Приложение 6.3.2. Изучение хронической токсичности при ингаляционном поступлении

Приложение 6.3.2

Изучение хронической токсичности при ингаляционном поступлении

Идентичен международному документу OECD TG N 452 "Chronic Toxicity Studies" (ОЭСР Руководство N 452 "Исследования хронической токсичности"). Принят 7 сентября 2009 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения исследования хронической токсичности химических веществ и продукции на их основе (далее - веществ) при ингаляционном поступлении.

1.2. Исследование хронической токсичности предоставляет информацию о возможной опасности для здоровья, вероятно, возрастающей от повторяющихся воздействий в течение большей части продолжительности жизни грызунов. Исследование позволяет выявить данные о токсическом воздействии вещества, определить органы-мишени. Также в ходе его определяют наивысший уровень воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), что может быть использовано для установления критерия безопасности воздействия на организм человека. Следует также подчеркнуть необходимость тщательного клинического наблюдения за животными для получения максимально возможного количества информации.

1.3. В проведении исследования хронической токсичности необходимо всегда придерживаться основополагающих принципов и соображений, изложенных в Руководстве ОЭСР N 19 [45].

1.4. Метод выбора основной концентрации зависит от первоначальных целей или задач исследования. При выборе подходящего уровня концентрации должен быть достигнут баланс между риском отсева с одной стороны и характеристикой ответных реакций на низкие концентрации и их значимость - с другой.

1.5. Проведение комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности требует большего анализа в сравнении с исследованиями хронической токсичности и канцерогенности, проводимыми раздельно. Следует внимательно отнестись к принципам выбора при проведении комбинированного исследования хронической токсичности и канцерогенности. Раздельные исследования могут являться необходимыми по определенным нормативным требованиям.

2. Общие положения

2.1. Данный метод исследования предназначен, прежде всего, для исследований, осуществляемых на грызунах. Если проведение таких исследований потребуется на особях другого вида, изложенные принципы и методы также могут быть использованы, с надлежащими изменениями, в соответствии с целями и Руководством ОЭСР N 116.

2.2. До начала проведения исследования испытательной лабораторией должна быть проанализирована вся доступная информация по исследуемому веществу и с тем, чтобы сфокусировать план исследования на более успешное тестирование возможной хронической токсичности и минимизировать использование животных. Данные, которые будут содействовать проведению исследования, включают: идентификацию, химическую структуру и физико-химические свойства исследуемого вещества; любую информацию о механизме действия; результаты любых in vitro и in vivo исследований токсичности; предполагаемое использование и вероятное воздействие на человеческий организм; доступные данные испытаний (Q)SAR и токсические свойства структурно родственных веществ; имеющиеся токсикокинетические данные (однократная доза, а также кинетика повторной дозы, при наличии) и данные, полученные из других исследований повторного воздействия. Изучение хронической токсичности может быть проведено после получения первоначальных данных по изучению токсичности повторной дозы в течение 28 и/или 90 дней. Поэтапный подход к исследованию хронической токсичности следует рассматривать как часть общей оценки возможного неблагоприятного воздействия вещества на здоровье человека.

2.3. Цели исследований хронической токсичности, охватываемые настоящими методическими рекомендациями, включают:

- определение опасных свойств химических веществ;

- определение органов-мишеней;

- описание зависимости концентрация-ответ;

- определение наивысшего уровня воздействия, при котором не наблюдается вредный эффект (NOAEL), или исходной точки для установления статистически достоверного нижнего предела концентрации, которая предопределяет изменения в ответных реакциях на вредное воздействие, что соответствует (ВМС);

- прогнозирование хронической токсичности на уровне организма человека при ингаляционном поступлении вещества;

- предоставление данных для проверки гипотез относительно механизма действия.

3. Описание метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество вводится ежедневно порциями нескольким группам подопытных животных в течение 12 месяцев, хотя можно также избрать более длительный или короткий периоды. Этот период был выбран в связи с тем, что он достаточен для того, чтобы стали очевидны любые проявления кумулятивной токсичности, не смешиваясь при этом с проявлениями возрастных изменений. Отклонение от продолжительности воздействия в 12 месяцев должно быть обосновано, особенно в случае сокращения срока. Тестируемое вещество вводится ингаляционно.

3.1.2. План исследования может также включать одно или несколько промежуточных умерщвлений, например, к 3 и 6 месяцам. Для этого необходимо добавить дополнительные группы животных.

3.1.3. В течение периода приема вещества животных тщательно обследуют на предмет выявления признаков интоксикации. Животные, которые умерли или были умерщвлены в ходе тестирования, подвергаются аутопсии. По окончании исследования выживших животных умерщвляют и также проводят аутопсию.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Данный метод исследования охватывает главным образом оценку и анализ хронической ингаляционной токсичности на грызунах, хотя подобные исследования на негрызунах могут понадобиться в соответствии с определенными нормативными требованиями. Выбор вида животных должен быть обоснован. План и проведение исследования хронической токсичности на видах негрызунов, когда это необходимо, должны быть основаны на принципах, содержащих в данном стандарте. Дополнительная информация по выбору вида и рода экспериментальных животных содержится в Руководстве ОЭСР N 116.

3.2.2. Предпочтительным видом грызунов являются крысы, хотя могут использоваться и другие виды, например, мыши. Крысы и мыши были выбраны в качестве экспериментальных моделей за их сравнительно короткую продолжительность жизни, широкое применение в фармакологических и токсикологических исследованиях, их восприимчивость к индукции новообразований и доступность этих хорошо изученных видов. Вследствие этих качеств, имеется большое количество информации об их психологии и патологии. Следует использовать молодых здоровых взрослых животных лабораторных видов. Исследование хронической токсичности следует проводить на животных того же рода и того же происхождения, что и животные, использовавшиеся в предварительных токсикологических исследованиях небольшой продолжительности. Женские особи должны быть нерожавшими и не беременны.

Подготовка

3.2.3. Должны использоваться здоровые животные, которые прошли адаптацию в лабораторных условиях как минимум в течение 7 дней и над которыми прежде не ставились эксперименты. В случае с грызунами, введение концентрации следует начинать как можно раньше, после отлучения от матери и акклиматизации, желательно, до того как животным исполнится 8 недель. Тестируемые животные должны быть описаны по роду, виду, происхождению, полу, массе и возрасту. В начале исследования разница в массе подопытных животных должна быть минимальна и не превышать от средней массы всех животных, задействованных в исследовании, отдельно каждого пола. Животные должны быть случайным образом распределены на контрольную и тестовую группы. После распределения заметной разницы в средней массе между группами каждого пола быть не должно. Если же она имеется, следует, по возможности, повторить распределение. Каждое животное должно быть помечено индивидуальным идентификационным номером, и этот номер следует нанести на перманентной основе, с помощью татуировки, вживления микрочипа или другим соответствующим способом.

Содержание

3.2.4. Животные должны находиться отдельно или содержаться в клетках небольшими группами одного пола. Отдельное проживание следует применять только, если это научно обосновано. Клетки надо размещать таким образом, чтобы свести к минимуму возможное влияние их местоположения. Температура в помещении с экспериментальными животными должна быть . Относительная влажность должна быть как минимум 30% и не должна превышать 70% (если только не проводится уборка помещения) оптимальная влажность - 50-60%. Свет должен быть искусственным, с последовательностью: 12 ч - свет, 12 ч - темнота. Для кормления могут использоваться традиционные лабораторные диеты с неограниченным количеством питьевой воды. Диета должна отвечать всем потребностям в питании тестируемого вида. Содержание загрязняющих веществ, которые могут повлиять на результаты исследования (остатки пестицидов, стойкие органические загрязнители, фитоэстрогены, тяжелые металлы и микотоксины) должны быть, по возможности, минимизированы. Аналитические данные по питанию и уровню загрязняющих веществ в пище должны собираться периодически, как минимум в начале исследования и когда меняется используемая партия, и их необходимо включать в заключительный отчет. Должны также предоставляться аналитические данные по питьевой воде, используемой в исследовании.

3.3. Основное исследование

Количество и пол

3.3.1. Должны использоваться животные обоих полов. Следует использовать такое количество животных, чтобы по окончании исследования в каждой группе оставалось достаточное их количество для биологического и статистического анализов. Как правило, грызунов - минимум 20 животных, а негрызунов - как минимум по 4 животных в каждой группе каждого пола для каждого уровня концентрации.

3.3.2. В исследованиях, где задействованы мыши, может возникнуть необходимость в дополнительных животных в каждой группе для проведения всех необходимых гематологических анализов. В зависимости от цели исследования можно увеличить статистическую значимость основных показателей, распределив неравномерно животных по концентрациям.

Резерв для промежуточных умерщвлений, вспомогательные группы и индикаторные животные

3.3.3. При исследовании необходимо сделать резерв для промежуточных умерщвлений, например, в 6 месяцев, для получения данных о развитии токсических изменений и данных о механизме воздействия, если это научно обосновано. Также нужно задействовать вспомогательные группы для отслеживания обратимости любых токсических изменений, вызванных химическими веществами при исследовании. Как правило, их распределяют на группу с самым высоким уровнем концентрации и контрольную группу. Если запланировано промежуточное умерщвление, количество животных, включенных в план исследования, должно быть увеличено на число животных, которое планируется умертвить до завершения исследования. Этим животным необходимо провести такое же обследование (включая массу тела, потребление воды и пищи, гематологические и клинические биохимические показатели, выявление патологий), как и животным в стадии хронической токсичности основного исследования. Нужно также сделать резерв (в группах промежуточного умерщвления) для измерений, ограниченных особыми, ключевыми показателями, такими как нейротоксичность или иммунотоксичность.

Концентрация

3.3.4. Необходимо использовать как минимум три уровня концентрации и параллельный контроль, за исключением тех случаев, когда проводится исследование с максимально возможной концентрацией. Чаще всего при выборе уровней концентрации основываются на результатах краткосрочных исследований повторной концентрации или исследованиях по обнаружению диапазона концентраций. Необходимо принимать во внимание любые существующие токсикологические и токсикокинетические данные по тестируемому или родственным ему веществам.

3.3.5. Если нет ограничений по физико-химической природе или биологическому воздействию исследуемого вещества, должна быть выбрана самая высокая концентрация для определения основных органов-мишеней и токсичных эффектов воздействия. Однако следует избегать страданий, тяжелой токсичности, болей или смерти. Самый высокий уровень концентрации следует выбрать для получения признаков интоксикации, как, например, о токсичности свидетельствуют изменения уровня сывороточного фермента или невозможность набрать массу (примерно 10%).

3.3.6. В зависимости от целей исследования нужно выбрать наивысшую концентрацию ниже, чем концентрация, подтверждающая наличие токсичности, например, если концентрация вызывает побочное действие, которое, тем не менее, слабо отражается на продолжительности жизни или массе тела.

3.3.7. Разница между концентрациями должна быть направлена на определение зависимости концентрация-ответ и установление наивысшего уровня концентрации, при которой не наблюдается вредный эффект воздействия (NOAEL), или других предполагаемых результатов исследования, например ВМС при самом низком уровне концентрации. Условия, которые должны быть приняты во внимание при установлении нижних концентраций, включают: предполагаемый наклон кривой зависимости концентрация-ответ, концентрации, при которых могут происходить важные изменения в метаболизме или вид токсического действия, когда предполагается пороговая величина, или когда предполагается исходная точка для экстраполяции низкой концентрации.

3.3.8. Избранная разница в уровне концентрации зависит от параметров тестируемого вещества. Диапазон 2-4 зачастую оптимален для установления снижения уровней концентрации, а при использовании очень больших интервалов (например, диапазон примерно 6-10) между концентрациями предпочтительно добавление четвертой тестируемой группы. При выборе концентрации и разницы в уровнях концентраций следует использовать Руководство ОЭСР N 116, но в целом следует избегать использования диапазона выше 10, а его применение должно быть обосновано.

3.3.9. При выборе концентрации для проведения исследований хронической токсичности и канцерогенности необходимо учесть:

- знания или предположения о нелинейностях или точках изгиба в зависимости концентрация-ответ;

- фармакокинетику и концентрацию, когда метаболическая индукция, насыщение или нелинейность между внешними и внутренними концентрациями происходят или не происходят;

- признаки поражения, влияния или показатели воздействия на основные биологические процессы;

- основные (или предполагаемые) проявления механизма действия, как то концентрация, при введении которых начинает увеличиваться цитотоксичность, нарушается гормональный уровень, подавляется гомеостатический механизм и т.д.;

- интервалы кривой концентрация-эффект, где необходима чрезвычайно надежная оценка, например, в пределах ожидаемых ВМС или предполагаемых пороговых величин;

- уровни анализа предполагаемого воздействия на организм человека.

3.3.10. Контрольная группа не должна получать исследуемое вещество. С животными из контрольной группы следует обращаться также, как и с тестируемыми группами. Если используется среда, контрольная группа должна получать ее в максимальном объеме от используемого в группах.

3.3.11. При желании, для самок на протяжении периода беременности дозировка может быть установлена в зависимости от массы тела в 0-й или 5-й день беременности.

Введение исследуемого вещества

3.3.12. Исследуемое вещество вводится ингаляционно. Способ и метод введения зависят от цели исследования, физическо-химических свойств вещества, его биологической усвояемости и основного способа и метода введения в организм человека. Целесообразность способа и метода введения должна быть обоснована.

3.3.13. При ингаляционном введении животные получают концентрацию исследуемого вещества ежедневно (семь дней в неделю), на протяжении как минимум 6 ч, как правило, в течение 1 года. Любой другой режим концентрации, например, пять дней в неделю, должен быть обоснован.

Продолжительность исследования

3.3.14. Несмотря на то, что данный метод рассчитан на 12-месячное исследование хронической токсичности, план исследования допускает применение как более короткого (например, 6 или 9 месяцев), так и более длинного (например, 18 или 24 месяца) периода исследования в зависимости от целей и задач эксперимента. Отклонения от продолжительности воздействия в 12 месяцев должны быть обоснованы, особенно в случае сокращения сроков. Вспомогательные группы, включенные для наблюдения за обратимостью любых токсических изменений, вызванных химическим веществом, следует держать без концентраций не менее 4 недель, но не более одной трети от общего периода исследования после прекращения воздействия.

3.4. Наблюдения

3.4.1. Все животные должны исследоваться на предмет болезненности или смерти и на наличие особых токсикологических значимых признаков, в частности нейрофункциональных и нейроповеденческих, обычно в начале и конце каждого дня. Дополнительно, как минимум один раз, животные должны проверяться в выходные и праздничные дни. Общее клиническое наблюдение должно осуществляться как минимум один раз в день, предпочтительно в одно и то же время, принимая во внимание период максимума предполагаемого воздействия концентрации. Клиническое состояние животных следует фиксировать.

3.4.2. Подробное клиническое наблюдение должно быть проведено как минимум один раз до начала воздействия (учитывая предмет исследования), к концу первой недели исследования и впоследствии ежемесячно. Протокол наблюдений должен быть согласован так, чтобы обеспечить минимальную разницу между отдельными наблюдателями, и независимость от тестовой группы. Эти обследования необходимо делать вне клетки, каждый раз в одном месте, в одно и то же время. Их следует тщательно фиксировать, желательно используя систему количественных показателей, четко оговоренную испытательной лабораторией. Необходимо следить за тем, чтобы варьирование в условиях наблюдения было минимальным. Отмеченные признаки должны включать, но не только, изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, возникновение секреции и экскреции и автономной активности (например, слезоотделение, пилоэрекция, размер зрачка, аномальный способ дыхания). Изменения в походке, положении тела, реакции на прикосновение, как и наличие клонических или тонических движений, стереотипах (например, чрезмерное умывание, однообразные движения по кругу) или аномалиях поведения (например, членовредительство, хождение задом наперед) также должны регистрироваться.

3.4.3. Офтальмологический осмотр с использованием офтальмоскопа или другого подходящего инструмента необходимо проводить всем животным до первого введения исследуемого вещества. По окончании исследования этот осмотр проводится всем животным, но, как минимум, группе с высокой концентрацией и контрольной группе. Если обнаружены изменения, имеющие отношение к терапии, следует осмотреть всех животных. Если структурный анализ или другие данные говорят об офтальмологической токсичности, тогда частота офтальмологических осмотров должна быть увеличена.

3.4.4. Для химических веществ, для которых предварительные исследования на токсичность с повторным приемом концентрации в течение 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать нейротоксическое воздействие, сенсорную химическую активность к раздражителям различного типа (например, слуховые, визуальные и проприоцептивные раздражители), оценку силы захвата и двигательной активности можно проводить, по выбору, до начала исследования и затем в 3, 6, 9 и 12 месяцев. Однако можно использовать и другие, не приведенные в списке процедуры.

3.4.5. Для химических веществ, где предварительные исследования на токсичность с повторным приемом концентрации через 28 и/или 90 дней показали потенциальную возможность оказывать иммунотоксическое воздействие, дальнейшие исследования этого результата могут по желанию проводиться до 12 месяцев.

Масса тела, потребление пищи/воды и питательность пищи

3.4.6. Все животные должны взвешиваться в начале исследования, как минимум, раз в неделю первые 13 недель и, как минимум, ежемесячно в дальнейшем. Измерения потребления пищи и питательности пищи следует производить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем. Необходимо также учитывать потребление воды для исследований, в которых активность потребления воды изменяется. Измерения потребления воды следует проводить еженедельно первые 13 недель и как минимум ежемесячно в дальнейшем, когда вещество вводится через питьевую воду.

Гематология и клиническая биохимия

3.4.7. В исследованиях, в которых используются грызуны, гематологические исследования необходимо проводить как минимум на 10 самцах и 10 самках каждой группы в 3, 6 и 12 месяцев, всегда используя одних и тех же животных. В случае с мышами могут потребоваться вспомогательные животные с тем, чтобы проводить все необходимые гематологические исследования. В исследованиях с негрызунами пробы берутся у меньшего количества животных (например, 4 особи каждого пола каждой группы в случае с исследованием собак). Нет необходимости проводить измерения в три месяца, если за предыдущие 90 дней при аналогичном уровне концентрации не наблюдалось воздействия на гематологические параметры. Образцы должны быть собраны к концу запланированного периода исследования, в период исследования к 3 и 6 месяцам и к 12 месяцу непосредственно перед или во время процедуры умерщвления животных. Пробы крови следует брать из указанных мест, например, сердечная пункция или из ретро-глазной пазухи и, по возможности, хранить в подходящих условиях. Необходимо исследовать приведенный список параметров: общая и лейкоцитарная формула, содержание эритроцитов, содержание тромбоцитов, концентрация гемоглобина, гематокрит (гематокритное число), среднее гематокритное число (MCV), среднее содержание гемоглобина в эритроцитах (МСН), концентрация гемоглобина в эритроцитах (МСНС), протромбиновое время и время образования и активности тромбопластина. Кроме того, необходимо исследовать тельца Гейнца или другую атипичную морфологию эритроцитов и метгемоглобин, если присутствуют любые признаки анемии или других нарушений кроветворения. Если химические вещества оказывают влияние на кроветворную систему, можно также измерить число ретикулярных клеток и цитологию костного мозга, хотя они не обязательны для регулярного проведения.

3.4.8. Клинические биохимические показатели при исследовании токсического воздействия на ткани