Приложение 6.8.7. Генетическая токсикология: Метод доминантных леталей на грызунах

Приложение 6.8.7

Генетическая токсикология: Метод доминантных леталей на грызунах

Идентичен международному документу OECD TG N 478 "Genetic Toxicology: Rodent Dominant Lethal Test" (ОЭСР Руководство N 478 "Генетическая токсикология: Метод доминантных леталей на грызунах"). Принят 4 апреля 1984 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ в области генетической токсикологии методом доминантных леталей на грызунах. Доминантные летальные мутации (доминантные летали) вызывают гибель эмбрионов или плодов. Индукция доминантных леталей после воздействия исследуемого соединения указывает на поражение клеток герминативной ткани у экспериментальных животных.

2. Общие положения

2.1. Доминантные летали, в основном, являются результатом хромосомных нарушений (структурные или численные аномалии). Однако не следует исключать генные мутации и токсические эффекты.

3. Принцип метода

3.1. Обычно самцов подвергают воздействию исследуемого соединения и затем спаривают с необработанными виргинными самками. Различные стадии развития половых клеток можно оценивать отдельно, используя для скрещивания разные временные интервалы. Самок умерщвляют после соответствующего временного периода и исследуют содержимое матки, определяя общее число эмбрионов, число живых и мертвых эмбрионов. Оценка индукции доминантных леталей основана на сравнении количества живых эмбрионов на самку в экспериментальной группе с таковым показателем в контрольной группе. Возрастание числа мертвых эмбрионов на самку в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой указывает на постимплантационную смертность. Уровень постимплантационной смертности рассчитывается по отношению общего числа мертвых эмбрионов в экспериментальной группе к таковому в контрольной группе. Предимплантационную смертность можно оценить путем подсчета желтых тел или при сравнении общего числа эмбрионов на самку в экспериментальной и контрольной группах.

3.2. Можно использовать различные протоколы тестирования. Наиболее часто используют однократное введение вещества. Можно применять другие протоколы введения, например в течение 5 дней, если это необходимо.

3.3. Каждого самца последовательно скрещивают с виргинными самками в соответствующие интервалы времени. Число скрещиваний после воздействия определяется схемой затравки. Необходимо, чтобы все стадии созревания половых клеток были протестированы. Самок умерщвляют во второй половине беременности. Исследуют содержимое матки, учитывая общее число эмбрионов и число живых и мертвых эмбрионов.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Экспериментальные животные

4.1.1. Рекомендуют использовать крыс или мышей. Здоровых, половозрелых животных рандомизируют и из них формируют экспериментальные и контрольные группы. Рекомендуется использовать линии с низкой частотой доминантных леталей, высокой частотой беременности и высоким числом эмбрионов.

Число животных

4.1.2. Следует использовать адекватное число животных, принимая во внимание колебания спонтанной частоты оцениваемых биологических характеристик. Выбор количества животных следует обосновать заранее, определяя чувствительность выявления и уровень значимости. Пример типичного эксперимента. Число самцов в каждой группе должно быть достаточно, чтобы получить от 30 до 50% беременных самок на интервал скрещивания.

Условия содержания и кормления

4.1.3. Условия содержания должны быть адекватными для данного вида животных в соответствии с правилами надлежащего содержания животных.

Исследуемое вещество /подготовка

4.1.4. Если возможно, исследуемое вещество растворяют или суспендируют в изотоническом солевом растворе. Вещество не растворимое в воде растворяют или суспендируют в соответствующем растворителе. В норме следует использовать свежеприготовленные растворы или суспензии исследуемых веществ.

4.2. Условия испытания

Путь введения

4.2.1. Обычный путь введения - пероральный или внутрибрюшинный. Другие пути введения также допустимы.

Дозы

4.2.2. Обычно используют 3 уровня доз. Максимальная доза должна вызывать проявление токсичности (т.е. небольшое снижение фертильности). Следует отметить, что в первом опыте может быть достаточно исследование одной максимальной дозы. Максимальная доза для нетоксичного вещества - до 5 мг/кг или, если она невозможна, то наивысшая достижимая доза.

Контроля

4.2.3. Обычно в каждый эксперимент включают группы с положительным и отрицательным (растворитель) контролем. Когда имеются адекватные данные с положительным контролем в недавно проведенных в лаборатории экспериментах (в пределах последних 12 месяцев), эти данные могут быть использованы вместо постановки группы положительного контроля.

4.2.4. Примеры веществ, которые могут быть использованы как положительные контроля:

- триэтленмеламин;

- циклофосфамид;

- этилметансульфонат.

4.2.5. Вещества положительного контроля используют в дозах, которые показывают чувствительность теста.

4.3. Проведение эксперимента

4.3.1. Каждого самца скрещивают в течение заранее установленного интервала времени с 1 или 2 виргинными самками. Самки должны находиться с самцом по крайней мере в течение одного эстрального цикла или, в другом случае, пока не пройдет скрещивание, которое выявляется присутствием спермы во влагалище или наличием вагинальной пробки.

4.3.2. Число скрещиваний после воздействия регламентируется протоколом эксперимента и должно охватывать все стадии созревания половых клеток.

4.3.3. Самок умерщвляют во второй половине беременности и анализируют содержание матки, подсчитывая общее число эмбрионов, число живых и мертвых эмбрионов. Возможно исследование яичников для подсчета числа желтых тел.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные представляют в виде таблиц, в которых указывается число самцов, число беременных самок, число небеременных самок.

5.1.2. Результаты каждого скрещивания, включая обозначение каждого самца и самки, должны представляться индивидуально. Интервал скрещивания, уровень дозы для самца и число живых и мертвых эмбрионов указывают для каждой самки. Постимплантационную смертность рассчитывают по отношению числа мертвых эмбрионов от общего числа эмбрионов в экспериментальной группе животных к таковому в контрольной группе. Предимплантантационную смертность рассчитывают как различие между числом желтых тел и числом эмбрионов или как снижение с