Приложение 6.1.8. Кожно-резорбтивное действие: метод in vivo

Приложение 6.1.8

Кожно-резорбтивное действие: метод in vivo

Идентичен международному документу OECD TG N 427 "Skin Absorbtion: in vivo Method" (ОЭСР Руководство N 427 "Кожно-резорбтивное действие: метод in vivo"). Международный документ разработан Организацией Экономического Сотрудничества и Развития (ОЭСР/OECD), принят 13 апреля 2004 г. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к выполнению исследований по изучению кожно-резорбтивного действия химических веществ и продукции на их основе (далее - вещество) методом in vivo.

1.2. Метод обеспечивает получение информации о кожно-резорбтивном действии вещества и позволяет оценить и классифицировать его в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки (СГС) по данному виду эффекта.

2. Общие положения

2.1. Метод in vivo, описанный в данном методе исследования, используется уже много лет. Несмотря на то, что методы in vitro могут быть достаточными в большинстве случаев, существуют ситуации, где лучше использовать метод in vivo для получения нужной информации.

2.2. Преимущество тестирования in vivo состоит в том, что оно позволяет использовать физиологически и метаболически неповрежденную систему, вид животных, применяемый в большинстве токсикологических исследований, но может быть модифицировано для использования других видов животных. Недостатки тестирования in vivo включают: использование живых животных, необходимость использования материала, меченного радиоактивным изотопом, для получения достоверных результатов, трудности в определении ранней фазы абсорбции, разницу в проницаемости кожи у людей и крыс. Кожа крыс и кроликов имеет большую проницаемость, чем кожа людей, и, соответственно, это может привести к недостоверным результатам исследования. Кожа морских свинок, свиней и обезьян более соответствует коже людей.

2.3. Нельзя испытывать кожно-резорбтивное действие веществ, разъедающих кожу (обладающих коррозионным действием).

2.4. Как в интересах науки, так и с целью защиты животных, исследования in vivo не должны предприниматься до тех пор, пока не собраны, не рассмотрены и не взвешены все доступные данные о раздражающих/разъедающих свойствах вещества. Подобные данные включают в себя уже известные исследования на человеке и/или лабораторных животных, информацию о разъедающем/раздражающем воздействии одного или более структурно схожих веществ или смесей таких веществ. Они также включают в себя информацию о кислотных и щелочных свойствах испытываемого вещества и исходят из проверенных и верифицированных данных в исследованиях in vitro или ex vivo.

3. Принцип тестирования

3.1. Тестируемое вещество, предпочтительно радиоактивно меченное, наносится на выбритый участок кожи животного в одной или более адекватной дозе в форме, применяемой при его использовании.

3.2. Вещество оставляют на коже на фиксированное время под соответствующим покрытием (не герметичным, полугерметичным, герметичным) для того, чтобы исключить слизывание вещества животными.

3.3. По окончании экспозиции покрытие убирают, участок кожи очищают с использованием соответствующего средства (вода, мыло). Покрытие и материалы, используемые при очистке, необходимо сохранить для анализов, а экспонированный участок кожи покрыть новым защитным материалом.

3.4. До начала, в процессе и после эксперимента животные должны содержаться в отдельных метаболических клетках. Экскременты и выдыхаемый воздух собирают для последующего анализа. Сбор выдыхаемого воздуха может быть прекращен, когда будут получены убедительные данные, что в нем не содержится или содержится в незначительном количестве летучий радиоактивный метаболит.

3.5. Каждую дозу вещества исследуют на нескольких группах животных. Одну группу умерщвляют по окончании экспозиции, остальные - впоследствии через определённые промежутки времени. В конце периода наблюдения производят забой всех оставшихся животных, и их кровь собирают для исследования. Выделяют участок кожи, на который наносили вещество, используют цельную тушку животного для определения количества невыведенного вещества. Пробы анализируют соответствующими методами и рассчитывают степень кожной абсорбции.

4. Описание метода

4.1. Выбор вида животных

Крысы являются наиболее распространённым видом подопытных животных, но также можно использовать виды животных без шерсти и виды, у которых степень абсорбции кожи близка к человеческой.

Используют преимущественно молодых половозрелых самцов белых крыс с массой тела 200-250 г. В начале исследования различия в весе отдельных животных не должны превышать 20% от среднего веса группы.

4.2. Количество и пол животных

Для исследования каждой дозы вещества и в определенные периоды времени должна использоваться группа, состоящая, как минимум, из четырех животных. Каждая группа животных должна быть умерщвлена через разные интервалы времени, например, в конце экспозиции (обычно через 6 или 24 часа после нанесения) и в более отдаленные периоды (через 48 и 72 часа). Если существуют данные о разнице в кожной резорбции у самцов и самок, необходимо использовать более чувствительный пол. Если таких данных не существует, можно использовать животных любого пола.

4.3. Условия содержания и кормления

Температура в экспериментальном помещении, где содержатся подопытные животные, должна составлять для крыс. Относительная влажность помещения должна составлять 50-60%, ее минимальный уровень не должен быть меньше 30%, максимальный - 70%, за исключением случаев, когда производится уборка. Освещение искусственное, сменяется в следующей последовательности: 12 часов светло, 12 часов темно. Животные должны содержаться в отдельных клетках. Для кормления может использоваться стандартный корм, питьевая вода - в неограниченном количестве.

4.4. Подготовка животных

4.4.1. Животные должны быть выбраны случайно, помечены для идентификации и оставлены в своих клетках минимум на 5 дней до начала нанесения тестируемого вещества, что позволит им адаптироваться к лабораторным условиям.

4.4.2. После периода адаптации (и примерно за 24 часа до начала нанесения вещества) нужно выбрить участок кожи у каждого животного в районе лопаток. Свойства абсорбции у поврежденной кожи отличаются от свойств нормальной, поэтому нужно аккуратно обращаться с животными, чтобы дальше не повредить кожу. После сбривания шерсти (примерно за 24 часа для начала нанесения вещества на кожу) нужно протереть кожу ацетоном, чтобы избавиться от кожного сала. После этого лучше не мыть кожу с мылом и водой, так как остатки мыла могут вызвать повышенную абсорбцию нанесенного вещества. Нужно наносить вещество на большой участок кожи, чтобы получить достоверную информацию об абсорбции вещества. Как минимум нужно использовать участок площадью 10 . Это относится к крысам с весом 200-250 г. После нанесения вещества нужно вернуть животных в метаболические клетки.

4.5. Подготовка к тесту

В результате проводимого тестирования характеристики кожной абсорбции исследуемого вещества должны быть хорошо изучены. Поэтому лучше всего, чтобы вещество имело радиоактивную метку.

Тестируемая форма вещества (например, в чистом виде, неразбавленное или продукция, содержащая тестируемое вещество) должна быть такой же (или ее реальным аналогом), с которой может контактировать человек или другой живой организм. Любое отклонение должно быть обосновано. В некоторых случаях можно растворять вещество в подходящем разбавителе. Для всех разбавителей, кроме воды, нужно знать характеристики абсорбции и потенциального взаимодействия с веществом.

4.6. Нанесение вещества на кожу

4.6.1. Место нанесения отмечают на поверхности кожи.

4.6.2. Определенное количество вещества, соответствующее реальным условиям контакта человека с веществом (обычно 1-5 для твердых веществ и до 10 для жидкостей), необходимо равномерно нанести на кожу. Иные количества должны быть обоснованы с учетом условий применения вещества, целей исследования или физических свойств тестируемого препарата.

4.6.3. Участок кожи с нанесенным веществом должен быть защищен от слизывания. Пример типичного защитного устройства приведен в прилож. 1. Чаще всего место аппликации защищается пористым материалом (например, проницаемым нейлоновым, марлевым покрытием). Однако при повторных аппликациях вещества на место нанесения накладывают герметичное покрытие.

4.6.4. В случае испарения полулетучего вещества, которое уменьшает скорость извлечения до неприемлемого лимита, необходимо улавливать вещество с использованием угольного фильтра (прилож. 1). Необходимо сделать все, чтобы не дать устройству повредить кожу или впитать вещество.

4.6.5. После нанесения вещества все животные должны быть возвращены в метаболические клетки для сбора экскрементов.

4.7. Длительность воздействия и сбор проб

4.7.1. Длительность воздействия является интервалом времени между нанесением и удалением вещества. Предпочтительно использовать период воздействия от 6 до 24 часов, основанный на периоде воздействия на человека. После периода воздействия животные должны содержаться в метаболических клетках до усыпления. Необходимо регулярно наблюдать за животными на протяжении всего исследования, чтобы выявить признаки интоксикации или аномальные реакции. В конце исследования нужно провести наблюдения, чтобы выявить визуальные признаки раздражения на коже.

4.7.2. Метаболические клетки должны обеспечивать раздельный сбор мочи и фекалий. Также они должны позволять собирать углерода и его полулетучие , которые необходимо анализировать, если их количество превышает 5%. Мочу, фекалии и другие жидкости нужно собирать отдельно от каждой группы при каждом взятии проб. Если существует достаточная информация о том, что радиоактивный метаболит присутствует в небольших количествах, или не присутствует вообще, можно использовать открытые клетки.

4.7.3. Испражнения собирают во время воздействия вещества, до 24 часов после первого контакта с кожей и далее каждый день до конца эксперимента. Обычно достаточно трех сборов испражнений, но в некоторых случаях их количество можно увеличить.

4.7.4. По окончании периода воздействия защитные устройства удаляют и хранят для дальнейшего исследования. Кожа животных должна быть вымыта как минимум три раза с использованием моющего средства, не раздражающего кожу, при помощи мягкого тампона. Необходимо избежать попадания вещества на другие части тела. В конце нужно высушить кожу. Все, что было смыто с кожи, должно быть сохранено для анализа. Для животных, которые будут далее возвращены в метаболические клетки, нужно покрыть обработанные части тела животных новым материалом.

4.8. Конечные процедуры

4.8.1. В каждой группы все животные должны быть забиты в назначенное время, и их кровь отобрана для анализов. Обработанные и необработанные участки кожи должны быть отобраны для раздельного анализа.

4.8.2. Обработанный участок кожи может быть разделен на роговой слой и эпидермис для более точного анализа о распределении вещества. Определение такого распределения во времени после экспозиции должно дать информацию о судьбе всех веществ в роговом слое. Для проведения разделения кожи (после конечного смыва вещества и усыпления животного) нужно снять весь защитный материал.

4.8.3. Обработанный участок кожи вместе с окружающим его необработанным участком должен быть выделен и прикреплен на плоскую поверхность. Нужно аккуратно (с легким надавливанием) прикрепить отрезок клейкой ленты (скотч) на поверхность кожи, а потом отделить его вместе с частью рогового слоя. Последовательно накладывают полоски скотча до тех пор, пока лента больше не прилипает к поверхности кожи. Это означает, что весь роговой слой отделен. Для каждого животного можно хранить все куски скотча в одном контейнере с добавлением вещества, способствующего растворению рогового слоя.

4.8.4. Любые потенциальные ткани и органы-мишени могут быть отобраны для раздельного определения остаточных количеств вещества до того, как оставшиеся тушки животных будут использованы для определения абсорбированной дозы. Мёртвых животных (их тушки) необходимо сохранить для дальнейшего анализа. Обычно достаточно провести исследования всей тушки в целом. Моча, собранная во время забоя, должна быть смешана с собранной при предыдущих анализах.

4.8.5. После забоя животных и сбора и удаления их экскрементов, клетки должны быть тщательно вымыты. Также нужно проанализировать любое оборудование, которое могло быть загрязнено во время эксперимента.

4.9. Анализ данных

4.9.1. Во всех исследованиях нужно достичь адекватного извлечения (в среднем радиоактивности). Степень извлечения менее этого диапазона должна быть объяснена. Уровень экспозиционной дозы в каждом образце должен быть проанализирован с использованием подходящих процедур.

4.9.2. Статистический анализ должен включать определение степени дисперсии для каждого нанесения.

5. Данные и отчет

5.1. Данные

5.1.1. Для каждого животного должны быть проведены следующие измерения при каждом взятии проб тестируемого вещества и метаболитов. Помимо индивидуальных данных, нужно приводить данные, сгруппированные по признаку взятия проб.

- Количество вещества, адсорбированное на защитных устройствах;

- количество вещества, которое удалось удалить с кожи;

- количество вещества на коже или внутри нее, которое не удалось смыть;

- количество в образце крови;

- количество в испражнениях или в выдыхаемом воздухе;

- количества, остающиеся в тушке или в других органах.

5.1.2. Количество вещества и/или метаболитов в испражнениях, использованном воздухе, крови и тушке даст возможность определить общее количество вещества, абсорбированного на каждом этапе. Также можно получить расчет количества вещества, абсорбированного на каждый кожи, подверженный воздействию вещества.

5.2. Отчет

Отчет должен включать требования, описанные в протоколе, включая объяснения выбранной системы исследования, а также:

- вещество.

- идентификационные данные (номер CAS (если имеется), источник, чистота (радиохимическая чистота), известные примеси, номер партии);

- физическое состояние, физико-химические свойства (pH, летучесть, растворимость, стабильность, молекулярный вес и );

- подготовка исследования:

- рецептура и обоснование применения;

- детали подготовки, нанесенное количество, достигнутая концентрация, использованный растворитель, стабильность и однородность (гомогенность) раствора;

- подопытные животные:

- вид/линия;

- количество, возраст и пол;

- источник получения животных, условия содержания, диета и т.д.;

- вес каждого животного в начале тестирования;

- условия тестирования:

- детали по введению вещества (место нанесения, методы анализа, окклюзивное/неокклюзивное покрытие, объем аппликации, методы экстракции и определения);

- подробные данные о качестве воды и корма;

- результаты.

- признаки токсичности;

- данные об абсорбции в форме таблиц (соотношение, количество или процент);

- общее восстановление после исследования;

- интерпретация результатов, включая сравнение с любой доступной информацией о кожно-резорбтивном действии вещества.