Приложение 6.7.11. Испытания по оценке канцерогенной активности

Приложение 6.7.11

Испытания по оценке канцерогенной активности

Идентичен международному документу OECD TG N 451 "Carcinogenicity Studies" (ОЭСР Руководство N 451 "Испытания по оценке канцерогенной активности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования разработан с целью исследований канцерогенности и сосредоточен на внутрижелудочном воздействии, наиболее широко используемом в исследовании канцерогенности. В то же время исследования канцерогенности с применением дермального и ингаляционного путей воздействия также могут быть необходимы при оценке риска для здоровья людей и/или для определения нормативов. Эти пути воздействия связаны со значительными техническими сложностями. Такие исследования следует планировать для каждого отдельного случая, оценка и исследования канцерогенности при пероральном воздействии может быть основой протокола при ингаляционном и/или дермальном исследовании с учетом рекомендаций по введению вещества, клиническим и патологическим параметрам и т.д.

1.2. При оценке и исследовании потенциальной канцерогенности химического вещества до проведения исследования должна быть изучена вся имеющаяся информация об испытуемом веществе с тем, чтобы разработать наиболее эффективное испытание для исследования канцерогенности и минимизировать использование животных. Информация, которая может помочь при планировании исследования, включает идентификацию, химическую структуру и физико-химические свойства испытуемого вещества, любую информацию о механизме действия, результаты испытаний токсичности in vivo и in vitro, включая испытания на генотоксичность, предполагаемые виды применения и возможные воздействия на людей, имеющиеся данные о зависимости структура-активность (модели (Q)SAR), мутагенность/генотоксичность, канцерогенность и другие токсикологические данные по структурно близким веществам, доступные токсикокинетические данные (по кинетике разовой и повторной доз, при наличии) и данные, полученные в других исследованиях повторных воздействий. Оценку канцерогенности следует проводить после получения первичной информации о токсичности в 28-дневных и 90-дневных испытаниях повторной дозы. Полезную информацию могут также дать краткосрочные испытания по изучению инициирующей и промотирующей активности. Поэтапный подход к исследованию канцерогенности должен рассматриваться как часть общей оценки потенциального негативного воздействия отдельных химических веществ на здоровье человека.

1.3. При проведении исследований канцерогенности всегда следует руководствоваться принципами и положениями, изложенными в ОЭСР N 19 [45] по признанию, оценке и использованию клинических показателей, характерных для организма человека, в исследованиях безопасности веществ на лабораторных животных.

1.4. Стратегия выбора дозы зависит от целей и задач исследования. При выборе соответствующих уровней доз должен быть достигнут баланс между выявлением опасности, скринингом, с одной стороны, и характеристиками воздействия низких доз и их значимостью, с другой.

1.5. В целях снижения количества используемых животных следует рассматривать возможность проведения комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности, а не проводить отдельные исследования хронической токсичности и канцерогенности. Необходимо с большим вниманием относиться к принципам отбора доз для выполнения комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Надо иметь в виду, что в соответствии с нормативными требованиями может потребоваться также проведение раздельных исследований.

2. Общие положения

2.1. Большинство исследований канцерогенности выполняют на различных видах грызунов, и поэтому данные указания по испытаниям предназначены в первую очередь для исследований на этих видах животных. Если потребуется провести такие исследования на негрызунах, то можно использовать описанные в данном стандарте принципы и процедуры в соответствующих модификациях, в соответствии с Руководящим документом ОЭСР по разработке и проведению исследования хронической токсичности и канцерогенности.

2.2. Тремя основными путями введения вещества являются внутрижелудочный, дермальный и ингаляционный. Выбор каждого пути поступления вещества зависит от физических и химических характеристик испытуемого вещества и преимущественного пути воздействия на людей.

2.3. Задачами исследований канцерогенности являются:

- выявление канцерогенных свойств химического вещества, определяющихся как увеличение количества новообразований, рост доли злокачественных новообразований или сокращение времени появления опухолей по сравнению с контрольными группами;

- выявление органа(ов)-мишени(ей) воздействия канцерогена;

- определение зависимости доза-эффект канцерогена;

- определение уровня недействующей дозы (NOAEL) или исходной точки для установления минимальной дозы (Benchmark Dose-BMD);

- экстраполяция данных по канцерогенным эффектам на уровень воздействия низких доз на людей;

- предоставление данных для проверки гипотез о возможных механизмах воздействия.

3. Принцип метода испытания

3.1. Исследуемое вещество вводят нескольким группам экспериментальных животных ежедневно семь дней в неделю, одна доза на группу на протяжении большей части их жизни, как правило, перорально. Ингаляционный и накожный путь поступления также может применяться. Наблюдения за экспериментальными животными проводят ежедневно во время и после экспозиции с целью определения признаков токсичности, и особенно развития новообразований. Животных, которые погибают или их умерщвляют в ходе испытания, подвергают некропсии. После завершения эксперимента выживших животных умерщвляют и подвергают некропсии.

4. Описание метода испытания

Животных не менее 7 дней до начала испытания содержат в клетках для адаптации к лабораторным условиям со специальным режимом питания. Перед испытанием здоровых молодых особей распределяют и формируют из них контрольную и экспериментальные группы.

4.1. Экспериментальные животные

4.1.1. На основании данных ранее проведенных исследований допускается использование разных видов животных (грызунов или негрызунов). Использование видов негрызунов может быть допустимо, если имеющиеся данные позволяют предположить, что такие виды являются более подходящими для прогнозирования воздействия на здоровье человека. Использование мышей в изучении канцерогенности может быть ограничено, хотя в ряде программ по тестированию все еще требуется использование мышей. Дополнительная информация о выборе вида и линии тестовых животных представлена в руководстве ОЭСР N 116 по разработке и проведению исследований по изучению хронической токсичности и канцерогенности. Крысы и мыши являются наиболее предпочтительными экспериментальными моделями в силу относительно короткой продолжительности их жизни, широкого применения в фармакологических и токсикологических исследованиях, восприимчивости к опухолевой индукции и наличия достаточно хорошо изученных линий с большим количеством информации о физиологии и патологии данных видов животных. Используют молодых здоровых животных стандартных лабораторных линий. Желательно проводить исследования канцерогенности на животных той же линии и из того же источника, которые использовались в предварительных исследованиях токсичности меньшей продолжительности. Если известно, что при использовании животных данной линии и источника наблюдаются проблемы в достижении общепринятого критерия в 50% выживаемости в течение 24 месяцев, то следует рассмотреть возможность использования линии, обладающей приемлемой для долгосрочного исследования выживаемостью. Женские особи должны быть нерожавшими и небеременными. Введение дозы должно быть начато как можно скорее после отлучения от материнской груди.

4.1.2. Животные могут быть размещены в клетках индивидуально или малыми группами одного пола; индивидуальное размещение следует рассматривать только в случае, если это научно обосновано. Клетки должны быть устроены таким образом, чтобы возможные эффекты, связанные с размещением клетки, были минимальны. Температура в экспериментальном помещении для животных должна составлять . Несмотря на то что относительная влажность должна быть, как минимум, 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки комнаты, оптимальное значение составляет 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна соответствовать всем требованиям питания для тестовых видов, и содержание примесей, в том числе: остаточное содержание пестицидов, стойких органических загрязнителей, фитоэстрогенов, тяжелых металлов и микотоксинов, которые могут повлиять на результаты испытаний, в пище должно быть как можно ниже. Необходимо периодически проводить анализ содержания примесей в пище, особенно в начале испытания и при наличии изменений в используемой партии. Данные таких анализов должны быть включены в окончательный отчет. Также должны быть представлены аналитические данные для питьевой воды.

4.1.3. Следует использовать здоровых животных, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях в течение не менее 7 дней и не участвовали в предыдущих тестовых процедурах. При использовании грызунов, воздействие фактора на животных должно начинаться как можно скорее после прекращения грудного вскармливания и адаптации, предпочтительно не позднее достижения животными возраста восьми недель. Животных необходимо охарактеризовать по виду, линии, источнику, полу, массе тела и возрасту. В начале испытания отклонения в массе тела животных должны быть минимальными и не превышать от средней массы всех животных, используемых в испытании, для каждого пола отдельно. Животные должны быть случайным образом распределены в контрольную и экспериментальную группы. После распределения в группах каждого пола не должно быть существенных различий в средней массе тела животных. Каждому животному должен быть присвоен индивидуальный номер. Каждое животное должно иметь постоянную метку с данным номером (например, татуировку, микрочип или другой подходящий знак).

4.2. Количество и пол животных

4.2.1. Для грызунов в каждой дозовой и контрольной группе используется не менее 100 животных (50 самок и 50 самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если предполагается умерщвление животных на определенных этапах испытания, их количество должно быть увеличено на количество животных, которое планируется умертвить до окончания срока испытания.

4.3. Уровень доз и частота экспозиции

4.3.1. Используется не менее трех уровней доз и контрольная группа. В общем случае уровни доз выбирают на основании результатов краткосрочных испытаний повторных доз или испытаний по выбору диапазона доз, при этом необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные об исследуемом веществе или структурно близких веществах.

4.3.2. При отсутствии ограничений, вызванных физико-химическими свойствами и биологическим действием исследуемого вещества, должна выбираться максимальная доза, позволяющая определить основные органы-мишени и токсические эффекты, но не вызывающая при этом страданий, значительной токсичности, заболеваемости или смерти животных.

4.3.3. Однако в зависимости от цели исследования в качестве максимальной может быть выбрана доза ниже, чем доза, вызывающая признаки токсичности, например, если такая доза вызывает негативное воздействие такого рода, тем не менее незначительно влияет на продолжительность жизни или изменение массы тела.

4.3.4. Уровни доз и интервал между ними могут быть выбраны таким образом, чтобы можно было установить зависимость доза-эффект. Это зависит от механизма действия исследуемого вещества, недействующего уровня воздействия (NOAEL) или других ожидаемых результатов, например BMD при минимальном уровне дозы. Факторы, которые следует учитывать при установлении минимальных доз, включают ожидаемый наклон кривой доза-эффект, дозы, при которых могут произойти важные изменения в метаболизме или механизме токсического действия, для которого ожидается наличие порогового уровня или появление отправной точки для экстраполяции на низких дозах.

4.3.5. При введении максимальной дозы у животных проявляются невыраженные признаки токсичности, такие как небольшое замедление набора массы (менее 10%) без существенного влияния на продолжительность жизни по причине каких-либо эффектов, кроме новообразований. Самый низкий уровень дозы в целом не должен быть меньше 10% от самой высокой дозы - и не должен влиять на нормальный рост, развитие и срок жизни животного или вызывать какие-либо признаки токсичности. Средний уровень доз(ы) является промежуточным между высоким и низким уровнями доз.

4.3.6. Выбранный интервал уровней доз будет зависеть от характеристик исследуемого вещества и не может быть описан в настоящем руководстве, но часто наиболее оптимальными являются двух-, четырехкратные интервалы для установления убывающей последовательности доз. Дополнительное использование четвертой тестируемой группы часто более предпочтительно, чем использование очень больших интервалов (например, более 6-10-кратных) между дозами. Дальнейшие рекомендации по выбору доз и интервалов представлены в руководстве ОЭСР по разработке и проведению исследований по изучению хронической токсичности и канцерогенности, но, как правило, следует избегать использования более чем 10-кратных интервалов. Если такие интервалы используются, это должно быть обосновано.

4.3.7. Факторы, которые следует учитывать при выборе доз, включают:

- известные или вероятные нелинейности или точки перегиба на кривой доза-эффект;

- фармакокинетику и диапазоны доз, в которых происходит или не происходит метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между внешней и внутренней дозами;

- предшествующие поражения, маркеры воздействия или показатели протекания соответствующих ключевых биологических процессов;

- основные (или подозреваемые) аспекты механизма действия, такие как дозы, при которых появляется цитотоксичность, наблюдается повышение гормонального фона, нарушение гомеостатических механизмов и т.д.;

- отрезки кривой доза-эффект, для которых требуется особенно надежная оценка, например, вблизи ожидаемой контрольной дозы (BMD) или порога воздействия;

- ожидаемые уровни воздействия на человека.

4.3.8. Как правило, животных подвергают воздействию вещества ежедневно. Если вещество вводится с питьевой водой или с пищей, вода и пища должны быть постоянно доступны.

4.4. Контроль

4.4.1. Необходимо использовать контрольную группу (группы параллельного контроля), схожую с экспериментальной, но не подвергающейся воздействию исследуемым веществом.

4.4.2. При особых обстоятельствах, как, например, ингаляционных испытаниях с использованием аэрозолей или исследованиях эмульгирующих агентов неописанного биологического воздействия, вводимых перорально, также необходимо использовать группу параллельного контроля, в которой животным вводится неактивное вещество.

4.4.3. С животными в контрольной группе следует обращаться также как с животными из тестовых групп. При использовании растворителя контрольная группа должна получать растворитель в максимальном объеме, используемом для экспериментальных групп. Если исследуемое вещество вводят в рацион, и это приводит к снижению потребления пищи, используется дополнительная контрольная группа для оценки последствий ограничений в кормлении.

4.5. Способы введения вещества

4.5.1. Есть три основных способа введения вещества - пероральный, дермальный и ингаляционный. Выбор способа введения зависит от физико-химических свойств испытуемого вещества и от предполагаемого способа воздействия при использовании человеком.

Введение вещества перорально

4.5.2. Как правило, исследуемое вещество вводят перорально, через желудочный зонд или с пищей, или питьевой водой. Дополнительная информация о способах и методах введения исследуемого вещества представлена в руководстве ОЭСР N 116. Способ введения исследуемого вещества зависит от цели исследования, физико-химических свойств исследуемого вещества и его биологической доступности. Из соображений заботы о благополучии животных введение через желудочный зонд, как правило, выбирают только для тех веществ, для которых данный метод введения отражает потенциальное воздействие на человека (например, для фармацевтических препаратов). Для пищевых или природных химических веществ, включая пестициды, введение должно осуществляться с пищей и питьевой водой.

4.5.3. В случае необходимости исследуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем растворителе. При выборе растворителя и других добавок необходимо учитывать следующие характеристики: влияние на всасывание, распределение, метаболизм или удержание исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсичные свойства; воздействие на потребление пищи или воды или состояние питания животных. Рекомендуется, по возможности, в первую очередь рассматривать использование водных растворов/суспензий, затем растворов/эмульсий в масле (например, кукурузном масле), затем возможных растворов в других растворителях. Для растворителей, за исключением воды, должны быть известны их токсичные свойства. Должна быть определена стабильность исследуемого вещества в условиях введения (например, диеты), а также аналитически подтверждена однородность каждой партии раствора дозирования или пищи (воды), содержащей вещество (при необходимости).

4.5.4. Для веществ, поступающих с пищей или питьевой водой, важно обеспечить условия, при которых используемое количество исследуемого вещества не должно нарушать нормальное питание или водный баланс. В испытаниях хронической токсичности при поступлении вещества с пищей концентрация химического вещества в пище не должна превышать верхнего предела 5% от общего количества пищи (REF), если диета не была соответствующим образом скорректирована для удовлетворения пищевых потребностей животных. Когда исследуемое вещество вводят с пищей, можно использовать либо постоянную пищевую концентрацию (мг/кг или ррm) или постоянный уровень дозы по отношению к массе тела животного; альтернативные варианты должны быть указаны.

4.5.5. Животным вводят исследуемое вещество ежедневно семь дней в неделю, обычно в течение 18 месяцев для мышей и хомяков и 24 месяцев для крыс. Любой другой режим дозирования, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован.

4.5.6. Когда исследуемое вещество вводят через желудочный зонд, это должно осуществляться с помощью желудочной трубки или подходящей интубационной канюли, в одно и то же время каждый день. Обычно разовая доза вводится один раз в день. Если, например, исследуемое вещество является местным раздражителем, для поддержания ежедневного уровня дозы вещество может вводиться в виде разделенной дозы (например, два раза в день). Максимальный объем жидкости, которая может быть введена за один раз, зависит от размера экспериментальных животных. Обычно объем должен быть настолько низким, насколько это практически возможно, и не должен превышать 1 мл/100 г массы тела, за исключением случаев водных растворов, когда можно использовать 2 мл/100 г массы тела. Изменения тестируемого объема дозы должны быть минимальны за счет регулирования концентраций для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз. Потенциально едкие или раздражающие вещества являются исключением, они должны быть разбавлены так, чтобы избежать появления тяжелых местных эффектов. Величина рН растворов для дозирования, как правило, должна быть в диапазоне от 4 до 9. За исключением раздражающих или едких веществ, воздействие которых, как правило, усугубляется с повышением концентрации, изменчивость в тестовом объеме должна быть минимизирована за счет регулирования концентрации для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз.

Введение вещества через козну

4.5.7. Дермальная экспозиция путем нанесения вещества на кожу может быть выбрана как модель основного способа экспозиции вещества на человека, а также в качестве модели-системы для инициации кожных поражений. Животные подвергаются воздействию вещества не менее 6 часов, 7 дней в неделю в течение 24 месяцев.

Введение вещества ингаляционно

4.5.8. Ингаляционные испытания сопровождаются большими сложностями, нежели испытания при любом другом способе введения испытуемого вещества. Необходимо также отметить, что в особых случаях равнозначной альтернативой этому способу введения вещества может стать внутритрахеальное вливание.

4.5.9. Долгосрочные экспозиции, как правило, планируют так, чтобы результаты испытания можно было перенести на человека. При долгосрочных экспозициях вещество вводят подопытным животным ежедневно на протяжении шести часов после уравновешивания концентрации в камере, или на протяжении пяти дней в неделю (прерывистая экспозиция), или с учетом возможного воздействия окружающей среды, от 22 до 24 часов в сутки на протяжении семи дней в неделю (непрерывная экспозиция), где около часа в день (в одно и то же время) отводят на кормление животных и поддержание условий испытания в камере. В обоих случаях на животных воздействуют веществом в фиксированной концентрации. Основное различие между прерывистой и непрерывной экспозицией состоит в том, что в первом случае животное может восстанавливаться после ежедневного воздействия вещества в течение 17-18 часов, в выходные дни этот период увеличивается.

4.5.10. Выбор между прерывистой и непрерывной экспозицией зависит от целей исследования и от воздействия на человека с применением плацебо. Но в любом случае необходимо будет учесть некоторые технические сложности. Например, для моделирования среды обитания преимущества непрерывной экспозиции могут отступать перед необходимостью в питье и пище во время экспозиции, а также потребностью в более многосоставных (и надежных) аэрозолях и газах в контрольно-управляющей технике.

4.6. Экспериментальные камеры

4.6.1. Испытание проводят в ингаляционных камерах, конструкция которых позволяет обеспечить активную циркуляцию воздушных потоков: не менее 12 воздухообменов в час, благодаря чему вещество в воздухе распределяется равномерно и сохраняется нужный уровень кислорода. Контрольная и экспериментальная камеры должны иметь одинаковую конструкцию и дизайн, чтобы обеспечить равные условия экспозиции. Незначительное отрицательное давление внутри камеры поддерживают в основном в целях предотвратить утечку вещества. Камеры должны быть устроены таким образом, чтобы минимизировать скопление животных. Общим правилом является содержание испытуемого вещества в камере не более 5% от всего объема, что позволяет гарантировать устойчивость среды в камере.

4.6.2. Параметры, которые подлежат контролю и соблюдению при проведении испытания:

- воздушный поток: интенсивность потоков воздуха необходимо постоянно отслеживать;

- концентрация: разброс концентрации испытуемого вещества в период ежедневной экспозиции не должен превышать от основного значения. На протяжении всего исследования концентрация каждый день должна быть по мере возможности стабильной;

- температура и влажность: для кроликов температура воздуха - , влажность колеблется в пределах 30-70%, за исключением случаев, когда для распределения испытуемого вещества в воздухе камеры используется вода. За температурой и уровнем влажности необходимо постоянно следить;

- измерение размера частиц: необходимо определить распределение размера частиц в воздухе камеры, где используются жидкие или твердые аэрозоли. Частицы аэрозолей должны соответствовать размеру, пригодному для дыхания подопытных животных. Образцы воздуха в камерах должны быть получены из зоны вдыхания и должны отображать распределение вдыхаемых животными частиц. Также они должны давать информацию о нахождении частиц аэрозолей во взвешенном состоянии, на основании гравиметрических данных, даже когда большая часть аэрозоля не пригодна для вдыхания. Анализ размера частиц следует проводить регулярно в процессе работы системы генерации, что позволит удостовериться в постоянной стабильности аэрозоля, и затем по мере необходимости, для того чтобы подтвердить состав и распределение частиц, воздействию которых подвергаются животные.

4.7. Продолжительность испытания

4.7.1. Продолжительность испытания на канцерогенность длится значительную часть жизненного срока подопытного животного. Испытания длятся 18 месяцев для мышей и хомяков и 24 месяца для крыс. Но для определенных линий животных с более долгим сроком жизни и/или с более низкой предрасположенностью к опухолям, испытание составляет 24 месяца для мышей и хомяков и 30 месяцев для крыс. В качестве альтернативы, продление срока испытания допустимо, если количество выживших животных в группе с низким уровнем дозы или в контрольной группе составило 25%. Если по завершении испытания наблюдается видимая разница в реакции между полами, каждый пол должен быть обсужден отдельно. Если от выраженных признаков токсичности погибает только группа с высокой дозой, это не должно послужить причиной для прекращения испытания при условии, что токсические проявления не создают проблем в других группах. Для того чтобы результаты испытания можно было признать отрицательными, не более 10% животных в каждой группе может быть утеряно во время эксперимента по причине аутолиза, каннибализма или неправильного ухода, не менее 50% животных каждой из групп должно выжить: по истечении 18 месяцев для мышей и хомяков, 24 месяцев для крыс.

5. Процедура

5.1. Наблюдение

5.1.1. Всех животных необходимо проверять на заболеваемость и смертность, как правило, в начале и конце каждого дня. Кроме того, животных необходимо проверять, как минимум, один раз в выходные и праздничные дни. Особое внимание следует обратить на развитие опухоли; время начала развития, расположение, размеры, внешний вид и прогрессирование каждой видимой или ощутимой опухоли должны быть зарегистрированы.

5.1.2. Все животные должны быть взвешены в начале испытания, а также по крайней мере раз в неделю в течение первых 13 недель и ежемесячно после этого. Измерения потребления пищи следует проводить, как минимум, еженедельно, в течение первых 13 недель, а затем ежемесячно. Также может быть рассмотрено потребление воды в тех исследованиях, в течение которых потребление воды может изменяться, и его следует оценивать, как минимум, раз в неделю, в течение первых 13 недель, затем ежемесячно, когда вещество вводят с питьевой водой.

5.1.3. Регулярные наблюдения за животными необходимы для того, чтобы убедиться, что животное не выбыло из эксперимента по причине каннибализма, аутоцитолиза тканей или дистопии. Агонизирующие животные удаляются из испытания и подлежат вскрытию.

5.1.4. При ежедневных наблюдениях помимо прочего нужно оценивать изменения в состоянии кожи и волосяного покрова, глаз и слизистых оболочек, также состояние респираторной, кровеносной, автономной и центральной нервной систем, соматомоторной активности и поведения.

5.2. Клинические наблюдения

Гематология

5.2.1. Если наблюдения за животными указывают на ухудшение состояния здоровья животных в ходе испытания, необходимо сделать дифференцированный анализ крови пораженных животных.

5.2.2. У животных берут мазок крови на 12-м, 18-м месяце и перед умерщвлением. Дифференциальный анализ крови выполняется на образцах, забранных у животных в группе с высокой дозой и в контрольной группе. По результатам анализов, в особенности анализов, полученных перед умерщвлением, или данных осмотра патологий, дифференциальный анализ крови может быть сделан у животных с более низким уровнем дозы.

Аутопсия

5.2.3. Все животные в испытании, за исключением индикаторных и других сопутствующих животных, должны быть подвергнуты полной, подробной аутопсии, которая включает в себя тщательное изучение внешней поверхности тела, всех отверстий, черепа, грудной и брюшной полости и их содержимого. Индикаторные животные могут также иногда подвергаться вскрытию в зависимости от задач исследования. Масса органов обычно не является необходимым показателем в испытаниях канцерогенности, так как гериатрические изменения и, на более поздних стадиях, развитие опухолей делают данный показатель бесполезным. Однако масса органов может иметь решающее значение при выполнении оценки на основе доказательств, и особенно для установления механизма действия. Если измерения массы органов являются частью сопутствующих исследований, они должны проводиться не позднее, чем через один год после начала испытания.

5.2.4. Следующие ткани нужно сохранять в наиболее подходящей для фиксации среде для дальнейшего проведения гистопатологической экспертизы: надпочечники, аорта, головной мозг (в том числе участки головного мозга, мозжечок и продолговатый мозг), слепая кишка, шейка матки, толстая кишка, двенадцатиперстная кишка, придатки, глаза (в том числе, сетчатка), [бедренные кости с суставами] желчный пузырь (для всех видов, за исключением крысы), гардерова железа, сердце, подвздошная кишка, тощая кишка, почки, слезная железа (орбитальная), печень, легкие, лимфатические узлы (поверхностные и глубокие), женские молочные железы, пищевод, [обонятельная луковица], яичники, поджелудочная железа, паращитовидные железы, периферические нервы, гипофиз, предстательная железа, [прямая кишка], слюнные железы, семенные пузырьки, скелетные мышцы, кожа, спинной мозг (на трех уровнях: шейном, среднем грудном и поясничном), селезенка, [грудина], желудок (кардиальный отдел желудка, железистый желудок), [зубы], семенник, тимус, щитовидная железа, [язык], трахея, мочевой пузырь, матка (в том числе, шейка матки), [мочеточник], [уретра], влагалище и часть костного мозга и/или свежая аспирация костного мозга. Ткани, указанные в квадратных скобках, являются необязательными. Клинические и другие данные могут указывать на необходимость изучения дополнительных тканей. Кроме того, любые органы, которые предположительно будут органами-мишенями на основании известных свойств исследуемого вещества, должны быть сохранены. В накожных исследованиях кроме органов, указанных в списке, необходимо сохранить и задокументировать кусочки кожи с места нанесения вещества. В ингаляционных исследованиях перечень тканей дыхательных путей должен соответствовать рекомендациям руководства ОЭСР 412. Для других органов/тканей (и в дополнение к специально сохраненным тканям дыхательных путей) перечень органов, приведенных для перорального испытания, должен быть исследован.

5.2.5. Гистопатология:

- проводят полное гистопатологическое исследование органов и тканей животных, павших или умерщвленных в ходе испытания, а также всех животных в контрольной группе и в группе с высоким уровнем дозы;

- все крупные видимые опухоли или повреждения с подозрением на опухоль подлежат микроскопическому изучению во всех группах;- если наблюдают существенные различия между коэффициентом возникновения неопластических поражений в группе с высоким уровнем дозы и контрольной группе, гистопатология этих органов или тканей должна быть оценена у животных в другой группе;

- если выживших животных в группе с высоким уровнем дозы в целом меньше, чем в контрольной группе, то животные в группе со следующим по убыванию уровнем дозы должны быть исследованы полностью;

- если в группе с высоким уровнем дозы наблюдают очевидные признаки токсичности или других эффектов, которые могут вызвать образование неопластических образований, то животные в группе со следующим по убыванию уровнем дозы должны быть исследованы полностью.

5.2.6. Минимальный набор тканей для исследования:

- все ткани животных из групп с высокой дозой и контрольной группы;

- все ткани животных, падших или умерщвленных во время испытания;

- все ткани, демонстрирующие макроскопические аномалии, в том числе опухоли;

- когда в группе с высокой дозой наблюдают гистопатологические изменения, связанные с обработкой, следует исследовать все те же ткани всех животных из всех тестируемых групп;

- должны быть изучены оба парных органа (почки, надпочечники и т.д.).

6. Результаты

6.1. Результаты должны быть представлены индивидуально для каждого животного. Кроме того, все данные должны быть представлены в табличной форме, демонстрирующей для каждой исследуемой группы количество животных в начале испытания, количество животных, найденных мертвыми во время испытания или умерщвленных из гуманных соображений, и время смерти или умерщвления, количество животных с признаками токсичности, описание наблюдаемых признаков токсичности, в том числе время начала, продолжительность и тяжесть любых токсических эффектов, количество животных с поражениями, тип поражений и процент животных с поражениями каждого типа.

6.2. В дополнение к результатам, полученным от параллельной контрольной группы, используемой в испытании, использование исторических контрольных данных может быть ценным для интерпретации результатов исследования, особенно в тех случаях, когда существуют признаки того, что данные параллельного контроля существенно отличаются от последних данных для контрольных животных в аналогичном испытании. Исторические контрольные данные следует использовать только в случае, если параллельные контрольные данные значительно отличаются; приоритетным является использование параллельных контрольных данных. При использовании, исторические контрольные данные должны быть получены в той же лаборатории; штамм, вид и конкретные диапазоны должны быть указаны. Использование исторических контрольных данных должно быть ограничено данными, полученными в течение пяти лет, предшествовавших испытанию.

6.3. При необходимости численные результаты должны быть оценены с помощью соответствующего и общепринятого статистического метода. Статистические методы и данные для анализа должны быть выбраны на этапе планирования испытания. Выбор должен предусматривать возможность корректировки с учетом выживаемости, если это необходимо.

7. Отчет

Отчет о проведении испытания должен содержать следующую информацию:

Исследуемое вещество

- физическая природа, чистота и физико-химические свойства;

- идентификационные данные;

- источник вещества;

- номер партии.

Растворитель (при использовании)

- обоснование выбора растворителя (за исключением воды).

Экспериментальные животные

- вид/линия используемых животных и обоснование выбора;

- количество, возраст и пол животных в начале испытания;

- источник, условия содержания и кормления и пр.;

- индивидуальный вес животных в начале испытания.

Условия испытания

- обоснование выбора пути введения вещества и выбора дозы;

- в случае необходимости статистические методы, используемые для анализа данных;

- подробности подготовки исследуемого вещества/подготовки диеты, полученная концентрация, стабильность и однородность препарата;

- путь введения и подробности введения исследуемого вещества;

- для ингаляционных исследований, поступает ли вещество только через нос или используется все тело;

- фактические дозы (мг/кг массы тела в день), коэффициент перевода концентрации исследуемого вещества в пище/питьевой воде (мг/кг или ррm) в фактическую дозу, при необходимости;

- качество пищи и питьевой воды.

Результаты

Общие

- данные о выживаемости животных;

- масса тела/изменения массы тела;

- потребление пищи и воды, при необходимости;

- данные токсикокинетики, при наличии.

Клинические наблюдения

- признаки токсичности;

- частота и тяжесть любых аномалий;

- природа, тяжесть и продолжительность клинических поражений (обратимых и необратимых).

Данные аутопсии

- масса тела на момент умерщвления;

- массы органов и их соотношения, при необходимости;

- результаты аутопсии, частота и тяжесть аномалий.

Гистопатология

- ненеопластические гистопатологические изменения;

- неопластические гистопатологические образования;

- корреляции между макроскопическими и микроскопическими результатами;

- подробное описание всех соответствующих гистопатологических наблюдений, включая классификацию степени тяжести;

- статистическая обработка результатов, при необходимости.

- случаи образования опухолей.

Статистическая обработка результатов, какие использовались

- масса тела;

- масса органов;

- потребление пищи (воды);

- частота опухолей.

Обсуждение результатов, в том числе:

- обсуждение любых подходов к моделированию;

- зависимость доза-эффект;

- определение BMD (статистически достоверный нижний предел дозы, который предопределяет изменения в ответных реакциях на вредное воздействие, что соответствует ), NOAEL или LOAEL (наименьший уровень воздействия химического вещества, при котором наблюдается вредный эффект);

- данные предыдущих исследований;

- рассмотрение любой информации о поведении животных;

- значимость для человека.

Выводы.