Приложение 6.1.9. Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах

Приложение 6.1.9

Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 407 "Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in Rodents" (ОЭСР Руководство N 407 "Изучение пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах". Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования по изучению пероральной токсичности при повторном воздействии в 28-дневных опытах на грызунах предназначен для получения информации о возможном вреде для здоровья при повторном введении вещества в течение относительно небольшого периода времени, включая общетоксическое действие и эффекты на нервную, иммунную и эндокринную системы.

2. Общие положения

2.1. Оценка токсикологических характеристик химического вещества, исследование пероральной токсичности с использованием повторного введения может выполняться после того, как получена первичная информация о токсичности в условиях острого опыта. Метод предназначен для изучения эффектов для очень широкого разнообразия потенциальных мишеней токсичности. Их использование позволяет получить информацию о возможном вреде для здоровья при повторном воздействии вещества в течение относительно небольшого периода времени, включая эффекты на нервную, иммунную и эндокринную системы. При рассмотрении этих видов действия могут быть выявлены вещества с нейротоксическим потенциалом, для которых потребуются дальнейшие исследования в этом аспекте, и вещества, которые нарушают физиологию щитовидной железы. Могут быть также получены данные о влиянии веществ на репродуктивные органы молодых взрослых самцов и самок и выявлены симптомы иммунологических эффектов.

2.2. Полученные на основании метода исследования результаты должны использоваться при идентификации опасности и оценки риска. Результаты, полученные для эндокринно-зависимых параметров, должны быть рассмотрены в контексте ОЭСР Концептуальной схемы изучения и оценки химических веществ, разрушающих эндокринную систему. Метод включает в себя базисное изучение токсичности при повторном введении, которое может использоваться для веществ, которые не требуют 90-дневных исследований (например, когда объемы производства не превышают определенных пределов) или как предварительное перед проведением 90-дневных опытов. Продолжительность воздействия должна составлять 28 дней.

2.3. Международная программа по апробации (валидизации) параметров, потенциально пригодных для выявления эндокринной активности изучаемого вещества показала, что качество данных, получаемых с ориентацией на Руководство ОЭСР 407, в значительной мере зависит от опыта исследовательской лаборатории. Это особенно относится к гистопатологическим анализам циклических изменений в репродуктивных органах самок и определению массы мелких гормонозависимых органов, которые трудно препарировать. Существует множество параметров - индикаторов эндокринно-зависимой токсичности. Параметры, для которых недостаточно данных для подтверждения их практической значимости, и для которых при апробации показана слабая способность к выявлению эндокринных разрушителей, предлагаются как вспомогательные.

2.4. На основании данных, полученных в процессе апробации (валидизации), следует подчеркнуть, что чувствительность представленного ниже биологического испытания не достаточна для выявления всех веществ с (анти)андрогенным или (анти)эстрогенным видом действия. Руководство ОЭСР 407 не распространяется на стадии жизни, наиболее уязвимые для эндокринных разрушителей. С использованием Руководства были идентифицированы препараты, слабо или сильно влияющие на функцию щитовидной железы, а также вещества с сильной и средней эндокринной активностью, действующие на эстрогенные и андрогенные рецепторы, но в большинстве случаев не удалось выявить эндокринную активность у веществ, которые слабо взаимодействуют с эстрогенными и андрогенными рецепторами. Таким образом, данное исследование не может быть характеризовано как скрининговое для оценки эндокринной активности.

2.5. Следовательно, отсутствие эффектов, связанных с вышеупомянутыми видами действия, не может считаться доказательством отсутствия влияния на эндокринную систему. В отношении эндокринно-опосредованных эффектов характеристика препарата не должна основываться на результатах, полученных только в рамках данного Руководства, в ней должны взвешенно использоваться принципы доказательности, включающие все сведения о веществе, характеризующие его потенциальную эндокринную активность. По этой причине регулятивное решение, принятое с учетом эндокринной активности (характеристики препарата), должно быть широко обоснованным подходом, не находящимся в зависимости от результатов, полученных по данному Руководству.

2.6. Признается, что все процедуры с использованием животных должны соответствовать локальным стандартам содержания животных; требования к содержанию животных и воздействию вещества изложены ниже в минимальном варианте и могут быть заменены местными нормами, если они более жесткие.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Изучаемое вещество вводится ежедневно перорально в градуированных дозах нескольким группам экспериментальных животных в одном дозовом уровне на группу в течение 28 дней. В течение всего периода введения вещества животные ежедневно тщательно наблюдаются для выявления признаков токсичности. Животные, погибшие или умерщвленные в ходе исследования, подвергаются вскрытию, выжившие животные умерщвляются и подвергаются вскрытию по завершению эксперимента. 28-дневное исследование дает информацию об эффектах повторного перорального воздействия и может выявить необходимость последующих более длительных исследований. Из него также может быть получена информация о выборе концентраций для более длительных исследований. Данные, полученные с использованием метода, должны приниматься во внимание при характеристике токсичности изучаемого вещества, при выявлении зависимостей доза-эффект и при определении уровня, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL).

3.2. Животные

Выбор вида животных

3.2.1. Предпочтительный вид грызунов - крыса, однако могут использоваться и другие грызуны. Если параметры, указанные в Руководстве 407, исследуются на других видах грызунов, этому должно быть дано детальное обоснование. Хотя биологически допустимо, что другие виды будут реагировать на токсичное вещество также, как крыса, использование более мелких видов может увеличить вариабельность из-за технической сложности препарирования более мелких органов. В международной программе по апробации выявления эндокринных разрушителей единственным видом использованных животных были крысы. Использоваться должны молодые здоровые половозрелые животные широко применяемых лабораторных линий. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. Введение вещества должно начинаться как можно скорее после прекращения материнского питания, и, в любом случае, до того, как животные достигнут 9-недельного возраста. В начале исследования вариации массы тела используемых животных должны быть минимальными и не превышать от средней массы каждого пола. Если повторное 28-дневное воздействие вещества проводится как предварительное к долговременному исследованию, предпочтительно, чтобы в обоих исследованиях использовались животные одной и той же линии из одного и того же источника.

Содержание и кормление

3.2.2. Все процедуры должны соответствовать местным стандартам ухода за животными. Температура в экспериментальной комнате для животных должна быть . Относительная влажность воздуха должна быть не менее 30% и, желательно, не выше 70% во время уборки помещения, оптимальный диапазон - 50-60%. Освещение должно быть искусственным, с последовательным чередованием 12 часов света и 12 часов темноты. Для кормления может использоваться обычная лабораторная диета с неограниченным потреблением питьевой воды. На выбор диеты может повлиять необходимость обеспечить хорошее смешивание изучаемого вещества, если оно вводится с кормом. Животные должны содержаться небольшими группами одного пола, животные могут быть размещены индивидуально, если это научно обосновано. При групповом содержании в одной клетке должно размещаться не более 5 животных.

3.2.3. Корм должен регулярно анализироваться на загрязняющие вещества. Образцы корма должны сохраняться до завершения отчета.

Подготовка животных

3.2.4. Здоровые молодые взрослые животные произвольно распределяются в контрольную и экспериментальные группы. Клетки должны быть расставлены так, чтобы свести к минимуму возможные эффекты, связанные с размещением клеток. Животные индивидуально маркируются и содержатся в своих клетках, по крайней мере, в течение 5 дней до начала введения вещества для акклиматизации к лабораторным условиям.

Подготовка доз

3.2.5. Изучаемое вещество вводится желудочным зондом, с диетой или с питьевой водой. Метод перорального введения зависит от физических/химических/токсико-кинетических свойств изучаемого вещества.

3.2.6. Если необходимо, изучаемое вещество растворяется или суспензируется в подходящем растворителе. Рекомендуется, по возможности, во-первых, рассматривать использование водного раствора/суспензии, за ним следует рассмотрение использования раствора/суспензии в масле (например, в кукурузном масле) и только потом - возможное растворение в других растворителях. Для растворителей, отличных от воды, должны быть известны токсикологические характеристики. Должна быть определена стабильность изучаемого вещества в растворителе.

3.3. Процедура исследования

Количество и пол животных

3.3.1. По крайней мере, 10 животных (пять самцов и пять самок) должны быть использованы в каждой дозе. Если планируется умерщвление животных в течение эксперимента, общее число животных должно быть увеличено на то их количество, которое предназначается к умерщвлению до завершения исследования. Должна быть рассмотрена целесообразность дополнительной сателлитной группы из 10 животных (по 5 каждого пола) для наблюдения за обратимостью, устойчивостью или отсроченным проявлением токсических эффектов, по крайней мере, в течение 14 дней после прекращения воздействия вещества.

Дозировка

3.3.2. Как правило, должны использоваться, по крайней мере, три экспериментальные и контрольная группа, но если из оценки других данных следует, что эффекты не будут проявляться в дозе 1 000 мг/кг массы/день, то может проводиться сокращенное исследование. Если данных недостаточно, могут быть проведены исследования по подбору диапазона доз (на животных той же линии и из того же источника) с целью определить, какие дозы изучать в 28-дневном эксперименте. За исключением введения изучаемого вещества, условия содержания контрольных и опытных животных должны быть идентичными. Если для введения изучаемого вещества применяется растворитель, контрольная группа должна получать растворитель в наибольшем из используемых объемов.

3.3.3. Дозовые уровни должны выбираться с учетом всех имеющихся токсикологических и (токсико-) кинетических данных, имеющихся в наличии для тестируемого препарата или родственных веществ. Наивысшая доза должна выбираться с целью вызвать токсические эффекты, но не гибель или сильные страдания животных. Поэтому последовательность снижения дозовых уровней должна выбираться с перспективой обнаружения любых доза-зависимых реакций и установления уровня, при котором не наблюдаются неблагоприятные эффекты вещества (NOAEL). Двух- или четырехкратные интервалы обычно оптимальны для установления убывающих дозовых уровней, а добавление четвертой опытной группы животных часто предпочтительнее использования очень больших интервалов (например, более, чем 10-кратных) между дозами.

3.3.4. При наличии видимой общей токсичности (например, снижение массы тела, действие на печень, сердце, легкие или почки и др.), видимые эффекты на иммунные, нейрологические и эндокринные показатели должны интерпретироваться с осторожностью.

3.4. Ограниченное исследование

3.4.1. Если исследование одного уровня дозы как минимум 1 000 мг/кг массы тела/день или, при введении с диетой или питьевой водой (на основе определения массы тела), эквивалентной процентному содержанию вещества в корме или питьевой воде, процедуры, предписанные для проведения 28-дневного исследования, не выявляют токсических эффектов и, если проявлений токсичности не ожидается на основании данных о структурно связанных веществах, тогда полное исследование с тремя уровнями доз может рассматриваться как необязательное. Проводится ограниченное изучение вещества, если только воздействие на людей не свидетельствует о необходимости использования более высокого дозового уровня.

3.5. Введение доз

3.5.1. Животные получают изучаемое вещество 7 дней в неделю в течение 28 дней. Если изучаемое вещество вводится внутрижелудочно, это должно быть сделано в одноразовой дозе для животных с использованием желудочного зонда или подходящей интубационной канюли. Максимальный объем жидкости, который может быть введен за один раз, зависит от размера экспериментальных животных. Вводимый объем не должен превышать 1 мл/100 г массы тела, за исключением водных растворов, которые допустимо вводить в объеме 2 мл/100 г массы тела. Для изучаемых веществ, за исключением едких и раздражающих, у которых обычно при увеличении концентрации раздражающие эффекты усугубляются, вариабельность объема должна быть минимизирована подбором концентраций так, чтобы все дозовые уровни вводились в одном и том же объеме.

3.5.2. Для веществ, вводимых с диетой или питьевой водой, важно убедиться, что используемые количества изучаемого вещества не нарушают нормальное питание или водный баланс. Если изучаемое вещество вводится с диетой, может использоваться либо постоянная концентрация (ppm), либо постоянный уровень доз в переводе на вес тела животного, выбор должен быть точно определен. Для веществ, вводимых с помощью зонда, доза должна вводиться каждый день в одно и то же время и устанавливаться в соответствии с необходимостью поддерживать постоянный уровень дозы в пересчете на массу тела животного. Если 28-дневное исследование с повторным введением вещества проводится как предварительное к долговременному исследованию, в обоих исследованиях должны использоваться одинаковые диеты.

3.6. Наблюдения

3.6.1. Период наблюдения должен составлять 28 дней. Животные сателлитной группы, предназначенные для последующих наблюдений, должны содержаться, по крайней мере, 14 дней без воздействия вещества для выявления отсроченного действия, устойчивости токсических эффектов или их исчезновения.

3.6.2. Общие клинические наблюдения должны проводиться, по крайней мере, один раз в день, желательно в одно и то же время, принимая во внимание период максимального проявления ожидаемых эффектов после введения вещества. Состояние организма животных должно быть зафиксировано. Не менее двух раз в день животные осматриваются для выявления заболеваемости или гибели.

3.6.3. Один раз перед первым введением вещества (для возможности внутригрупповых сравнений) и не менее одного раза в неделю после начала воздействия вещества должны быть проведены детальные клинические наблюдения для всех животных. Наблюдения должны проводиться вне клетки на стандартной арене и предпочтительно каждый раз в одно и то же время дня. Наблюдения должны быть тщательно зарегистрированы, предпочтительно с использованием систем оценки, четко оговоренных исследовательской лабораторией. Должны быть приняты меры для того, чтобы следить за тем, чтобы вариации в условиях исследования были минимальными и чтобы наблюдения преимущественно проводились наблюдателями, не осведомленными о воздействии вещества. Замеченные симптомы должны включать, не ограничиваясь этим, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, наличие секреции и экскреции и автономной активности (слезотечение, пилоэрекция, размер зрачка, необычные типы дыхания). Изменения в походке, позе, отношении к уходу, наличие клонических или тонических движений, стереотипия (например, слишком интенсивный груминг, повторяющиеся круговые движения) или странное поведение (например, самоповреждение, движение задом наперед) также должны фиксироваться.

3.6.4. На четвертой неделе эксперимента должна быть изучена способность реагировать на различные стимулы (например, световые и проприоцептивные стимулы), оценены сила схвата и моторная активность. Детали процедур, которые проводятся, берутся из литературных источников. Набор используемых процедур может быть различным.

3.6.5. Функциональные исследования на четвертой неделе воздействия могут не проводиться, если 28-дневный эксперимент проводится как предварительный перед последующим субхроническим (90-дневным) экспериментом. В этом случае функциональные исследования должны быть включены в последующий эксперимент. С другой стороны, наличие данных функциональных исследований, полученных при 28-дневном повторном введении вещества, может облегчить выбор дозовых уровней для последующего субхронического опыта.

3.6.6. Как исключение, функциональные наблюдения могут также не проводиться для групп животных, в которых проявляются другие признаки токсичности вещества, а их выраженность может повлиять на результаты проведения функциональных тестов.

3.6.7. При некропсии эстральные циклы всех самок могут быть исследованы (при необходимости) с помощью вагинальных мазков. Эти исследования могут дать информацию в отношении стации эстрального цикла на момент умерщвления и оказаться полезными при гистологической оценке эстроген-чувствительных тканей (см. инструкции по гистопатологии).

Масса тела и потребление пищи/воды

3.6.8. Все животные должны быть взвешены не менее одного раза в неделю. Измерения потребления пищи должны проводиться не менее одного раза в неделю. Если изучаемое вещество вводится с питьевой водой, потребление воды должно также измеряться, по крайней мере, еженедельно.

Гематология

3.6.9. В конце эксперимента должны быть проведены следующие гематологические исследования: гематокрит, концентрация гемоглобина, количество эритроцитов, общий лейкоцитоз и лейкоцитарная формула, количество тромбоцитов и время/потенциал свертываемости крови. Другие исследования, которые должны проводиться, если вещество или его предполагаемые метаболиты имеют или могут иметь окислительные свойства, включают определение концентрации метгемоглобина и телец Гейнца.

3.6.10. Образцы крови должны отбираться непосредственно перед или в процессе умерщвления животных и сохраняться в соответствующих условиях. Животные должны голодать в течение ночи перед умерщвлением*.

Клиническая биохимия

3.6.11. Клинические биохимические определения для выявления токсических эффектов в тканях и, особенно, действия на почки и печень, должны проводиться в образцах крови, взятых у всех животных непосредственно перед или как часть процедуры умерщвления животных (за исключением животных, найденных агонизирующими, и /или умерщвленных до завершения эксперимента). Исследования плазмы или сыворотки должны включать определение натрия, калия, глюкозы, общего холестерина, мочевины, креатинина, общего белка, альбумина и не менее двух ферментов - индикаторов гепатоцеллюлярных эффектов (таких, как аланинами-нотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, щелочная фосфатаза, гамма-глютамилтранспепти-даза и глютаматдегидрогеназа) и желчных кислот. Определение дополнительных ферментов (печеночного или другого происхождения) и билирубина при определенных обстоятельствах может дать полезную информацию.

3.6.12. Дополнительно на последней неделе эксперимента может проводиться анализ мочи с использованием спланированного во времени сбора объемов мочи и определением таких показателей, как внешний вид, объем, осмотическое давление и удельный вес, pH, белок, глюкоза, кровь и клетки крови.

3.6.13. Кроме того, следует считать оправданным исследования с выявлением сывороточных маркеров общего повреждения тканей. Другие измерения, которые должны проводиться, если известные свойства изучаемого вещества могут или предположительно могут изменить соответствующие метаболические профили, включают кальций, фосфаты, триглицериды, специфические гормоны и холинэстеразу. Они могут определяться для химических веществ соответствующих классов или в каждом отдельном случае.

3.6.14. Хотя в международной практике оценки эндокринзависимых показателей явного преимущества определения тироидных гормонов (Т3, Т4) не продемонстрировано, может оказаться полезным сохранить образцы сыворотки или плазмы для измерения Т3, Т4 и TSH (по усмотрению), если имеются признаки воздействия на систему надпочечники - щитовидная железа. Эти образцы могут быть заморожены для хранения при -20°С. Следующие факторы могут влиять на вариабельность определения и абсолютные концентрации гормонов:

- время умерщвления из-за суточных колебаний концентраций гормонов;

- метод умерщвления, предотвращающий неоправданный стресс у животных, который может влиять на концентрации гормонов;

- диагностические комплекты для определения гормонов, которые могут различаться по калибровочным кривым.

Для точного выявления тироид-активных веществ более надежен гистопатологический анализ, чем определение уровней гормонов.

3.6.15. Образцы плазмы, специально предназначенные для определения гормонов, должны отбираться в сопоставимое время суток. Рекомендуется обратить внимание на определение Т3, Т4 и TSH, вызванное гистопатологическими изменениями щитовидной железы. Численные значения получены в тех случаях, когда анализируемые концентрации гормонов различаются из-за различий коммерческих наборов реактивов. Следовательно, может оказаться невозможным установить критерии эффективности на основе ретроспективных данных. В качестве альтернативы лаборатории должны приложить усилия для того, чтобы контрольные уровни коэффициентов вариации оставались менее 25 для Т3 и Т4 и менее 35 для TSH. Все концентрации должны выражаться в нг/мл.