Приложение 6.5.4. Оценка кожной сенсибилизации по реакции региональных лимфоузлов методом иммуноферментного анализа скорости включения бромдезоксиуридина в ДНК (метод LLNA : BrdU : ELISA)

Приложение 6.5.4

Оценка кожной сенсибилизации по реакции региональных лимфоузлов методом иммуноферментного анализа скорости включения бромдезоксиуридина в ДНК (метод LLNA : BrdU : ELISA)

Идентичен международному документу OECD N 442В "Skin Sensitization: Local Lymph Node Assay: BrdU:ELISA" (ОЭСР Руководство N 442В "Оценка кожной сенсибилизации по реакции региональных лимфоузлов методом иммуноферментного анализа скорости включения бромдезоксиуридина в ДНК (метод LLNA : BrdU : ELISA)". Принят 22 июля 2010 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования обеспечивает получение информации о способности исследуемого вещества вызывать кожную сенсибилизацию в тесте in vivo на мышах путем иммуноферментного анализа скорости включения бромдезоксиуридина в ДНК клеток региональных лимфоузлов, отражающего скорость их пролиферации. Полученная информация может быть использована для классифицикации веществ в соответствии с Согласованной на глобальном уровне системой классификации и маркировки (СГС) по данному виду токсичности.

1.2. До проведения эксперимента должна быть рассмотрена вся доступная информация об исследуемом веществе. Такая информация включает данные о составе и химическом строении вещества; его физико-химические свойства; результаты токсикологических испытаний in vivo и in vitro, токсикологические данные по структурно родственным веществам и предполагаемые пути использования вещества. Эта информация является необходимой для подтверждения того, что испытание является важным для защиты здоровья человека и способствует обоснованному выбору начальной дозы.

2. Общие положения

2.1. Руководство ОЭСР по тестированию химических веществ периодически пересматриваются в свете научно-технического прогресса, изменяющихся потребностей в нормативах и соображений заботы о благополучии животных. Первый вариант Руководства по оценке кожной сенсибилизации у мышей путем изучения реакции региональных лимфоузлов (the Local Lymph Node Assay, LLNA) был принят в 2002 году и позднее пересмотрен [1]. Детали валидации LLNA и обзор связанных с этой темой работ опубликованы в [2-9]. В исходном варианте метода LLNA для измерения скорости пролиферации лимфоцитов используются радиоизотопы тимидина или йода и, следовательно, применение данного метода имеет ограничения из-за наличия регионов, в которых приобретение, использование или утилизация радиоизотопов проблематичны.

Метод LLNA : BrdU : ELISA является модификацией метода LLNA, позволяющей обходиться без использования радиоизотопов и заключающейся в иммуноферментном определении включения бромдезоксиуридина (BrdU, CAS N 59-14-3) в ДНК лимфоцитов как индикатора их пролиферации. Метод LLNA : BrdU : ELISA был утвержден, пересмотрен и рекомендован международной группой экспертной оценки как адекватный метод отнесения химических соединений к сенсибилизирующим или несенсибилизирующим веществам, с определенными ограничениями.

2.2. Методы LLNA (OECD TG 429), две его нерадиоактивные модификации - LLNA: DA (OECD TG 442 A) and LLNA: BrdU-ELISA (OECD TG 442 В) и тест in vivo на морских свинках (OECD TG 406) являются равнозначными и могут быть использованы как альтернативные, в которых положительные и отрицательные результаты, как правило, не требуют дальнейшего подтверждения.

2.3. Метод имеет следующие ограничения:

- некоторые металлы дают в LLNA ложноотрицательные эффекты, а некоторые кожные ирританты - например, некоторые разновидности сурфактантов - ложноположительные;

- при тестировании определенных типов химических веществ или веществ, содержащих определенные функциональные группы, могут возникать побочные эффекты, искажающие результаты LLNA : BrdU : ELISA;

- следует учесть возможность преувеличения реальной опасности веществ при получении методом LLNA : BrdU : ELISA пограничных эффектов, со значениями индекса стимуляции (ИС) между 1,6 и 1,9 при установленном пороговом значении 1,6. В частности, по результатам тестирования 43 веществ (п. 3.1) метод LLNA : BrdU : ELISA правильно идентифицировал 32 сенсибилизирующих вещества, но неправильно идентифицировал два из 12 несенсибилизирующих веществ с пограничными значениями ИС, лежащими между 1,6 и 1,9.

Во всех этих случаях следует использовать постановку другой разновидности теста LLNA (OECD TG 429, OECD TG 442 А) или классического теста на морских свинках (OECD TG 406).

3. Принцип метода

3.1. Основной принцип, лежащий в основе метода LLNA : BrdU : ELISA, заключается в том, что вещества-сенсибилизаторы обладают способностью ускорять пролиферацию лимфоцитов в тех лимфатических узлах, которые дренируют место нанесения исследуемого вещества. Скорость пролиферации лимфоцитов при этом пропорциональна дозе и мощности нанесенного на кожу аллергена. Отношение среднего значения скорости пролиферации лимфоцитов в экспериментальной группе животных к среднему значению скорости их пролиферации в контрольной группе, подвергнутой воздействию растворителя, называют индексом стимуляции (ИС). Пороговым значением ИС в методе метода LLNA : BrdU : ELISA, позволяющим отнести тестируемое вещество к классу потенциальных кожных сенсибилизаторов, является значение 1,6.

3.2. В методе LLNA : BrdU : ELISA оценка количества пролиферирующих клеток в околоушных лимфоузлах, дренирующих участок нанесения тестируемого препарата, основана на иммуноферментном анализе скорости включения аналога тимидина (бромдезоксиуриди- на, BrdU) - в ДНК клеток лимфоузлов. В иммуноферментном анализе используются антитела к бромдезоксиуридину, меченые пероксидазой. При добавлении субстрата пероксидазы образуется окрашенный продукт, концентрацию которого определяют по оптической плотности раствора с помощью планшетного ридера.

4. Описание метода

4.1. Подготовка к опыту

Выбор вида животных

4.1.1. Для проведения данного теста используются молодые половозрелые самки мышей в возрасте от 8 до 12 недель - предпочтительно линии СВА/J, использовавшейся при валидации метода LLNA : BrdU : ELISA. Различия в весе животных не должны превышать 20% от их среднего веса. Для использования мышей других линий и противоположного пола необходимо предварительно показать на стандартных эталонных веществах равноценность данной замены.

Условия содержания и кормления животных

4.1.2. Температура в помещении для животных должна составлять ; диапазон влажности - 30-70%. Освещение должно быть искусственным, с чередованием 12-часовых периодов света и темноты. Для кормления животных могут использоваться обычные лабораторные диеты с неограниченным доступом к питьевой воде.

Подготовка животных

4.1.3. Животных отбирают случайным образом, маркируют для индивидуальной идентификации (любым способом, не затрагивающим область ушей) и содержат в клетках в течение, по крайней мере, пяти дней до начала введения тестируемого вещества, чтобы обеспечить их акклиматизацию к лабораторным условиям. До начала воздействия всех животных осматривают на предмет отсутствия видимых кожных повреждений.

Подготовка растворов тестируемого вещества

4.1.4. Твердые исследуемые вещества перед нанесением на уши мышей следует растворить или суспендировать в подходящих растворителях. Жидкие исследуемые вещества можно наносить неразбавленными; их разбавление растворителем производится только для получения рабочих растворов нужных концентраций. При изучении безопасности изделий медицинского назначения используют экстракты, полученные длительным выдерживанием изделий в подходящем растворителе. Растворы исследуемых препаратов следует готовить ежедневно, кроме тех случаев, когда заведомо известно, что они могут храниться в определенных условиях в течение определенного времени.

Контроль качества

4.1.5. В качестве положительного контроля (ПК) используются вещества с хорошо известной способностью к кожной сенсибилизации. Рекомендуется включать ПК в каждый проводимый эксперимент, поскольку это позволяет оценивать внутри- и межлабораторную воспроизводимость результатов данного теста, а также дает возможность избежать проведения дополнительного тестирования при возникновении каких-либо проблем (п. 4.1.6). Дозу ПК следует выбирать так, чтобы она не вызывала чрезмерной реакции воспаления кожи ушей или реакций системной токсичности. Положительный эффект ПК должен быть воспроизводимым, но не избыточным (ИС должен быть не больше 10). Предпочтительными веществами для использования в качестве ПК в тесте LLNA : BrdU : ELISA являются 25%-е растворы гексил-коричного альдегида (CAS N 101-86-0) или евгенола (CAS N 97-53-0) в смеси ацетона с оливковым маслом (4:1, v/v).

4.1.6. Возможны ситуации, в которых реакция животных на ПК проверяется время от времени (например, не реже одного раза в полгода), в частности для лабораторий, использующих метод LLNA : BrdU : ELISA регулярно и имеющих достаточную архивную базу экспериментальных данных, демонстрирующую способность лаборатории получать воспроизводимые результаты (в архивной базе должны быть результаты как минимум 10 отдельных опытов с использованием ПК, проводившихся не реже чем один раз в год).

4.1.7. Однако исследователи должны понимать, что решение применять ПК на периодической основе вместо постоянного параллельного использования сказывается на уверенности в том, что новые вещества, тестировавшиеся в промежутке между опытами с включением ПК и давшие в них отрицательный результат, действительно не обладают способностью к кожной сенсибилизации. В частности, если при периодическом использовании ПК вдруг обнаружится сбой системы в виде ложноотрицательного эффекта в группе животных ПК, под сомнением окажутся не только результаты данного эксперимента, но и результаты всех остальных, проведенных в промежутке между данным экспериментом и последним из тех, в которых ПК давал ожидаемый положительный эффект.

4.1.8. Всегда следует включать параллельно группу ПК, если возникают какие-либо изменения в процедуре проведения LLNA : BrdU : ELISA (например: замена обученного персонала, смена поставщиков материалов, реагентов и лабораторных животных, замена используемого оборудования).

4.1.9. Если ПК и тестируемое вещество наносятся в разных растворителях, следует включить в опыт контроли на оба растворителя.

4.1.10. В случаях, когда оцениваются исследуемые вещества определенного химического класса или диапазона ответных реакций, можно использовать в качестве ПК "реперные" вещества того же класса с известной активностью в LLNA : BrdU : ELISA.

4.2. Процедура исследования

Количество животных и выбор доз

4.2.1. В каждую экспериментальную группу включают, как минимум, 4 животных, всего тестируют, как минимум, 3 концентрации исследуемого вещества плюс параллельные группы негативного контроля (НК) для растворителей исследуемого вещества и положительного контроля (ПК). Уход и все манипуляции с животными в контрольных группах должны быть идентичны тем, которые используются для экспериментальных групп, за исключением введения самого тестируемого вещества.

4.2.2. Выбор доз тестируемого вещества и выбор растворителя должны быть основаны на рекомендациях. Последовательные дозы обычно выбираются из подходящего ряда концентраций, например 100, 50, 25, 10, 5, 2,5, 1, 0,5% и т.д. Следует предварительно изучить всю доступную информацию по токсичности данного вещества (например, острой токсичности и способности вызывать раздражение кожи), его структуре и физико-химическим свойствам, а также аналогичные характеристики близких по структуре веществ; на основании анализа этих данных выбирают три концентрации так, чтобы самая высокая концентрация вызывала как можно более выраженный эффект, но при этом не обладала системной токсичностью и/или не вызывала чрезмерного раздражения кожи на месте нанесения. При отсутствии такой информации может возникнуть необходимость в проведении предварительного пробного опыта (пп. 4.2.5-4.2.8).

4.2.3. Растворитель не должен искажать результаты исследования или косвенно влиять на них; следует выбирать растворитель по критериям максимальной растворимости в нем тестируемого вещества, но можно использовать и суспензии. Рекомендованы следующие растворители: смесь ацетона с оливковым маслом (4:1, v/v), N,N-диметилформамид, метилэтилкетон (бутанон), пропил енгликоль и диметил сульфоксид. Особое внимание следует уделить тому, чтобы водорастворимые вещества наносились на кожу в растворителе, хорошо смачивающем кожные покровы и тем самым не позволяющем тестируемому раствору быстро скатываться с поверхности кожи; для этого в растворы включают подходящие сурфактанты (например, 1% ПАВ L92).

4.2.4. Преимуществом данного метода является возможность проведения внутреннего контроля, для чего сравнивают состояние лимфоузлов одной и той же мыши на стороне нанесения препарата и на противоположной стороне; это позволяет оценить вариабельность эффекта у отдельных животных (п. 5.4). Анализ внутригрупповой вариабельности индивидуальных данных дает основания для объективной оценки возможности сокращения числа мышей в группе ПК. В некоторых странах органы надзора требуют предоставления индивидуальных данных по отдельным животным, а в других странах принимаются и усредненные данные по каждой экспериментальной группе.

Предварительные исследования

4.2.5. В отсутствии информации, позволяющей рассчитать максимальную дозу тестируемого вещества (п. 4.2.2), следует провести предварительное исследование для выявления подходящего диапазона доз. Цель предварительного исследования состоит в получении информации о системном (п. 4.2.8) и кожно-раздражающем (п. 4.2.7) эффектах изучаемого препарата.

4.2.6. Предварительное исследование проводится при условиях, идентичных условиям основного исследования метилэтилкетон, но оценка скорости пролиферации клеток лимфоузлов не проводится и количество животных в группе может быть меньшим. Рекомендуется использовать группы по одному или по два животных на каждую дозу. Массу тела регистрируют перед началом эксперимента и перед его завершением (День 6). Мышей ежедневно осматривают на предмет выявления любых клинических проявлений системной токсичности или местного раздражения на участке аппликации вещества, оценивая наличие эритемы в баллах с помощью таблицы [20]. Замеры толщины уха получают, используя калиброметр (например, электронный микрометр или стрелочный калиброметр Пикока), в День 1 (перед нанесением вещества), День 3 (спустя приблизительно 48 часов после первой дозы) и День 6. Кроме того, в День 6 толщину ушей можно дополнительно оценить путем взвешивания стандартного по площади образца ткани ушной раковины, полученного с помощью перфоратора после гуманного умерщвления животных. Раздражение кожи на месте аппликации вещества оценивается как чрезмерное при наличии эритемы с выраженностью в 3 и более баллов по шкале таблицы и/или при увеличении толщины уха на 25% и более по сравнению с первоначальной в любой день осмотра животных. В качестве максимальной дозы для основного исследования LLNA : BrdU : ELISA выбирают максимальную из тех доз предварительного исследования (п. 4.2.2), которые не вызывали признаков системной токсичности и/или чрезмерного местного раздражения кожи.

Таблица

Шкала оценки эритемной реакции

Наблюдение	Баллы
Нет эритемы	0
Очень слабая эритема (едва заметная)	1
Четко выраженная эритема	2
Эритема от умеренной до тяжелой	3
От тяжелой эритемы (свекольный цвет кожи) до образования язв, покрытых струпом, мешающим проводить классификацию эритемы	4

4.2.7. В дополнение к увеличению толщины уха на 25% и более по сравнению с первоначальной [26, 27], для идентификации веществ-ирритантов в LLNA : BrdU : ELISA также используется статистически значимое увеличение среднего значения толщины уха в группе экспериментальных мышей по сравнению с аналогичной величиной в группе контрольных мышей. Однако, если различия этих величин статистически достоверны, но составляют менее 25%, они не могут быть квалифицированы как свидетельство избыточного раздражения ткани уха данной дозой тестируемого вещества.

4.2.8. Следующие клинические наблюдения могут свидетельствовать о наличии системной токсичности тестируемых веществ [30] при их использовании в предварительной постановке метода LLNA : BrdU : ELISA: изменения в функции нервной системы (взъерошивание шерсти, атаксия, тремор, конвульсии); в поведении (агрессивность, изменения в уровне активности и в груминговой активности); в частоте и интенсивности дыхания (затрудненное дыхание, одышка, хрипы) и в потреблении пищи и воды.

Кроме того, следует регистрировать: признаки летаргии и/или апатии; любые клинические признаки, которые проявлялись как более чем эпизоды незначительной или мгновенной боли и дистресса; снижение массы тела более чем на 5% за период от Дня 1 до Дня 6; гибель животных. Умирающие животные или животные, очевидно страдающие от боли или показывающие признаки серьезного и устойчивого дистресса, должны гуманно умерщвляться.

План основного эксперимента

4.2.9. План Эксперимента следующий:

День 1

Определение и регистрация веса каждого животного и их визуальный осмотр. На тыльную сторону каждого уха мышей наносят по 25 мкл растворов исследуемого вещества в соответствующих разведениях, одного растворителя или ПК (если он проводится параллельно в каждом эксперименте; в противном случае берут данные последнего опыта с использованием ПК, в соответствии с пп. 4.1.5-4.1.8).

Дни 2 и 3

Повторить процедуру аппликации, выполненную в День 1.

День 4

Аппликаций не проводят.

День 5

Внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл раствора BrdU в концентрации 10 мг/мл (т.е. по 5 мг на мышь).

День 6

Регистрируют вес каждого животного и результаты его визуального осмотра. Примерно через 24 часа после введения BrdU производят гуманное умерщвление животных. Извлекают дренирующие околоушные лимфоузлы и помещают их забуференный физиологический раствор от каждого животного отдельно. В протокол исследования могут быть также включены дополнительные параметры контроля местных изменений кожи уха на месте аппликации, такие как баллы проявления эритемы или данные по толщине ушей (измеренной с помощью калибратора толщины уха или определения веса стандартных кусочков уха, полученных при некропсии с помощью перфоратора для взятия проб тканей ушной раковины).

Подготовка суспензии клеток

4.2.10. Суспензию отдельных клеток лимфоузлов (КЛУ), после их билатерального извлечения, получают путем мягкой механической дезагрегации, пропуская исследуемый материал через стальную сетку с ячейками размером около 200 микрон или любым другим способом, обеспечивающим получение суспензии отдельных клеток (например, раздавливая лимфоузлы пластиковым пестиком с последующим пропусканием через нейлоновую сетку с ячейками размером около 70 микрон). Процедура дезинтеграции лимфоузлов является критической стадией данного метода, поэтому каждый оператор должен отработать ее заранее. Особую осторожность следует проявлять при работе с лимфоузлами от контрольных животных, так как из-за их малого размера возможно проявление различных артефактов при определении величины ИС. Следует установить определенную величину конечного объема суспензии КЛУ (около 15 мл), рассчитанную так, чтобы среднее значение оптической плотности в контрольной группе составляло 0,1-0,2.

Определение клеточной пролиферации (измерение содержания BrdU в лимфоцитах)

4.2.11. Содержание BrdU в лимфоцитах измеряют методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческого тест-набора - например, "Cell proliferation ELISA, BrdU" производства Roche Applied Science (Mannheim, Germany), номер по каталогу 11 647 229 001. Принцип метода з