Приложение 6.7.11. Испытания по оценке канцерогенной активности

Приложение 6.7.11

Испытания по оценке канцерогенной активности

Идентичен международному документу OECD TG N 451 "Carcinogenicity Studies" (ОЭСР Руководство N 451 "Испытания по оценке канцерогенной активности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования разработан с целью исследований канцерогенности и сосредоточен на внутрижелудочном воздействии, наиболее широко используемом в исследовании канцерогенности. В то же время исследования канцерогенности с применением дермального и ингаляционного путей воздействия также могут быть необходимы при оценке риска для здоровья людей и/или для определения нормативов. Эти пути воздействия связаны со значительными техническими сложностями. Такие исследования следует планировать для каждого отдельного случая, оценка и исследования канцерогенности при пероральном воздействии может быть основой протокола при ингаляционном и/или дермальном исследовании с учетом рекомендаций по введению вещества, клиническим и патологическим параметрам и т.д.

1.2. При оценке и исследовании потенциальной канцерогенности химического вещества до проведения исследования должна быть изучена вся имеющаяся информация об испытуемом веществе с тем, чтобы разработать наиболее эффективное испытание для исследования канцерогенности и минимизировать использование животных. Информация, которая может помочь при планировании исследования, включает идентификацию, химическую структуру и физико-химические свойства испытуемого вещества, любую информацию о механизме действия, результаты испытаний токсичности in vivo и in vitro, включая испытания на генотоксичность, предполагаемые виды применения и возможные воздействия на людей, имеющиеся данные о зависимости структура-активность (модели (Q)SAR), мутагенность/генотоксичность, канцерогенность и другие токсикологические данные по структурно близким веществам, доступные токсикокинетические данные (по кинетике разовой и повторной доз, при наличии) и данные, полученные в других исследованиях повторных воздействий. Оценку канцерогенности следует проводить после получения первичной информации о токсичности в 28-дневных и 90-дневных испытаниях повторной дозы. Полезную информацию могут также дать краткосрочные испытания по изучению инициирующей и промотирующей активности. Поэтапный подход к исследованию канцерогенности должен рассматриваться как часть общей оценки потенциального негативного воздействия отдельных химических веществ на здоровье человека.

1.3. При проведении исследований канцерогенности всегда следует руководствоваться принципами и положениями, изложенными в ОЭСР N 19 [45] по признанию, оценке и использованию клинических показателей, характерных для организма человека, в исследованиях безопасности веществ на лабораторных животных.

1.4. Стратегия выбора дозы зависит от целей и задач исследования. При выборе соответствующих уровней доз должен быть достигнут баланс между выявлением опасности, скринингом, с одной стороны, и характеристиками воздействия низких доз и их значимостью, с другой.

1.5. В целях снижения количества используемых животных следует рассматривать возможность проведения комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности, а не проводить отдельные исследования хронической токсичности и канцерогенности. Необходимо с большим вниманием относиться к принципам отбора доз для выполнения комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Надо иметь в виду, что в соответствии с нормативными требованиями может потребоваться также проведение раздельных исследований.

2. Общие положения

2.1. Большинство исследований канцерогенности выполняют на различных видах грызунов, и поэтому данные указания по испытаниям предназначены в первую очередь для исследований на этих видах животных. Если потребуется провести такие исследования на негрызунах, то можно использовать описанные в данном стандарте принципы и процедуры в соответствующих модификациях, в соответствии с Руководящим документом ОЭСР по разработке и проведению исследования хронической токсичности и канцерогенности.

2.2. Тремя основными путями введения вещества являются внутрижелудочный, дермальный и ингаляционный. Выбор каждого пути поступления вещества зависит от физических и химических характеристик испытуемого вещества и преимущественного пути воздействия на людей.

2.3. Задачами исследований канцерогенности являются:

- выявление канцерогенных свойств химического вещества, определяющихся как увеличение количества новообразований, рост доли злокачественных новообразований или сокращение времени появления опухолей по сравнению с контрольными группами;

- выявление органа(ов)-мишени(ей) воздействия канцерогена;

- определение зависимости доза-эффект канцерогена;

- определение уровня недействующей дозы (NOAEL) или исходной точки для установления минимальной дозы (Benchmark Dose-BMD);

- экстраполяция данных по канцерогенным эффектам на уровень воздействия низких доз на людей;

- предоставление данных для проверки гипотез о возможных механизмах воздействия.

3. Принцип метода испытания

3.1. Исследуемое вещество вводят нескольким группам экспериментальных животных ежедневно семь дней в неделю, одна доза на группу на протяжении большей части их жизни, как правило, перорально. Ингаляционный и накожный путь поступления также может применяться. Наблюдения за экспериментальными животными проводят ежедневно во время и после экспозиции с целью определения признаков токсичности, и особенно развития новообразований. Животных, которые погибают или их умерщвляют в ходе испытания, подвергают некропсии. После завершения эксперимента выживших животных умерщвляют и подвергают некропсии.

4. Описание метода испытания

Животных не менее 7 дней до начала испытания содержат в клетках для адаптации к лабораторным условиям со специальным режимом питания. Перед испытанием здоровых молодых особей распределяют и формируют из них контрольную и экспериментальные группы.

4.1. Экспериментальные животные

4.1.1. На основании данных ранее проведенных исследований допускается использование разных видов животных (грызунов или негрызунов). Использование видов негрызунов может быть допустимо, если имеющиеся данные позволяют предположить, что такие виды являются более подходящими для прогнозирования воздействия на здоровье человека. Использование мышей в изучении канцерогенности может быть ограничено, хотя в ряде программ по тестированию все еще требуется использование мышей. Дополнительная информация о выборе вида и линии тестовых животных представлена в руководстве ОЭСР N 116 по разработке и проведению исследований по изучению хронической токсичности и канцерогенности. Крысы и мыши являются наиболее предпочтительными экспериментальными моделями в силу относительно короткой продолжительности их жизни, широкого применения в фармакологических и токсикологических исследованиях, восприимчивости к опухолевой индукции и наличия достаточно хорошо изученных линий с большим количеством информации о физиологии и патологии данных видов животных. Используют молодых здоровых животных стандартных лабораторных линий. Желательно проводить исследования канцерогенности на животных той же линии и из того же источника, которые использовались в предварительных исследованиях токсичности меньшей продолжительности. Если известно, что при использовании животных данной линии и источника наблюдаются проблемы в достижении общепринятого критерия в 50% выживаемости в течение 24 месяцев, то следует рассмотреть возможность использования линии, обладающей приемлемой для долгосрочного исследования выживаемостью. Женские особи должны быть нерожавшими и небеременными. Введение дозы должно быть начато как можно скорее после отлучения от материнской груди.

4.1.2. Животные могут быть размещены в клетках индивидуально или малыми группами одного пола; индивидуальное размещение следует рассматривать только в случае, если это научно обосновано. Клетки должны быть устроены таким образом, чтобы возможные эффекты, связанные с размещением клетки, были минимальны. Температура в экспериментальном помещении для животных должна составлять . Несмотря на то что относительная влажность должна быть, как минимум, 30% и не превышать 70%, за исключением времени уборки комнаты, оптимальное значение составляет 50-60%. Освещение должно быть искусственным в последовательности: 12 часов - свет, 12 часов - темнота. При кормлении может быть использована обычная лабораторная диета с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна соответствовать всем требованиям питания для тестовых видов, и содержание примесей, в том числе: остаточное содержание пестицидов, стойких органических загрязнителей, фитоэстрогенов, тяжелых металлов и микотоксинов, которые могут повлиять на результаты испытаний, в пище должно быть как можно ниже. Необходимо периодически проводить анализ содержания примесей в пище, особенно в начале испытания и при наличии изменений в используемой партии. Данные таких анализов должны быть включены в окончательный отчет. Также должны быть представлены аналитические данные для питьевой воды.

4.1.3. Следует использовать здоровых животных, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях в течение не менее 7 дней и не участвовали в предыдущих тестовых процедурах. При использовании грызунов, воздействие фактора на животных должно начинаться как можно скорее после прекращения грудного вскармливания и адаптации, предпочтительно не позднее достижения животными возраста восьми недель. Животных необходимо охарактеризовать по виду, линии, источнику, полу, массе тела и возрасту. В начале испытания отклонения в массе тела животных должны быть минимальными и не превышать от средней массы всех животных, используемых в испытании, для каждого пола отдельно. Животные должны быть случайным образом распределены в контрольную и экспериментальную группы. После распределения в группах каждого пола не должно быть существенных различий в средней массе тела животных. Каждому животному должен быть присвоен индивидуальный номер. Каждое животное должно иметь постоянную метку с данным номером (например, татуировку, микрочип или другой подходящий знак).

4.2. Количество и пол животных

4.2.1. Для грызунов в каждой дозовой и контрольной группе используется не менее 100 животных (50 самок и 50 самцов). Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Если предполагается умерщвление животных на определенных этапах испытания, их количество должно быть увеличено на количество животных, которое планируется умертвить до окончания срока испытания.

4.3. Уровень доз и частота экспозиции

4.3.1. Используется не менее трех уровней доз и контрольная группа. В общем случае уровни доз выбирают на основании результатов краткосрочных испытаний повторных доз или испытаний по выбору диапазона доз, при этом необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные об исследуемом веществе или структурно близких веществах.

4.3.2. При отсутствии ограничений, вызванных физико-химическими свойствами и биологическим действием исследуемого вещества, должна выбираться максимальная доза, позволяющая определить основные органы-мишени и токсические эффекты, но не вызывающая при этом страданий, значительной токсичности, заболеваемости или смерти животных.

4.3.3. Однако в зависимости от цели исследования в качестве максимальной может быть выбрана доза ниже, чем доза, вызывающая признаки токсичности, например, если такая доза вызывает негативное воздействие такого рода, тем не менее незначительно влияет на продолжительность жизни или изменение массы тела.

4.3.4. Уровни доз и интервал между ними могут быть выбраны таким образом, чтобы можно было установить зависимость доза-эффект. Это зависит от механизма действия исследуемого вещества, недействующего уровня воздействия (NOAEL) или других ожидаемых результатов, например BMD при минимальном уровне дозы. Факторы, которые следует учитывать при установлении минимальных доз, включают ожидаемый наклон кривой доза-эффект, дозы, при которых могут произойти важные изменения в метаболизме или механизме токсического действия, для которого ожидается наличие порогового уровня или появление отправной точки для экстраполяции на низких дозах.

4.3.5. При введении максимальной дозы у животных проявляются невыраженные признаки токсичности, такие как небольшое замедление набора массы (менее 10%) без существенного влияния на продолжительность жизни по причине каких-либо эффектов, кроме новообразований. Самый низкий уровень дозы в целом не должен быть меньше 10% от самой высокой дозы - и не должен влиять на нормальный рост, развитие и срок жизни животного или вызывать какие-либо признаки токсичности. Средний уровень доз(ы) является промежуточным между высоким и низким уровнями доз.

4.3.6. Выбранный интервал уровней доз будет зависеть от характеристик исследуемого вещества и не может быть описан в настоящем руководстве, но часто наиболее оптимальными являются двух-, четырехкратные интервалы для установления убывающей последовательности доз. Дополнительное использование четвертой тестируемой группы часто более предпочтительно, чем использование очень больших интервалов (например, более 6-10-кратных) между дозами. Дальнейшие рекомендации по выбору доз и интервалов представлены в руководстве ОЭСР по разработке и проведению исследований по изучению хронической токсичности и канцерогенности, но, как правило, следует избегать использования более чем 10-кратных интервалов. Если такие интервалы используются, это должно быть обосновано.

4.3.7. Факторы, которые следует учитывать при выборе доз, включают:

- известные или вероятные нелинейности или точки перегиба на кривой доза-эффект;

- фармакокинетику и диапазоны доз, в которых происходит или не происходит метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между внешней и внутренней дозами;

- предшествующие поражения, маркеры воздействия или показатели протекания соответствующих ключевых биологических процессов;

- основные (или подозреваемые) аспекты механизма действия, такие как дозы, при которых появляется цитотоксичность, наблюдается повышение гормонального фона, нарушение гомеостатических механизмов и т.д.;

- отрезки кривой доза-эффект, для которых требуется особенно надежная оценка, например, вблизи ожидаемой контрольной дозы (BMD) или порога воздействия;

- ожидаемые уровни воздействия на человека.

4.3.8. Как правило, животных подвергают воздействию вещества ежедневно. Если вещество вводится с питьевой водой или с пищей, вода и пища должны быть постоянно доступны.

4.4. Контроль

4.4.1. Необходимо использовать контрольную группу (группы параллельного контроля), схожую с экспериментальной, но не подвергающейся воздействию исследуемым веществом.

4.4.2. При особых обстоятельствах, как, например, ингаляционных испытаниях с использованием аэрозолей или исследованиях эмульгирующих агентов неописанного биологического воздействия, вводимых перорально, также необходимо использовать группу параллельного контроля, в которой животным вводится неактивное вещество.

4.4.3. С животными в контрольной группе следует обращаться также как с животными из тестовых групп. При использовании растворителя контрольная группа должна получать растворитель в максимальном объеме, используемом для экспериментальных групп. Если исследуемое вещество вводят в рацион, и это приводит к снижению потребления пищи, используется дополнительная контрольная группа для оценки последствий ограничений в кормлении.

4.5. Способы введения вещества

4.5.1. Есть три основных способа введения вещества - пероральный, дермальный и ингаляционный. Выбор способа введения зависит от физико-химических свойств испытуемого вещества и от предполагаемого способа воздействия при использовании человеком.

Введение вещества перорально

4.5.2. Как правило, исследуемое вещество вводят перорально, через желудочный зонд или с пищей, или питьевой водой. Дополнительная информация о способах и методах введения исследуемого вещества представлена в руководстве ОЭСР N 116. Способ введения исследуемого вещества зависит от цели исследования, физико-химических свойств исследуемого вещества и его биологической доступности. Из соображений заботы о благополучии животных введение через желудочный зонд, как правило, выбирают только для тех веществ, для которых данный метод введения отражает потенциальное воздействие на человека (например, для фармацевтических препаратов). Для пищевых или природных химических веществ, включая пестициды, введение должно осуществляться с пищей и питьевой водой.

4.5.3. В случае необходимости исследуемое вещество растворяют или суспендируют в подходящем растворителе. При выборе растворителя и других добавок необходимо учитывать следующие характеристики: влияние на всасывание, распределение, метаболизм или удержание исследуемого вещества; влияние на химические свойства исследуемого вещества, которые могут изменить его токсичные свойства; воздействие на потребление пищи или воды или состояние питания животных. Рекомендуется, по возможности, в первую очередь рассматривать использование водных растворов/суспензий, затем растворов/эмульсий в масле (например, кукурузном масле), затем возможных растворов в других растворителях. Для растворителей, за исключением воды, должны быть известны их токсичные свойства. Должна быть определена стабильность исследуемого вещества в условиях введения (например, диеты), а также аналитически подтверждена однородность каждой партии раствора дозирования или пищи (воды), содержащей вещество (при необходимости).

4.5.4. Для веществ, поступающих с пищей или питьевой водой, важно обеспечить условия, при которых используемое количество исследуемого вещества не должно нарушать нормальное питание или водный баланс. В испытаниях хронической токсичности при поступлении вещества с пищей концентрация химического вещества в пище не должна превышать верхнего предела 5% от общего количества пищи (REF), если диета не была соответствующим образом скорректирована для удовлетворения пищевых потребностей животных. Когда исследуемое вещество вводят с пищей, можно использовать либо постоянную пищевую концентрацию (мг/кг или ррm) или постоянный уровень дозы по отношению к массе тела животного; альтернативные варианты должны быть указаны.

4.5.5. Животным вводят исследуемое вещество ежедневно семь дней в неделю, обычно в течение 18 месяцев для мышей и хомяков и 24 месяцев для крыс. Любой другой режим дозирования, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован.

4.5.6. Когда исследуемое вещество вводят через желудочный зонд, это должно осуществляться с помощью желудочной трубки или подходящей интубационной канюли, в одно и то же время каждый день. Обычно разовая доза вводится один раз в день. Если, например, исследуемое вещество является местным раздражителем, для поддержания ежедневного уровня дозы вещество может вводиться в виде разделенной дозы (например, два раза в день). Максимальный объем жидкости, которая может быть введена за один раз, зависит от размера экспериментальных животных. Обычно объем должен быть настолько низким, насколько это практически возможно, и не должен превышать 1 мл/100 г массы тела, за исключением случаев водных растворов, когда можно использовать 2 мл/100 г массы тела. Изменения тестируемого объема дозы должны быть минимальны за счет регулирования концентраций для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз. Потенциально едкие или раздражающие вещества являются исключением, они должны быть разбавлены так, чтобы избежать появления тяжелых местных эффектов. Величина рН растворов для дозирования, как правило, должна быть в диапазоне от 4 до 9. За исключением раздражающих или едких веществ, воздействие которых, как правило, усугубляется с повышением концентрации, изменчивость в тестовом объеме должна быть минимизирована за счет регулирования концентрации для обеспечения постоянного объема для всех уровней доз.

Введение вещества через козну

4.5.7. Дермальная экспозиция путем нанесения вещества на кожу может быть выбрана как модель основного способа экспозиции вещества на человека, а также в качестве модели-системы для инициации кожных поражений. Животные подвергаются воздействию вещества не менее 6 часов, 7 дней в неделю в течение 24 месяцев.

Введение вещества ингаляционно

4.5.8. Ингаляционные испытания сопровождаются большими сложностями, нежели испытания при любом другом способе введения испытуемого вещества. Необходимо также отметить, что в особых случаях равнозначной альтернативой этому способу введения вещества может стать внутритрахеальное вливание.

4.5.9. Долгосрочные экспозиции, как правило, планируют так, чтобы результаты испытания можно было перенести на человека. При долгосрочных экспозициях вещество вводят подопытным животным ежедневно на протяжении шести часов после уравновешивания концентрации в камере, или на протяжении пяти дней в неделю (прерывистая экспозиция), или с учетом возможного воздействия окружающей среды, от 22 до 24 часов в сутки на протяжении семи дней в неделю (непрерывная экспозиция), где около часа в день (в одно и то же время) отводят на кормление животных и поддержание условий испытания в камере. В обоих случаях на животных воздействуют веществом в фиксированной концентрации. Основное различие между прерывистой и непрерывной экспозицией состоит в том, что в первом случае животное может восстанавливаться после ежедневного воздействия вещества в течение 17-18 часов, в выходные дни этот период увеличивается.

4.5.10. Выбор между прерывистой и непрерывной экспозицией зависит от целей исследования и от воздействия на человека с применением плацебо. Но в любом случае необходимо будет учесть некоторые технические сложности. Например, для моделирования среды обитания преимущества непрерывной экспозиции могут отступать перед необходимостью в питье и пище во время экспозиции, а также потребностью в более многосоставных (и надежных) аэрозолях и газах в контрольно-управляющей технике.

4.6. Экспериментальные камеры

4.6.1. Испытание проводят в ингаляционных камерах, конструкция которых позволяет обеспечить активную циркуляцию воздушных потоков: не менее 12 воздухообменов в час, благодаря чему вещество в воздухе распределяется равномерно и сохраняется нужный уровень кислорода. Контрольная и экспериментальная камеры должны иметь одинаковую конструкцию и дизайн, чтобы обеспечить равные условия экспозиции. Незначительное отрицательное давление внутри камеры поддерживают в основном в целях предотвратить утечку вещества. Камеры должны быть устроены таким образом, чтобы минимизировать скопление животных. Общим правилом является содержание испытуемого вещества в камере не более 5% от всего объема, что позволяет гарантировать устойчивость среды в камере.

4.6.2. Параметры, которые подлежат контролю и соблюдению при проведении испытания:

- воздушный поток: интенсивность потоков воздуха необходимо постоянно отслеживать;

- концентрация: разброс концентрации испытуемого вещества в период ежедневной экспозиции не должен превышать от основного значения. На протяжении всего исследования концентрация каждый день должна быть по мере возможности стабильной;

- температура и влажность: для кроликов температура воздуха - , влажность колеблется в пределах 30-70%, за исключением случаев, когда для распределения испытуемого вещества в воздухе камеры используется вода. За температурой и уровнем влажности необходимо постоянно следить;

- измерение размера частиц: необходимо определить распределение размера частиц в воздухе камеры, где используются жидкие или твердые аэрозоли. Частицы аэрозолей должны соответствовать размеру, пригодному для дыхания подопытных животных. Образцы воздуха в камерах должны быть получены из зоны вдыхания и должны отображать распределение вдыхаемых животными частиц. Также они должны давать информацию о нахождении частиц аэрозолей во взвешенном состоянии, на основании гравиметрических данных, даже когда большая часть аэрозоля не пригодна для вдыхания. Анализ размера частиц следует проводить регулярно в процессе работы системы генерации, что позволит удостовериться в постоянной стабильности аэрозоля, и затем по мере необходимости, для того чтобы подтвердить состав и распределение частиц, воздействию которых подвергаются животные.

4.7. Продолжительность испытания

4.7.1. Продолжительность испытания на канцерогенность длится значительную часть жизненного срока подопытного животного. Испытания длятся 18 месяцев для мышей и хомяков и 24 месяца для крыс. Но для определенных линий животных с более долгим сроком жизни и/или с более низкой предрасположенностью к опухолям, испытание составляет 24 месяца для мышей и хомяков и 30 месяцев для крыс. В качестве альтернативы, продление срока испытания допустимо, если количество выживших животных в группе с низким уровнем дозы или в контрольной группе составило 25%. Если по завершении испытания наблюдается видимая разница в реакции между полами, каждый пол должен быть обсужден отдельно. Если от выраженных признаков токсичности погибает только группа с высокой дозой, это не должно послужить причиной для прекращения испытания при условии, что токсические проявления не создают проблем в других группах. Для того чтобы результаты испытания можно было признать отрицательными, не более 10% животных в каждой группе может быть утеряно во время эксперимента по причине аутолиза, каннибализма или неправильного ухода, не менее 50% животных каждой из групп должно выжить: по истечении 18 месяцев для мышей и хомяков, 24 месяцев для крыс.

5. Процедура

5.1. Наблюдение

5.1.1. Всех животных необходимо проверять на заболеваемость и смертнос