выбору доз определяют самую высокую дозу, которая будет использована и которая обладает минимальной степенью материнской токсичности.

Если известно, что тестируемое вещество обладает токсическими эффектами, то самая высокая доза должна быть максимальной дозой, не вызывающей чрезмерного токсичного эффекта на потомство, выраженного внутриутробной или неонатальной смертностью, или дефектами, достаточной для предотвращения значимой выраженности (развития) нейротоксичности. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать никакого токсического эффекта, включая нейротоксичность, ни на самку, ни на потомство.

Убывающая последовательность уровней доз должна быть выбрана таким образом, чтобы продемонстрировать любые проявления зависимости доза-эффект и дозы, не вызывающей неблагоприятные воздействия (ДНВНВ), или дозы вблизи предела обнаружения, которые позволили бы определить ориентировочные дозы.

Интервал в два-четыре раза обычно является оптимальным для установления убывания уровня дозы и добавление четвертой группы дозы предпочтительно при использовании очень больших интервалов (например, более чем в 10 раз) между дозами.

Уровни доз должны быть выбраны с учетом всех существующих данных о токсичности, а также при наличии дополнительной информации о метаболизме и токсикокинетике тестируемого вещества. Эта информация также может помочь в выборе адекватного режима дозирования.

Введение вещества детенышам должно проводиться с учетом экспозиции и фармакокинетической информации. Перед проведением экспериментов по непосредственному введению вещества, необходимо провести тщательный анализ преимуществ и недостатков этого метода.

Параллельно с контрольной группой должна быть группа ложного контроля или контрольная группа растворителя, если растворитель используется для приготовления тестируемого вещества.

Тестируемое вещество (или растворитель), следует вводить в одинаковом объеме всем животным в расчете на массу тела.

При использовании растворителя или других добавок для облегчения введения вещества, необходимо учитывать характеристики применяемых веществ: воздействие на всасывание, распределение, метаболизм или адсорбцию тестируемого вещества; воздействие на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсические свойства, а также воздействие на потребляемую пищу или воду, или пищевой статус животных.

Растворитель не должен вызывать эффекты, которые могут повлиять на интерпретацию результатов исследования, не должен обладать нейро-поведенческой токсичностью и не должен влиять на репродуктивную функцию.

Для новых веществ - растворителей - группы ложного контроля должны быть включены в дополнение к группе растворителя. Животные в контрольной группе(ах) должны быть обработаны одинаковым образом с тестируемой группой.

4.3.4. Введение доз тестируемого вещества.

Тестируемое вещество или растворитель должны вводиться способом наиболее вероятного потенциального воздействия на человека и на основе имеющейся информации о метаболизме и распределении в организме подопытных животных.

Обычно используется пероральный способ введения (например, с помощью желудочного зонда или с пищей, или питьевой водой), также могут быть использованы другие способы введения (например, кожный или ингаляционный) в зависимости от характеристик и ожидаемых или известных путей воздействия на человека (последующие указания представлены в Руководящем документе 43).

Выбранный способ введения должен быть документально обоснован. Тестируемое вещество следует вводить ежедневно примерно в одно и то же время.

Для каждого животного вводимая доза основывается на результатах индивидуального определения массы тела. Однако следует проявлять особое внимание при расчете дозы в течение последней трети беременности. Если превышение токсичности отмечено у обследованных самок, то эти животные должны быть подвергнуты эвтаназии.

Тестируемое вещество и/или растворитель вводятся беременным самкам ежедневно с момента имплантации (МИ 6) и на протяжении лактации (ПНД 21) для воздействия тестируемого вещества во время пре- и постнатального развития нервной системы детенышей.

Возраст, в который начинается введение вещества, продолжительность и частота введения могут быть скорректированы.

При использовании других видов животных длительность введения вещества необходимо скорректировать для наблюдения нейротоксичности во все периоды развития мозга, соответствующим пренатальному и раннему постнатальному развитию человеческого мозга.

Возможно начинать вводить вещество с начала беременности (НБ 0), с учетом потенциальной возможности снижения предимплантационной функции тестируемым веществом. Введение вещества, начиная с НБ 6, позволяет избежать подобного риска, однако не будут рассмотрены стадии развития между НБ 0 и 6. Оптимальным сроком начала введения исследуемого вещества при спаривании лабораторных животных является срок НБ 6.

Учитывая достоверную информацию об эффектах тестируемого вещества, полученных в предшествующих экспериментах и расчетах, устанавливается режим дозирования вещества с возможным удлинением сроков введения.

В день родов животных исследуемые вещества не вводятся.

Предполагается, что воздействие исследуемого вещества на потомство будет происходить через материнское молоко, однако при недостаточности данных возможно непосредственное введение вещества детенышам.

Доказательством продолжающегося воздействия являются изменения био-маркеров, фармакокинетическая информация или данные о потомственной токсичности.

4.4. Наблюдения

4.4.1. Наблюдения за спариваемыми самками.

За всеми самками устанавливается наблюдение (не реже одного раза в день) за состоянием их здоровья, в том числе за заболеваемостью, смертностью и спариваемыми.

Во время введения тестируемого вещества и в периоды наблюдения необходимо периодически проводить более подробные клинические исследования (не реже двух раз при введении вещества в течение периода беременности и дважды в течение лактационного периода) с использованием, по меньшей мере, десяти самок на один уровень доз.

Животных осматривают вне клеток квалифицированные лаборанты, которые не знают о введении вещества животным, при этом необходимо использовать стандартные процедуры с целью минимизации стресса животных и предвзятости наблюдателей, а также максимизации надежности наблюдений. Желательно, чтобы наблюдения проводил один и тот же специалист.

Все наблюдения документируются по возможности, с величиной наблюдаемого эффекта. Клинические наблюдения включают изменения кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, появление выделений, и вегетативной активности (например, слезотечение, пилоэрекция, размер зрачка, необычный ритм дыхания и/или дыхание через рот, а также любые необычные признаки мочеиспускания или дефекации).

Регистрируются любые необычные реакции в отношении положения тела, уровня активности (например, уменьшение или увеличение стандартного ареала исследования) и координации движения, изменение походки (например, переваливающаяся, атаксия), позы (например, отклонение назад) и реактивности при манипуляциях или других внешних стимулах, а также наличие клонических или тонических движений, судорог, тремор, стереотипии (например, чрезмерный груминг, необычные движения головой, повторяющиеся круговые движения), необычное поведение (например, кусание или чрезмерное лизание, членовредительство, вокализация, способность пятиться назад) или агрессия.

Признаки проявления токсичности записываются с датой появления признака, временем суток, степени проявления и продолжительности.

В течение всего исследования в день или вблизи дня родов и в ПНД 21 (отлучение) животных взвешивают не реже одного раза в неделю.

При кормлении через желудочный зонд исследуемые спариваемые самки взвешиваются не реже двух раз в неделю. При необходимости дозы корректируются при каждом определении массы тела.

Потребление продуктов питания измеряется еженедельно. Расход воды еженедельно, если введение вещества осуществляется через питьевую воду.

4.4.2. Наблюдение за потомством.

Для выявления признаков токсичности, заболеваемости и смертности все потомство ежедневно обследуется.

В период введения вещества проводятся подробные клинические наблюдения потомства.

Потомство (по крайней мере, один детеныш/пол/помет) должно наблюдаться обученными лаборантами, которые не знают о введении вещества животным, при этом необходимо использовать стандартные процедуры с целью минимизации стресса животных и предвзятости наблюдателей, а также максимизации надежности наблюдателей. Желательно, чтобы наблюдения проводил один и тот же специалист.

Все наблюдения документируются по возможности с величиной наблюдаемого эффекта. Клинические наблюдения включают изменения кожи, меха, глаз, слизистых оболочек, появление выделений и вегетативной активности (например: слезотечение, пилоэрекция, размер зрачка, необычный ритм дыхания и/или дыхание через рот, а также любые необычные признаки мочеиспускания или дефекации).

Регистрируются любые необычные реакции в отношении положения тела, уровня активности (например, уменьшение или увеличение стандартного ареала исследования) и координации движения, изменение походки (например, переваливающаяся, атаксия), позы (например, отклонение назад) и реактивности при манипуляциях или других внешних стимулах, а также наличие клонических или тонических движений, судорог, тремор, стереотипии (например, чрезмерный груминг, необычные движения головой, повторяющиеся круговые движения), необычное поведение (например: кусание или чрезмерное лизание, членовредительство, вокализация, способность пятиться назад) или агрессия.

Признаки проявления токсичности записываются с датой появления признака, временем суток, степени проявления и продолжительности.

4.4.3. Показатели физического развития.

Показатели изменения развития до отъема (например: разворачивание ушной раковины, открытие глаз, появление резцов) в значительной степени коррелируют с массой тела. Масса тела может быть наилучшим показателем физического развития.

Анализ показателей развития рекомендуется проводить только при наличии доказательств того, что они дадут дополнительную информацию. Сроки оценки этих параметров указаны в таблице.

В зависимости от ожидаемого эффекта (а также от результатов первоначального анализа) возможно добавление дополнительных временных точек или выполнение измерений на других стадиях развития.

При оценке физического развития желательно использовать посткоитальный возраст, вместо постнатального. Если детеныши проходят обследование в день отъема, рекомендуется, чтобы оно осуществлялось до фактического отлучения, чтобы избежать ошибочных выводов, связанных со стрессом отъема. В течение двух дней после отъема не допускается обследование детенышей.

Для живых детенышей определяется количество и пол путем визуального осмотра или измерения аногенитального расстояния. Каждый детеныш в помете взвешивается индивидуально при рождении или вскоре после этого, затем не реже одного раза в неделю в течение периода лактации.

Для оценки полового созревания, возраста, массы тела животного, вагинальной проходимости [22] или препуциального разделения обследуется не меньше одного самца и одной самки из приплода.

4.4.4. Поведенческий онтогенез.

Онтогенез выбранных поведенческих реакций необходимо исследовать, по меньшей мере, на одном детеныше обоего пола из помета в течение периода соответствующего возраста с одним и тем же детенышем во все тестовые сроки для всех поведенческих оценок. Тестовые дни должны быть распределены равномерно в течение этого периода для определения либо нормальных, либо связанных с введением вещества изменений поведенческого онтогенеза. Ниже приведены некоторые примеры поведения, для которых их онтогенез может быть оценен: защитный рефлекс, отрицательный геотаксис и двигательная активность.

4.4.5. Двигательная активность.

Для оценки поведенческого онтогенеза рекомендуется тест двигательной активности. Двигательная активность контролируется в соответствии с руководствами до отъема и в периоды взросления детенышей. Тестовый период должен быть достаточно протяженным, чтобы продемонстрировать привыкание для контрольной группы.

Таблица

Сроки и показатели оценки физического развития и функционально-поведенческие показатели (а)

Возрастные периоды	До отъема (b)	Подростковый возраст (b)	Юношеский возраст (b)
Показатели
Ориентиры физического развития
Масса тела и клинические наблюдения	еженедельно (с)	по крайней мере, раз в две недели	по крайней мере, раз в две недели
Масса мозга	ПНД 22 (d)		при прекращении
Нейропатология	ПНД 22 (d)		при прекращении
Половое созревание	-	по мере необходимости	-
Другие выявленные отклонения (е)	по мере необходимости	-	-
Функционально-поведенческие показатели
Поведенческий онтогенез	По крайней мере, два измерения
Двигательная активность (в том числе, привыкание)	1-3 раза (f)	-	один раз
Моторные и сенсорные функции	-	один раз	один раз
Обучение и память	-	один раз	один раз

a) Эта таблица представляет собой минимальное количество необходимых исследований. В зависимости от ожидаемого эффекта, а также от результатов первоначальных исследований может быть необходимо добавить дополнительные интервалы времени (например, для возрастных животных) или для выполнения исследований на других стадиях развития.

b) Рекомендуется, чтобы детеныши не подвергались обследованию в течение двух дней после отъема. Рекомендуемым возрастом для тестирования подростков по показателям "Обучение и память" является ; моторные и сенсорные функции - . Рекомендуемый возраст для тестирования юношей составляет 60-70 PND.

c) Масса тела должна измеряться, по крайней мере, два раза в неделю, при непосредственном введении вещества детенышам при коррекции доз в период быстрого увеличения веса тела.

d) Масса мозга и нейропатологии могут быть выявлены в более ранние сроки (например, ПНД 11).

e) Другие ориентиры развития в дополнение к массе тела (например, открытия глаз) документируются.

Тест необходимо проводить до отъема в одинаковые сроки для всех животных. Для оценки онтогенеза тестирование проводится достаточно часто во время привыкания три или более раз до и включая день отъема (например, ПНД 13, 17, 21). Тестируют тех же животных и/или того же помета во взрослом возрасте, близком к окончанию изучения (например, ПНД 60-70). При необходимости исследования проводят чаще.

Мониторинг двигательной активности должен осуществляться с помощью автоматизированного устройство записи деятельности, которое способно обнаруживать как ее увеличение, так и уменьшение (т.е. базовая активность, измеренная с помощью устройства, не должна быть настолько низкой, чтобы исключить возможность обнаружения уменьшения, и не такой высокой, чтобы предотвратить обнаружение увеличения активности). Каждое устройство проверяют с помощью стандартных процедур для обеспечения, надежности работы различных устройств в течение определенного срока исследования.

Каждое животное необходимо тестировать по отдельности.

Введение тестируемого вещества не должно приводить к смещению суточных ритмов активности. Следует минимизировать случайные и систематические ошибки, связанные с введением вещества.

Переменными, которые могут влиять на многие поведенческие реакции, включая двигательную активность, являются уровень звукового фона, размер и форма каждой клетки, температура, относительная влажность, освещенность, запахи, использование привычной клетки или новой тестовой клетки и отвлекающие факторы окружающей среды.

4.4.6. Моторные и сенсорные функции.

Моторные и сенсорные функции анализируются не менее одного раза в подростковом периоде и один раз в течение юношеского периода (например, ПНД 60-70).

Необходимо обеспечить адекватное количество проб сенсорных видов чувствительности (например: сомато-сенсорные, вестибулярные) и двигательных функций (например: сила, координация).

Примерами тестов моторных и сенсорных функций являются реакция разгибателя на укол, защитный рефлекс, привыкание к слуховому испугу и приложенный электрический потенциал.

4.4.7. Обучение и память.

Тесты ассоциативного обучения и памяти проводятся после отъема (например, ПНД дня) и молодых животных (PND 60 и старше).

Возможно выбирать тест(ы) для обучения и исследования памяти у сосунков и взрослых крыс. Однако тест(ы) должны удовлетворять двум критериям. Во-первых, обучение следует оценивать либо как изменение нескольких повторяющихся приемов, либо в тестах с использованием одного приема со ссылкой на условие, которое контролирует неассоциативные эффекты обучающего опыта. Во-вторых, тест(ы) должны включать некоторую меру памяти (краткосрочную или долгосрочную) в дополнение к оригинальному обучению (приобретению), но эта мера памяти не может быть документирована в отсутствии величины приобретения, полученной из того же теста.

Если тест(ы) обучения и памяти демонстрируют влияние тестируемого вещества, то возможно использовать дополнительные тесты для исключения альтернативных интерпретаций, основанных на изменениях сенсорной, мотивационной и/или двигательной активности.

В дополнение к указанным выше двум критериям, рекомендуется выбрать тест обучения и памяти, демонстрирующий чувствительность к данному классу соединений, если такая информация имеется в литературе.

При отсутствии такой информации используют тесты, удовлетворяющие вышеупомянутым критериям и пассивное избегание, задержку соответствия позиции для взрослой крысы и для детенышей крыс, выработку обонятельного рефлекса, водный лабиринт Морриса, лабиринт Биля или Цинциннати, радиальный рычажный лабиринт, Т-образный лабиринт, а также приобретение и сохранение контролируемого поведения. Дополнительные тесты описаны в литературе для сосунков и взрослых крыс.

4.4.8. Некропсия.

Самки-матери подвергаются эвтаназии после отъема потомства.

Нейропатологическая оценка потомства проводится с использованием тканей от животных в ПНД 22 или на более раннем этапе времени между ПНД 11 и ПНД 22, а также как при окончании исследования.

Для потомства, подвергнутого эвтаназии, в течение ПНД 22 оценивают ткани мозга. У животных при окончании эксперимента оценивают ткани центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС).

Ткани от экспериментальных животных ПНД 22 или в более ранние сроки фиксируются путем погружения либо перфузии. Ткани от экспериментальных животных при окончании эксперимента фиксируются перфузией.

Все аспекты подготовки образцов тканей животных при перфузии - секция образцов ткани, обработка ткани и окрашивание слайдов - выполняются таким образом, чтобы каждая партия содержала репрезентативную выборку из каждой дозовой группы.

Дополнительные указания по нейропатологии можно найти в Руководящем документе N 20.

4.4.9. Подготовка образцов тканей.

Все грубые нарушения, обнаруженные во время вскрытия, документируются.

Образцы тканей берут от всех основных отделов нервной системы и сохраняют в соответствующем фиксаторе, обрабатывают в соответствии с опубликованными стандартными гистологическими документами.

Заливка парафином является приемлемой для тканей ЦНС и ПНС, однако использование осмия после фиксации вместе с эпоксидной заливкой может быть целесообразным, если требуется более высокая степень разрешения (например, для периферических нервов, когда подозревается периферическая нейропатия и/или для морфологического анализа периферических нервов).

Мозговая ткань, отобранная для морфологического анализа, фиксируется в соответствующих средах для всех уровней доз и в те же сроки во избежание искусственной усадки, которая может быть связана с длительным хранением срезов в фиксаторе.

4.4.10. Нейропатологические исследования.

Для оценки нейротоксичности проводят следующие исследования:

a) выявление отделов нервной системы, демонстрирующих нейропатологические изменения;

b) идентификация типов нейропатологических изменений возникших в результате воздействия тестируемого вещества;

c) определение диапазона тяжести нейропатологических изменений.

Для доказательства нейропатологических нарушений полученные гистологические срезы образцов тканей исследуются микроскопически квалифицированным специалистом.

Всем нейропатологическим нарушениям присваивается степень тяжести.

Окрашивание гематоксилином и эозином достаточно для оценки срезов головного мозга животных в ПНД 22 или ранее. Для образцов тканей ЦНС и ПНС животных, полученных в конце исследования, рекомендуется окрашивание миелина (например, в luxol fast blue или фиолетовом крезоловом) и окрашивание серебром (например, Bielschowsky или Bodians окрашивания).

Возможно применение других видов окрашивания для определения и описания конкретных типов изменений (например, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) или лектин, позволяющие гистохимически оценить изменения глии и микроглии, флюорхром (fluoro-jade) для обнаружения некроза или окрашивание серебром, специфичное для дегенерации нервной ткани).

Выполняется количественная морфологическая оценка, так как эти данные играют важную роль в интерпретации различия в массе мозга или морфологии и помогают выявить эффекты, связанные с введением вещества.

Отобранные образцы нервной ткани морфологически оцениваются по линейным или площадным измерения определенных областей мозга.

Линейные или площадные измерения требуют использования гомологичных разделов, тщательно отобранных на основе надежных микроскопических маркеров. Стереометрия может использоваться для определения таких эффектов, как объем или количество клеток для конкретных нейроанатомических областей.

Образцы ткани мозга берутся из всех основных отделов (например, из обонятельных луковиц, коры головного мозга, гиппокампа, базальных ганглий, таламуса, гипоталамуса, среднего мозга (крыши, покрышки и ножек), варолиева моста, продолговатого мозга, мозжечка). Важно, чтобы секции мозга у всех животных отбирались в одной плоскости.

При окончании исследования у взрослых особей, отбираются репрезентативные срезы спинного мозга и ПНС. Области исследования включают: глаз со зрительным нервом и сетчаткой, спинной мозг шейного и поясничного отделов, дорсальный и вентральный корешки нерва, проксимальный седалищный нерв, проксимальный большеберцовый нерв (в коленном суставе) и ветви большеберцового нерва икроножной мышцы. Секции спинного мозга и периферических отделов НС должны включать и поперечные, и продольные срезы.

Нейропатологическая оценка включает в себя изучение наличия признаков развития поражения нервной системы в дополнение к клеточным нарушениям (например, нейронная вакуолизация, дегенерация, некроз) и изменениям тканей (например, глиоз, лейкоцитарная инфильтрация, кистозные образования). Важно различать эффекты, связанные с введением вещества, от изменений, связанных с эвтаназией. Примеры значимых изменений, характерных для развития повреждений, включают, но не ограничиваются следующими показателями:

- изменения в размере или форме обонятельной луковицы, головного мозга или мозжечка;

- изменения относительных размеров различных отделов мозга, включая уменьшение или увеличение размера отделов в результате утраты или сохранения обычно недолговечных популяций клеток или axonal projections (например, внешний зародышевый слой мозжечка, мозолистое тело);

- изменения в пролиферации, миграции и дифференциации, о чем свидетельствуют участки чрезмерного апоптоза или некроза, кластеры или разбросанные популяции эктопичных, дезориентированных или неправильной формы нейронов, или изменения относительных размеров различных слоев корковых структур;

- изменения в структуре миелинизации, в том числе общего снижения размера или изменения окрашивания миелиновых структур;

- наличие гидроцефалии, в частности расширение желудочков, стеноз водопровода мозга и истончение больших полушарий.

4.4.11. Анализ зависимости доза-ответ при нейропатологических изменениях.

Рекомендуется следующая поэтапная процедура для качественного и количественного нейропатологического анализа.

Во-первых, образцы из групп с высокой дозой сравниваются с данными контрольной группы. Если никаких доказательств нейропатологических изменений у животных в группе с высокой дозой не обнаружено, то дальнейший анализ не требуется. Если доказательства нейропатологических изменений находятся в группе с высокой дозой, то исследуются животные из групп со средней и низкой дозами.

Если группа с высокой дозой перестает существовать в связи со смертью животных или другой смешанной токсичностью, то группы с высокой и промежуточной дозой должны быть исследованы на наличие нейропатологических изменений.

В группах с низкими дозами, нейропатологический анализ следует проводить, если имеется нейротоксичность.

Если любые, связанные с введением вещества, нейропатологические изменения выявлены в качественном или количественном анализе, то дозо-зависимые нарушения, частота и степень тяжести поражений или морфологических изменений должны быть определены на основе оценки всех животных из всего дозовых групп. Все отделы мозга, в которых обнаружено наличие каких-либо нейропатологических изменений, включаются в анализ.

Характеристики, используемые для определения каждой степени тяжести для любого типа поражения, описываются с указанием специфических особенностей дифференциации каждого типа. Частота и степень тяжести каждого типа поражения описываются, и выполняется статистический анализ для оценки характера зависимости доза-эффект. Рекомендуется использование кодированных образцов.

5. Данные и отчетность

5.1. Данные

Данные представляются в отдельности и обобщенно в табличной форме с указанием для каждой тестируемой группы типов изменений и количества самок-матерей, потомства по полу и отображением каждого типа изменений в пометах.

При прямом постнатальном воздействии на потомство необходимо представить также способ, продолжительность и период воздействия.

5.2. Оценка результатов

Исследования нейротоксичности в процессе онтогенеза предоставят информацию о последствиях многократного воздействия вещества во время внутриутробного и раннего постнатального развития. Поскольку акцент делается как на общую токсичность, так и на конечные показатели нейротоксичности, то результаты исследования позволят разграничить нейропатологические явления, происходящие в отсутствии общей материнской токсичности и проявляющиеся только на уровнях, которые также являются токсичными для материнских животных.

Из-за сложной взаимосвязи между схемой исследования, статистическим анализом и биологическим значением результатов, адекватная интерпретация данных по развитию нейротоксичности должна включать в себя экспертную оценку.

При интерпретации результатов тестирования следует основываться на оценке всей совокупности представленных доказательств. Следует обсудить закономерности поведенческих или морфологических результатов, если они имеют место, а также доказательство зависимости доза-эффект.

Данные всех исследований, связанные с оценкой влияния на развитие нейротоксичности, включая медицинские эпидемиологические исследования или клинические случаи, результаты экспериментальных исследований на животных (например, токсико-кинетические характеристики, информацию по структурной активности химического соединения, данные других исследований токсичности), включаются в отчет, в котором также приводится анализ соотношения между дозами тестируемого вещества и наличием или отсутствием его влияния, а также степень любого нейротоксического эффекта для каждого пола.

Оценка результатов должна включать обсуждение как биологических, так и статистических значений. Статистический анализ следует рассматривать как инструмент, который направляет, но не определяет интерпретацию данных. Отсутствие статистической значимости не должно быть единственным обоснованием для заключения отсутствия соответствующего эффекта тестируемого вещества, равно как статистическая значимость не должна быть единственным обоснованием для заключения, связанного с эффектом тестируемого вещества.

Чтобы защититься от возможного ошибочно-отрицательного результата и трудностей, присущих "доказательству отрицательного", имеющиеся позитивные и исторические контрольные данные должны быть обсуждены, особенно когда отсутствуют эффекты, связанные с введением тестируемого вещества.

Вероятность ошибочных результатов исследования должна обсуждаться в свете общей статистической оценки полученных данных.

Анализ должен включать соотношения, если таковые имеются, между наблюдаемыми нейропатологическими и поведенческими изменениями.

Все результаты должны быть проанализированы с использованием статистических моделей, соответствующих схеме проведения эксперимента.

Выбор того или иного параметрического или непараметрического метода анализа должен быть обоснован с учетом таких факторов, как природа данных (трансформированных или нет) и их распределение, следует также учитывать относительную устойчивость выбранного статистического анализа. При выборе метода статистического анализа и схемы исследования необходимо руководствоваться тем, чтобы минимизировать ошибки Типа I (ошибочный результат исследования) и Типа II (ложноотрицательный результат исследования).

При проведении исследований с использованием повторно родящих видов, в которых повторно рожденные детеныши из помета подвергаются исследованию, необходимо включать помет в статистическую модель для защиты от завышенных величин ошибок Типа I. При этом статистической единицей измерения должен быть помет, а не детеныш.

Схемы экспериментов разрабатываются таким образом, чтобы пометы не рассматривались в качестве независимых результатов наблюдений.

Любой конечный результат, неоднократно измеренный в этой же схеме эксперимента, должен быть проанализирован с использованием статистических моделей, которые отвечают за зависимость этих измерений

5.3. Отчет об исследовании

Протокол испытаний должен включать следующую информацию:

Исследуемое вещество:

- физическая природа и, в случае необходимости, физико-химические свойства;

- идентификационные данные, в том числе источник получения;

- чистота препарата, а также известные и/или ожидаемые примеси.

Растворитель (при необходимости):

- обоснование выбора растворителя, если это не вода или физиологический раствор.

Подопытные животные:

- вид и используемая линия, и обоснование, если кроме крыс используются другие виды животных;

- поставщик подопытных животных;

- количество, возраст при начале эксперимента, пол животных;

- источник, условия содержания, питание, вода и т.д.;

- индивидуальный вес животных в начале теста.

Условия испытаний:

- обоснование выбора уровня доз;

- обоснование способа введения и период времени введения вещества;

- специфические условия введения доз вещества, включая подробную информацию о растворителе, объеме и физической форме вводимого вещества;

- полная формула исследуемого вещества, способ подготовки для введения в пищу, расчетные концентрации, стабильность и гомогенность препарата;

- метод, используемый для уникальной идентификации спариваемых самок и потомства;

- подробное описание процедур(ы) рандомизации, используемой для обозначения групп тестируемых спариваемых самок, выбор детенышей для отбора и определение детенышей для опытных групп;

- подробная информация о введении исследуемого вещества;

- преобразование из пищевого рациона, питьевой воды или при ингаляционном введении концентрации тестируемого вещества (ррm) в фактическую дозу (мг/кг массы тела/день), если это применимо;

- условия внешней среды;

- подробная информация о пищевом рационе и качестве воды (например, водопроводная из крана, дистиллированная);

- даты начала и окончания исследования.

Наблюдения и процедура исследований:

- подробное описание процедур, используемых для стандартизации наблюдений и манипуляций, а также для оперативного определения подсчета результатов;

- список всех методов исследования и обоснование их использования;

- подробная информация о применяемых поведенческо-функциональных, патологических, нейрохимических и электрофизиологических процедурах, в том числе информация и детали автоматизированных устройств;

- процедуры калибровки и обеспечения стандартизации устройств и формирования исследуемых групп для процедур тестирования;

- краткое обоснование объяснений любых решений, включающих профессиональное суждение.

Результаты (индивидуальные и суммарные, включая средние значения и дисперсии в случае необходимости):

- количество животных в начале и в конце исследования;

- количество животных и пометов, используемых для каждого метода испытаний;

- идентификационный номер каждого животного и помета, из которого он получен;

- размер помета, средний вес при рождении и пол детенышей;

- масса тела и данные по изменению массы тела, в том числе конечные массы тела спариваемых самок и потомства;

- данные о потреблении продуктов питания и воды, в случае необходимости (например, если вводят химические вещества с помощью воды);

- результаты по влиянию токсичности на пол и уровень дозы, включая признаки токсичности или смертности, в том числе время и причины смерти, если это необходимо;

- природа, тяжесть, продолжительность, день начала, время суток и дальнейший ход подробных клинических наблюдений;

- балл по каждому показателю развития (вес, половое созревание и поведенческий онтогенез) на каждом этапе наблюдения;

- подробное описание всех поведенческих, функциональных, невропатологических, нейрохимических, электрофизиологических результатов по полу, в том числе и увеличение, и уменьшение по сравнению с контролем;

- результаты вскрытия;

- масса мозга;

- любые диагнозы, полученные по неврологическим симптомам и поражениям, в том числе природные заболевания или состояния;

- графическое изображение сделанных выводов;

- маломощные изображения для оценки гомологии участков, используемых для морфометрии;

- данные по адсорбции и метаболизму, включая дополнительные результаты отдельного токсико-кинетического исследования, если таковые имеются;

- статистическая обработка результатов, в том числе статистических моделей, используемых для анализа данных и результатов, независимо от того, были ли они существенными или нет;

- список исследовательского персонала, в том числе его профессиональная подготовка.

Обсуждение результатов:

- информация по наличию зависимости доза-эффект по полу и группе;

- соотношение любых других токсических эффектов с выводом о нейротоксическом потенциале химического исследования по полу и группе;

- влияние любой токсико-кинетической информации на выводы;

- подобие эффектов с любым из известных нейротоксикантов;

- данные, подтверждающие надежность и чувствительность метода испытания (т.е. положительные и исторические контрольные данные);

- отношения любые, если имеются между нейропатологическими и функциональными эффектами;

- NOAEL или стандартная доза для спариваемых самок и потомства по полу и группе.

Выводы:

- обсуждение интерпретации всех данных на основе полученных результатов, в том числе заключение о том, является ли химическое соединение причиной развития нейротоксичности и NOAEL.

______________________________

* Для этого примера - пометы отсеиваются до 4 самцов + 4 самок, детеныши-самцы пронумерованы от 1 до 4, детеныши-самки - с 5 по 8.

** Разные детеныши используются для когнитивных тестов в ПНД 23 и юноши (например, четные/нечетные пометы из общего количества 20).