Приложение 6.2.3. Оценка субхронической токсичности при ингаляционном поступлении в 90-дневном исследовании

Приложение 6.2.3

Оценка субхронической токсичности при ингаляционном поступлении в 90-дневном исследовании

Идентичен международному документу OECD TG N 413 "Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study" (ОЭСР Руководство N 413 "Подострая токсичность при ингаляционном поступлении: 90-дневное исследование"). Принят 30 сентября 2008 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию субхронической токсичности при многократном ингаляционном воздействии в течение 90 дней.

1.2. Метод обеспечивает получение информации о субхронической токсичности вещества при вдыхании и надежных данных количественной оценки ингаляционного риска.

2. Общие положения

2.1. В настоящее время одним из основных путей поступления загрязнителей в организм является ингаляционный. Поэтому в комплексе исследований по воздействию химической продукции на организм человека изучение токсичности при вдыхании является ведущим.

2.2. Испытания субхронической ингаляционной токсичности предназначены для оценки токсичности испытуемого вещества при многократном ингаляционном воздействии в течение ограниченного периода времени и получения надежных данных количественной оценки ингаляционного риска.

2.3. Исследования субхронической ингаляционной токсичности предназначены главным образом для определения нормативных концентраций для оценки риска для человека в рабочих условиях. Они также могут использоваться для оценки бытовых, транспортных и экологических рисков. Настоящий метод позволяет охарактеризовать неблагоприятные эффекты, возникающие в результате повторяющегося ежедневного воздействия испытуемого вещества в течение 90 дней (приблизительно 10% продолжительности жизни крысы). Данные, полученные в результате проведения исследования субхронической токсичности, могут использоваться для количественной оценки риска и выбора концентраций для исследований хронической токсичности. Настоящий метод не предназначен для проведения испытаний наноматериалов.

3. Описание метода

3.1. Принципы

3.1.1. Для повышения качества исследования и минимизации количества привлеченных животных вся имеющаяся информация об исследуемом препарате должна находиться в распоряжении экспериментальной лаборатории до начала эксперимента. Информация, которая может помочь при выборе необходимых для испытания концентраций, включает тождественность, химическую структуру и физико-химические свойства испытываемого вещества; результаты опытов на токсичность in vivo или in vitro; предполагаемую область применения и вероятность воздействия на человека; если имеются, то данные (Q)SAR и сведения о токсичности структурно родственных препаратов. Если нейротоксичность ожидается или наблюдается в ходе исследования, руководитель исследования может включить соответствующие методы оценки эффекта, такие, как батарея функциональных наблюдений (серия нейрофизиологических и поведенческих тестов - FOB) и измерения двигательной активности. Хотя сроки проведения специфических исследований могут быть критическими, проведение дополнительных видов исследований не должно мешать целям основного исследования.

3.1.2. При изучении коррозионных и/или раздражающих продуктов необходимо избегать концентрации, которые могут вызвать сильную боль и страдания.

3.1.3. Коррозионный/раздражающий потенциал должен быть оценен при экспертизе имеющейся информации о воздействии на человека, экспериментальных животных, имеющихся данных в опытах in vitro, величине pH, информации о близких по структуре веществах или любых других данных с целью изучения целесообразности дальнейшего тестирования или его отмены.

3.1.4. При воздействии на животных целевые концентрации должны быть достаточно низкими с тем, чтобы не вызвать боль или нарушения, и достаточно высокими с тем, чтобы расширить кривую концентрация-ответ до уровней, которые соответствуют нормативным и научным целям исследования. Данные концентрации должны быть выбраны отдельно в каждом случае; выбор концентрации должен быть обоснован.

3.1.5. Агонизирующие животные или животные, очевидно испытывающие боль или демонстрирующие признаки страдания и истощения, должны быть гуманно умерщвлены, если нет веских оснований для другого (такие причины должны быть отражены в отчете по исследованию). Агонизирующие животные рассматриваются как животные, погибшие во время испытания.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычно используемых лабораторных линий. Предпочтительно использовать крыс. В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

Подготовка

3.2.2. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. На день экспозиции испытываемого препарата животные должны быть в возрасте от 8 до 12 недель, диапазон колебания массы животных для каждого пола не должен превышать от средней массы животных, участвовавших в предыдущем испытании в такой же отрезок времени. Животные отбираются в случайном порядке и маркируются, что позволит идентифицировать каждое из них. Животных следует содержать в клетках в течение не менее 5 дней до начала испытания, чтобы позволить им адаптироваться к лабораторным условиям. Животным также необходимо дать короткое время приспособиться к исследуемому прибору до начала испытания с целью уменьшить стресс от попадания в новую среду.

Содержание

3.2.3. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять , оптимальный уровень относительной влажности - 30-70%. В исследовании одного уровня концентрации животных можно поместить в одну камеру, но число животных в камере не должно затруднять возможность наблюдать за каждым из них, а также должно сократить вероятность потерь из-за каннибализма и борьбы. Свойства исследуемого препарата или токсичность (способность вызывать заболевание, возбуждать ЦНС) могут указывать на необходимость содержания животного в индивидуальной камере, чтобы предотвратить каннибализм. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания за исключением периода экспозиции испытываемого препарата, во время которого для животного необходимо обеспечить неограниченное потребление питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме: 12 ч при свете/12 ч в темноте.

3.3. Ингаляционные камеры

3.3.1. При выборе ингаляционной камеры необходимо учитывать природу исследуемого препарата и нормативные требования. По умолчанию используется интраназальная модель экспозиции (данный термин включает в себя воздействие только через голову, только через нос и только через мордочку). Экспозиция только через нос предпочтительна для изучения аэрозолей жидких и твердых и для паров, которые могут конденсироваться в форме аэрозолей. При этом для решения отдельных задач исследования целесообразно применять воздействие через все тело. Использование другой модели экспозиции помимо той, что применяется по умолчанию, должно быть обусловлено целями исследования и обосновано в отчете.

3.3.2. Для обеспечения атмосферы стабильности при использовании камеры объем, занимаемый телами тестируемых животных, не должен превышать 5% объема камеры.

3.4. Условия экспозиции

Введение концентраций

3.4.1. Воздействие только через нос на крысах может длиться до шести часов. Если подопытные животные - мыши, период выдержки не должен превышать 4 ч. Если требуется более длительный период экспозиции, необходимо привести обоснования. Животных, которые подвергаются воздействию препарата в камерах на все тело, следует содержать по отдельности, чтобы предотвратить проглатывание исследуемого препарата соседями по камере во время чистки. Пища во время экспозиции не дается. Воду можно давать в течение всего времени экспозиции на все тело.

3.4.2. Животные могут подвергаться воздействию исследуемого препарата в виде газа, паров, аэрозоля или их смеси. Исследуемое физическое состояние зависит от физико-химических свойств тестируемого препарата, выбранной концентрации и/или физической формы, которые наиболее приближены к реальным условиям использования изучаемого продукта. Гигроскопичный и химически реактивный препарат следует тестировать в условиях минимальной влажности, в отсутствии паров воды. Особое внимание следует уделять тому, чтобы не создавать взрывоопасные концентрации.

Гранулометрический состав

3.4.3. Определение размера частиц необходимо для всех аэрозолей и всех паров, которые могут конденсироваться и превращаться аэрозоль. Чтобы обеспечить воздействие на все важные области дыхательных путей рекомендуется использование аэрозоля с массовым средним аэродинамическим диаметром (MMAD) в диапазоне от 1 до 3 мкм с геометрическим стандартным отклонением в диапазоне от 1,5 до 3,0. В случае, если данное требование невозможно соблюсти, необходимо предоставить экспертную оценку. Например, металлические частицы в воздухе могут быть меньшего размера, чем стандартные, также заряженные частицы, волокна и гигроскопичные материалы (которые увеличиваются в размерах во влажной среде в респираторном тракте) могут превышать размер стандартных.

3.4.4. Для создания необходимой концентрации и размера частиц исследуемого препарата в атмосфере используется растворитель. В качестве растворителя предпочтительней использовать воду. При растворении испытуемого образца следует продемонстрировать его стабильность. Зернистый материал может быть подвергнут механическим процессам, чтобы добиться требуемого гранулометрического состава, при этом необходимо позаботиться о том, чтобы состав исследуемого препарата не разложился и не изменился. Если есть опасение, что в результате механических процессов состав тестируемого препарата претерпит изменения (например, чрезмерно высокая температура в процессе сильного дробления вследствие трения), то состав тестируемого препарата необходимо проверить при помощи анализа. При этом необходимо проследить, чтобы не занести в препарат загрязняющие вещества.

Контрольные животные

3.4.5. Животные отрицательной (воздух) контрольной группы должны подвергаться такому же обращению, как и животные подопытной группы, за исключением их экспозиции к профильтрованному воздуху, а не испытуемому веществу. При создании искусственной среды с использованием воды или другого вспомогательного вещества вместо отрицательной (воздух) контрольной группы должен применяться контроль с использованием растворителя. В качестве растворителя по возможности должна использоваться вода. При использовании воды в качестве растворителя контрольные животные должны подвергаться воздействию воздуха с той же относительной влажностью, что и подопытные животные. Выбор подходящего растворителя должен основываться на проведенном надлежащим образом предварительном исследовании или статистических данных. При отсутствии достаточной информации о токсичности растворителя руководитель исследования может одновременно использовать отрицательный контроль (воздух) и контроль с использованием растворителя, что, однако, крайне не рекомендуется. Если растворитель определяется как нетоксичный согласно ретроспективным данным, необходимость в использовании отрицательного контроля (воздух) отсутствует и используется только контроль с растворителем. Если предварительное исследование испытуемого образца, образованного при помощи растворителя, обнаруживает отсутствие токсичности, растворитель считается нетоксичным в испытуемых концентрациях и может использоваться в контроле.

Воздушные потоки в камере

3.4.6. Воздушные потоки, проходящие через камеру, необходимо тщательно контролировать, непрерывно наблюдать и фиксировать по меньшей мере раз в час на протяжении всего периода выдержки. Наблюдение за концентрацией исследуемого вещества в газовой среде (или устойчивостью) представляет собой интегральное вычисление всех динамических параметров и обеспечивает косвенные способы контроля всех значимых параметров для формирования динамической атмосферы. Необходимо избегать возвратного дыхания в камерах, предназначенных для воздействия через нос, в случаях, когда воздушные потоки через установку экспонирования недостаточны для динамических потоков исследуемого вещества в газовой среде. Существуют методы, при помощи которых можно установить, что возвратное дыхание при данных условиях эксперимента не имеет места. Концентрация кислорода должна составлять не менее 19%, концентрация углекислого газа - не менее 1%. Если есть основание полагать, что эти требования не удовлетворяются, концентрации кислорода и углекислого газа необходимо измерить.

Температура и относительная влажность в камере

3.4.7. Температура в камере должна составлять . Относительную влажность в зоне дыхания животных, находящихся в камерах, предназначенных как для воздействия только через нос, так и через все тело, необходимо наблюдать и фиксировать не менее трех раз в течение периода выдержки. Идеальная относительная влажность составляет 30-70%, но в определенных случаях (например, тестирование препарата на водной основе) данный уровень может быть неприменим или неизмеряем вследствие взаимовлияния исследуемого препарата и метода исследования.

3.5. Исследуемый препарат

Номинальная концентрация

3.5.1. По возможности следует наблюдать и фиксировать номинальную концентрацию при экспозиции в клетке. Номинальная концентрация - это масса сгенерированного испытываемого вещества, разбавленная общим объемом воздуха, проходящего через систему клетки. Номинальная концентрация не используется при описании экспозиции на животных, но сравнение номинальной и фактической концентраций позволит судить об эффективности генератора в испытательной системе и позволит вовремя выявить проблемы в нем.

Фактическая концентрация

3.5.2. Фактическая концентрация - это концентрация исследуемого препарата в зоне дыхания животных в ингаляционной камере. Фактическая концентрация может быть получена специальными методами (например, методом непосредственного выбора, адсорбционным методом или методом химической реактивности и последующим анализом) или неспециальными методами, например, гравиметрический капельный анализ. Использование гравиметрического анализа допустимо только для однокомпонентных порошкообразных веществ в аэрозольной упаковке или для жидких аэрозолей с невысокой летучестью и должно быть подкреплено предварительно полученными соответствующими специальными характеристиками исследуемого препарата. Концентрацию аэрозоля с многокомпонентным порошком можно также определить с помощью метода гравиметрического анализа. В этом случае потребуются данные анализа, подтверждающие, что состав аэрозольного препарата схож с составом исходного материала. Если подобная информация не имеется, может потребоваться повторный анализ исследуемого вещества (в воздухе) в определенные временные интервалы в течение исследования. Для аэрозольных агентов, которые могут испаряться или сублимироваться, необходимо указать, что для сбора всех этапов был использован выбранный метод. Цели, номинальная и фактическая концентрации должны быть указаны в отчете исследования, но в статистическом анализе для подсчета значения смертельной концентрации используется только фактическая концентрация.

3.5.3. Необходимо использовать только один препарат для тестирования, если это возможно, и исследуемый образец должен храниться в условиях, которые позволят сохранить его чистоту, однородность и стабильность. Перед началом исследования необходимо располагать описанием препарата, включая степень его чистоты и, если это технически возможно, указать и количество выявленных в нем примесей. Такие сведения можно наглядно показать с помощью следующих, но не ограничиваясь ими, данных: время удержания и относительная площадь пика, молекулярная масса, полученная методом масс-спектроскопии или газовой хроматографии и т.п. Хотя определение тестовых образцов не входит в обязанности испытательной лаборатории, возможно, целесообразно подтвердить поддерживающие характеристики, по крайней мере, в ограниченном виде (цвет, физическая природа и т.д.).

3.5.4. Воздушную среду нужно поддерживать максимально постоянной и проверять непрерывно и/или регулярно в зависимости от метода анализа. При регулярном контроле образцы проб атмосферы в камере нужно забирать не реже двух раз в четыре часа во время исследования. Если это невозможно вследствие ограниченных воздушных потоков или низкой концентрации, за все время проведения исследования допускается отбор одной пробы. Если образцы демонстрируют разные показатели, для следующих исследуемых концентраций нужно забирать четыре образца/экспозицию. Образцы концентрации для каждой камеры не должны отклоняться от средней концентрации более чем на для газов и паров или для жидких и твердых аэрозолей. Время для достижения равновесного состояния и перехода к распаду нужно измерить и зафиксировать. Период воздействия охватывает время генерации исследуемого вещества. При этом учитывается время, необходимое для достижения равновесного состояния в камере и перехода к распаду.

3.5.5. Сложные смеси из газов/паров и аэрозолей (атмосфера горения и тестируемый препарат, выталкиваемые из программного изделия/прибора конечного пользователя) на каждом этапе могут демонстрировать разное поведение в ингаляционной камере, поэтому по меньшей мере одна индикаторная субстанция (аналит), как правило, основная активная в исследуемом препарате, должна быть выбрана на всех этапах (газ/пар или аэрозоль). Когда тестируемый препарат является смесью (по составу), аналитическая концентрация должна быть описана для общего состава, а не только для активного ингредиента или компонента (вещества, определяемого при анализе).

3.5.6. Гранулометрический состав аэрозолей должен определяться как минимум еженедельно для каждого уровня концентрации при помощи каскадного импактора (пробоотборник частиц) или альтернативным инструментом (например, аэродинамическим спектрометром (APS). Гравиметрический фильтр или импинджер (прибор для измерения запыленности и загазованности) нужно использовать для подтверждения эффективности работы основного прибора, используемого для определения гранулометрического состава исследуемого вещества. Массовая концентрация, полученная ситовым анализом, должна находиться в разумных пределах массовой концентрации, полученной в результате анализа работы фильтров. Если удастся показать равнозначность результатов, полученных каскадным импактором и альтернативным инструментом, то допускается использование альтернативного инструмента в исследовании. Размеры частиц должны быть определены для паров, если есть вероятность, что их конденсация приведет к образованию аэрозоля, или если в парах обнаружены частицы с потенциалом смешанных фаз.

4. Процедура исследования

4.1. Предельные концентрации

4.1.1. В отличие от исследований острой токсичности предельные концентрации для исследований субхронической ингаляционной токсичности не определены. Максимальные концентрации испытуемого вещества определяются на основании: 1) максимально достижимой концентрации, 2) наиболее неблагоприятного уровня воздействия на человека, 3) необходимости поддержания достаточного запаса кислорода и/или 4) соображений благополучия животных. При отсутствии предельных значений, основанных на данных, могут использоваться предельные значения согласно системе GHS. При необходимости превышения этих пределов при исследовании газов или высоколетучих испытуемых веществ (например хладагентов) должно быть предоставлено обоснование.

4.2. Исследование по определению диапазона доз

4.2.1. Перед началом основной части исследования, как правило, необходимо провести исследование по определению диапазона доз. Исследование по определению диапазона доз является более подробным по сравнению с обзорным исследованием, поскольку оно не ограничивается выбором концентрации. Информация, полученная при определении диапазона доз, может способствовать успеху основного исследования. В частности, исследование по определению диапазона доз обеспечивает получение технической информации о методах анализа, дисперсности, механизмах токсичности, клинико-патологических и гистопатологических данных, а также данных о предположительных недействующих отрицательных дозах и минимальных токсических концентрациях для основного исследования. Руководитель исследования может провести исследование по определению диапазона доз для идентификации порога раздражения дыхательных путей (например, с использованием гистопатологического исследования дыхательных путей, теста легочных функций или бронхоальвеолярного лаважа), максимальной переносимой концентрации, не вызывающей чрезмерный дистресс у животных, а также параметров, наилучшим образом характеризующих токсичность испытуемого образца.

4.2.2. Исследование по определению диапазона доз может включать один или несколько уровней концентрации. В зависимости от избранных конечных точек каждый уровень концентрации может вводиться 3-6 мужским и 3-6 женским особям. Продолжительность исследования должна составлять не менее 5 и, как правило, не более 28 дней. Обоснование выбора концентраций для основного исследования должно приводиться в протоколе. Целью основного исследования является демонстрация соотношения концентрация-эффект на основании ожидаемой наиболее чувствительной конечной точки. При низкой концентрации в идеальном случае не должен наблюдаться неблагоприятный эффект, в то время как высокая концентрация должна однозначно выявлять токсичность, не вызывая при этом чрезмерный дистресс у животных и не сокращая срок их жизни.

4.2.3. При выборе концентраций для определения диапазона доз следует учитывать всю доступную информацию, включая соотношение структура-активность и данные о подобных химических веществах. Исследование по определению диапазона доз может подтвердить или опровергнуть предположение о наиболее чувствительных механистических конечных точках, таких как ингибиция холинэстеразы фосфорорганическими соединениями, образование метгемоглобина эритроцитотоксическими агентами, тиреоидные гормоны (, ) для тиреотоксических веществ, белок, лактатдегидрогеназа или нейтрофилы в бронхоальвеолярном смыве для безвредных слаборастворимых частиц или аэрозолей, вызывающих легочное раздражение.

4.3. Основное исследование

4.3.1. Основная часть исследования субхронической токсичности включает в себя три уровня концентрации с одновременным отрицательным (воздух) контролем и/или контролем с использованием растворителя в зависимости от необходимости. Каждая тестируемая группа состоит из 10 мужских и 10 женских особей грызунов, которые подвергаются воздействию испытуемого вещества в течение 6 ч в день 5 дней в неделю на протяжении 90-дневного периода (13 недель). Животные также могут подвергаться воздействию 7 дней в неделю (например, при испытании ингаляционных лекарственных препаратов). В испытании всегда используются мужские и женские особи, но вводимые концентрации для них могут быть различными, если известно, что один из полов обладает большей чувствительностью к данному испытуемому веществу. Таким образом, минимизируется вероятность чрезмерной смертности особей одного пола при высокой концентрации и/или отсутствия эффекта при низкой концентрации. При назальной экспозиции животных, принадлежащих к отличным от крысы видам, максимальные продолжительности введения должны подбираться так, чтобы обеспечить минимизацию проявлений дистресса, специфичных для данного вида. Следует предоставить обоснование для применения продолжительности введения менее 6 ч в сутки, а также при необходимости проведения исследования с длительной (22 ч в сутки) экспозицией всего тела [5]. Во время введения следует исключить кормление животных, если продолжительность введения не превышает 6 ч. При экспозиции всего тела животным можно давать воду.

4.3.2. Избранные целевые концентрации должны идентифицировать органы-мишени и демонстрировать четкое соотношение концентрация-эффект:

- высокий уровень концентрации должен показывать токсический эффект, но не вызывать устойчивые проявления летальности, препятствующие эффективной оценке результатов;

- средний уровень (средние уровни) концентрации подбирается таким образом, чтобы получить градацию токсических эффектов между низким и высоким уровнями;

- низкий уровень концентрации должен показывать слабые признаки токсичности или полное их отсутствие.

4.4. Промежуточное умерщвление

4.4.1. Если планируется промежуточное умерщвление, количество подопытных животных на каждом уровне концентрации следует увеличить на количество животных, подлежащих умерщвлению до окончания исследования. Необходимо предоставить обоснование промежуточных умерщвлений и надлежащим образом провести их статистический анализ.

4.5. Исследование обратимости токсических эффектов

4.5.1. Сопутствующее исследование может использоваться для наблюдения обратимости, стойкости или замедленного проявления токсических эффектов после воздействия в течение периода достаточной продолжительности, но не менее 14 дней. Группы исследования обратимости включают 10 мужских и 10 женских особей, подвергающихся введению испытуемого вещества одновременно с подопытными животными в основном исследовании. Группы исследования обратимости должны подвергаться воздействию максимальной концентрации испытуемого вещества. Одновременный контроль с воздухом и/или растворителем должен проводиться в соответствии с необходимостью.

4.6. Наблюдения

4.6.1. За всеми животными ведется клиническое наблюдение до, во время и после воздействия. В зависимости от реакции животных во время воздействия могут быть показаны более частые наблюдения. Если наблюдение затрудняется по причине использования фиксирующих капсул, плохого освещения в камерах для экспозиции всего тела или непрозрачной среды, за животными должно вестись тщательное наблюдение по окончании воздействия. Наблюдение перед следующим воздействием позволяет оценить проявления обратимости или обострения токсического эффекта. Время смерти или обнаружения умершего животного должно регистрироваться.

4.6.2. Результаты наблюдения за каждым животным должны регистрироваться отдельно. При отсутствии веских оснований для обратного животные, находящиеся в агональном состоянии либо проявляющие признаки сильных болей и/или продолжительного сильного дистресса, должны незамедлительно подвергаться эвтаназии из гуманных соображений. Время смерти умерших или умерщвленных в гуманных целях животных должно регистрироваться с максимально возможной точностью. При содержании животных в клетках должно производиться наблюдение за изменениями кожного покрова и шерсти, глаз, слизистых оболочек, изменениями в дыхательной и сердечно-сосудистой системах, автономной и центральной нервных системах, изменениями соматомоторной активности и моделей поведения. Следует обращать внимание на проявления тремора, конвульсий, слюноотделения, диареи, летаргии, сна и комы. Измерение ректальной температуры может использоваться для получения дополнительного подтверждения рефлекторного брадипноэ или гипо/гипертермии, связанных с экспериментальным воздействием или содержанием в клетке. В протокол исследования могут вноситься дополнительные параметры наблюдения, такие как кинетика, биомониторинг, легочная функция, удержание слаборастворимых веществ, скапливающихся в тканях легких, изменения в поведении.

4.6.3. Перед введением испытуемого вещества все животные, а по окончании введения животные контрольной группы и всех групп, подвергавшихся введению высоких концентраций, подлежат офтальмологическому обследованию глазного дна, светопреломляющего аппарата, радужной оболочки и конъюнктивы при помощи офтальмоскопа или аналогичного устройства. При обнаружении изменений глаз, обследованию подлежат все животные других групп, включая группу исследования обратимости.

4.6.4. Масса тела каждого животного должна регистрироваться непосредственно после первого воздействия (день 0) и затем дважды в неделю (как правило по пятницам и понедельникам для демонстрации восстановления после отсутствия воздействия в выходные дни), а также в момент смерти или эвтаназии. При отсутствии эффектов в течение первых 2 недель масса тела может измеряться один раз в неделю до окончания исследования. Животные в группах исследования обратимости (если таковые используются) должны взвешиваться еженедельно на протяжении периода восстановления. По окончании исследования все животные должны взвешиваться непосредственно перед умерщвлением для получения несмещенного расчета отношения массы органов к массе тела.

Патология

4.6.5. Все умерщвленные животные, включая животных контрольной группы и группы исследования обратимости, подлежат клинико-патологической оценке. Временной промежуток между окончанием воздействия и отбором крови на анализ должен регистрироваться, особенно в случае быстрого восстановления рассматриваемой конечной точки. Непосредственно после окончания введения следует проводить анализ параметров с коротким периодом полураспада в плазме (например, СОНb, СНЕ, и MetHb).

4.6.6. В табл. 6.2.3.1 перечислены основные клинико-патологические параметры, необходимые для токсикологического исследования. Анализ мочи не является частью стандартной процедуры, но может проводиться при необходимости в зависимости от ожидаемой или наблюдаемой токсичности. Руководитель исследования может на свое усмотрение провести оценку дополнительных параметров (например, холинэстеразы, липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина, креатинкиназы, миелоидно-эритроидного соотношения, тропонинов и газов артериальной крови) для более точной характеризации токсичности испытуемого вещества.

Таблица 6.2.3.1

Стандартные клинико-патологические параметры

Гематология
Количество эритроцитов	Общее количество лейкоцитов
Гематокрит	Дифференциальное количество лейкоцитов
Концентрация гемоглобина	Количество тромбоцитов
Средний эритроцитный гемоглобин	Потенциал свертывания (один параметр на выбор): Протромбиновое время
Среднее гематокритное число	Время свертывания
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците	Частичное тромбопластиновое время
Ретикулоциты
Тельца Гейнца
Клиническая биохимия
Сахар*	Аланинаминотрансфераза
Общий холестерин	Аспартатаминотрансфераза
Триглицериды	Щелочная фосфатаза или
Азот мочевины крови	Сорбитодегидрогеназа
Общий билирубин	Калий
Креатинин	Натрий
Лактатдегидрогеназа	Кальций
Общий белок	Фосфор
Альбумин	Хлорид
Глобулин
Анализ мочи (опционально)
Внешний вид (цвет и мутность)	Уровень pH
Объем	Общий белок
Удельный вес или осмотическая концентрация	Сахар
* Поскольку длительное голодание может привести к погрешностям измерения уровня сахара у опытных животных в сравнении с контрольными, руководитель исследования должен принять решение о целесообразности ограничения питания животных. Продолжительность периода голодания должна соответствовать используемому виду животных. Для крыс она может составлять 16 ч (ночное голодание). Определение уровня сахара может производиться после ночного голодания в течение последней недели введения или после ночного голодания перед некропсией (в последнем случае одновременно с изучением всех остальных клинико-патологических параметров)

4.6.7. Если нижние дыхательные пути (т.е. альвеолы) определяются как основное место осаждения и удержания токсических веществ, для количественного анализа предполагаемой зависимости доза-эффект относительно альвеолита, воспаления легких и фосфолипидоза может быть избран метод бронхоальвеолярного лаважа, позволяющий надлежащим образом проверить изменение зависимости доза-эффект и динамики поражения альвеол. Может быть проведен анализ бронхоальвеолярного смыва на общее и дифференциальное количество лейкоцитов, общий белок и лактатдегидрогеназу. Рассмотрению могут также подлежать другие параметры, являющиеся показателями лизосомальных повреждений, фосфолипидоза, фиброза, раздражающих и аллергических воспалений, включая определение провоспалительных цитокинов/хемокинов. Результаты бронхоальвеолярного лаважа дополняют, но не заменяют результаты гистопатологических исследований. Руководство по проведению бронхоальвеолярного лаважа приводится в документе [5].

4.6.8. Все подопытные животные, умершие во время испытания или исключенные из исследования из гуманных соображений, должны быть подвержены полному обескровливанию (если возможно) и некропсии. Время, прошедшее от окончания последнего введения испытуемого вещества до умерщвления животного, должно быть зарегистрировано. Если вскрытие невозможно провести непосредственно после обнаружения мертвого животного, труп должен храниться охлажденным (но не замораживаться) при достаточно низкой для минимизации автолиза температуре. Вскрытие должно проводиться как можно раньше, желательно в течение одного-двух дней. Для каждого животного должны быть зарегистрированы все макроскопические патологические изменения, особое внимание следует уделить любым изменениям дыхательных путей.

4.6.9. В табл. 6.2.3.2 перечислены органы и ткани, которые должны сохраняться в подходящей среде во время некропсии для гистопатологического исследования. Способ сохранения органов и тканей, указанных в [квадратных скобках], а также всех остальных органов и тканей, выбирается по усмотрению руководителя исследования. Щитовидная железа и придатки яичка должны только взвешиваться при необходимости, так как наличие артефактов на срезе может препятствовать гистопатологической оценке. Ткани и органы должны фиксироваться в 10%-м буферном формалине или другом подходящем фиксаторе непосредственно после вскрытия и не менее чем за 48 ч до подготовки срезов.

Таблица 6.2.3.2

Органы и ткани, сохраняемые при проведении некропсии

Трахея (как минимум, 2 уровня, включая один продольный срез через киль и 1 поперечный срез) Легкие (все доли на одном уровне, включая главные бронхи) Ткани носоглотки (как минимум, 4 уровня, один из которых должен включать носоглоточный проход) Назальноассоциированная лимфоидная ткань (НАЛТ) Гортань (3 уровня, включая основание надгортанника) Лимфатические узлы корня легкого, особенно при использовании слаборастворимого испытуемого вещества. Для более глубокого и/или иммунологического исследования могут рассматриваться дополнительные лимфатические узлы, например, средостенные, шейные/поднижнечелюстные и/или околоушные [Язык] Зубы Слюнные железы Пищевод Желудок Двенадцатиперстная кишка Тощая кишка Подвздошная кишка Слепая кишка Ободочная кишка Прямая кишка Печень Поджелудочная железа Желчный пузырь (при наличии) Мозг (включая срезы головного мозга, мозжечка и продолговатого мозга/моста) Гипофиз Обонятельная луковица (опционально) [Глаза (сетчатка, зрительный нерв) и веки] Периферический нерв (седалищный или большеберцовый, желательно расположенный близко к мышце) Спинной мозг (шейный, среднегрудной и поясничный отделы) Надпочечная железа Щитовидная железа Околощитовидная железа Сердце Аорта Костный мозг (и/или свежий аспират) Селезенка Вилочковая железа Лимфатические узлы (удаленные от места введения) Почки Мочевой пузырь [Мочеточник] [Мочеиспускательный канал] Предстательная железа Семенники [Придатки яичка] Семенные пузырьки Матка Яичники Кожа Молочная железа (у женских особей) Мышцы (бедро) [Гардериановы железы] [Слезные железы (экстраорбитальные)] Бедренный и коленный сустав Грудина Органы-мишени Все макроскопические повреждения и опухолевидные образования

4.6.10. Легкие извлекаются целиком, взвешиваются и заполняются подходящим фиксатором под давлением 20-30 см водяного столба приблизительно на 80-90% общего объема для сохранения легочной структуры. Срезы производятся на одном уровне для всех долей, включая главные бронхи, но в случае проведения лаважа легких срезы не подвергавшейся лаважу доли производятся на трех уровня (не серийные срезы).

4.6.11. Исследованию подлежат как минимум 4 уровня тканей носоглотки, один из которых должен включать носоглоточный проход для надлежащего исследования плоского, переходного (нереснитчатого респираторного), респираторного (реснитчатого респираторного) и обонятельного эпителия, а также дренирующей лимфоидной ткани (NALT). Исследуются три уровня гортани, один из которых должен включать основание надгортанника. Исследуются как минимум два уровня трахеи, включая продольный срез через киль бифуркации внелегочных бронхов и один поперечный срез.

4.6.12. Гистопатологическая оценка всех перечисленных в табл. 6.2.3.2 тканей и органов должна проводиться для контрольной группы и групп, подвергавшихся воздействию высоких концентраций, а также для всех животных умерших или умерщвленных во время исследования. Особое внимание должно уделяться дыхательным путям, органам-мишеням и макроскопическим повреждениям. При наличии повреждений органов и тканей у животных, подвергавшихся воздействию высоких концентраций, те же органы и ткани должны быть исследованы во всех остальных группах. Руководитель исследования может проводить гистопатологическую оценку дополнительных групп для демонстрации четкого отношения концентрация-эффект. При использовании группы исследования обратимости следует провести гистопатологический анализ всех тканей и органов, продемонстрировавших эффекты в подопытных группах. Если в группе, подвергавшейся воздействию высокой концентрации, наблюдается чрезмерное количество ранних смертей или другие проблемы, снижающие значимость полученных данных, гистопатологическому исследованию подлежит следующая более низкая концентрация. Следует предпринять попытку сопоставления результатов макроскопического и микроскопического исследования.

5. Данные и отчет

5.1. Данные об исследовании

5.1.1. Для каждого животного следует предоставить индивидуальные данные о массе тела, потреблении пищи, клинической патологии, макроскопической патологии, массе органов и гистопатологии. Данные клинических наблюдений суммируются в форме таблицы с указанием для каждой экспериментальной группы количества использованных животных, количества животных, демонстрирующих специфические признаки токсичности, количества животных, умерших во время исследования или умерщвленных в гуманных целях, времени смерти отдельных животных, описания и продолжительности токсических эффектов и обратимости, а также результатов вскрытия. Все результаты, количественные и побочные, должны оцениваться при помощи подходящего статистического метода. Допустимо применение любого общепринятого статистического метода, выбор которого производится в процессе составления плана исследования.

5.2. Отчет об исследовании

Отчет об исследовании должен включать следующие данные.

Подопытные животные и их содержание:

- описание условий содержания в клетке, включая количество (или изменения в количестве) животных в клетке, материал подстилки, температуру окружающей среды и относительную влажность, световой период и обозначение диеты;

- используемые виды/линии и обоснование для использования других видов, кроме крыс;

- количество, возраст и пол животных;

- метод рандомизации;

- подробности о качестве пищи и воды (включая тип/источник диеты, источник воды);

- описание условий содержания перед началом испытания, включая диету, карантин и лечение от болезни.

Исследуемый препарат:

- физическая природа, наличие примесей и, если значимо, физико-химические свойства (включая изомеризацию);

- идентификационные данные и регистрационный номер в Реферативной службе по химии (CAS), если таковой имеется.

Растворитель:

- обоснования для использования растворителя и обоснование для выбора растворителя (если это иное, чем вода);

- справочные или совпадающие данные, подтверждающие, что растворитель не влияет на результаты исследования.

Ингаляционная камера:

- описание ингаляционной камеры, включая размеры и объем;

- описание и поставщик оборудования, используемого для экспозиции животных, а также генерация атмосферы;

- оборудование для измерения температуры, относительной влажности, размера частиц и фактической концентрации;

- источник поступления воздуха и обработка поступившего/извлеченного воздуха, и система кондиционирования;

- методы, используемые для поверки оборудования с целью обеспечить гомогенность в тестируемой атмосфере;

- перепады давления (положительные или отрицательные);

- отверстия для экспозиции в камере (только через нос); размещение животных в системе (воздействие через все тело);

- временная гомогенность/стабильность тестируемой атмосферы;

- место размещения датчиков, определяющих температуру и относительную влажность, отбор образцов тестируемой атмосферы в клетке;

- скорость потоков воздуха, скорость потока воздуха/отверстия для экспозиции (только через нос) или нагрузка животных/клетка (для воздействия через все тело);

- время, рекомендуемое для достижения равновесия в ингаляционной камере ;

- количество изменений объема в час;

- приборы, снимающие показания (если применены).

Данные экспозиции:

- обоснование для выбора целевой концентрации в основном исследовании;

- номинальные концентрации (общая масса исследуемого препарата, сгенерированного в ингаляционной камере, разделенная на объем воздуха, проходящего через камеру);

- фактическая концентрация тестируемого препарата, собранного из зоны дыхания животных. Для исследуемых смесей, которые продуцируют гетерогенные физические формы (газы, пары, аэрозоли), каждая форма может быть проанализирована отдельно;

- все воздушные концентрации должны быть указаны в отчете в единицах массы (например, мг/л, и т.д.); в скобках допускается указание их в единицах объема (например, промилле, часть на млрд и т.д.);

- гранулометрический состав, средний аэродинамический диаметр (MMAD) и геометрическое стандартное отклонение , включая методы из вычисления. Индивидуальный гранулометрический анализ должен быть изложен в отчете.

Условия проведения исследования:

- подробные сведения о приготовлении тестируемого препарата, включая данные о мероприятиях по уменьшению размера частиц для твердых материалов или по приготовлению растворов исследуемого препарата. В случае, когда есть вероятность, что механические процессы изменят состав исследуемого вещества, необходимо включить результаты анализов для подтверждения состава тестируемого вещества;

- описание оборудования (предпочтительно с диаграммой), используемого для генерации исследуемой атмосферы и для экспозиции животных в этой атмосфере;

- подробные сведения об оборудовании, используемом для наблюдения за температурой в камере, относительной влажностью, воздушными потоками;

- подробные сведения об оборудовании, используемом для забора образцов для вычисления концентрации в камере и гранулометрического состава;

- подробные сведения об используемом химико-аналитическом методе и проверке достоверности метода (включая эффективность восстановления тестируемого препарата из питательной среды, в которую были помещены образцы;

- метод случайной выборки животных для включения в испытательную и контрольную группы;

- обоснование для выбора исследуемой концентрации.

Результаты:

- сведение в таблицу данных о температуре в камере, уровне влажности и воздушном потоке;

- сведение в таблицу данных о номинальной и фактической концентрации;

- сведение в таблицу данных о размере частиц, включая собранные сведения об аналитических образцах, распределение размеров частиц, подсчеты ММАД и ;

- сведение в таблицу данных о реакции и уровне концентрации для каждого животного (т.е. признаки токсического отравления у животного, включая агонию, природу, тяжесть, время появления и продолжительность эффектов);

- индивидуальная масса тела животных, полученная в дни проведения эксперимента;

- дата и время смерти, динамика появления признаков токсичности, предшествовавших умерщвлению, их обратимость для каждого животного;

- табличное представление данных клинической патологии;

- табличное представление результатов некропсии и гистопатологического исследования каждого животного, если таковые имеются;

- табличное представление любых других измеренных параметров.

Обсуждение и интерпретация результатов:

- особое внимание необходимо уделить описанию исследований на соответствие требованиям данного метода, например, таких как к предельно допустимой концентрации или размерам частиц;

- пригодность частиц для вдыхания, принимая во внимание общие данные, должна быть адресной, особенно если требования к размерам частиц не соблюдены;

- если на основании критериев по определению гуманной конечной точки была необходимость в гуманном умерщвлении животного, испытывающего боль или проявляющего признаки страдания, нужно привести объяснения;

- последовательность методов, используемых для определения номинальной и фактической концентрации, а также зависимость фактической концентрации от номинальной, должна быть включена в общую оценку исследования;

- следует рассмотреть возможную причину смерти и преобладающий способ действия (системный или локальный);

- определить целевые органы;

- определить недействующую отрицательную дозу и пороговый уровень воздействия.