Приложение 6.1.11. Оценка кожной токсичности при повторном воздействии в 21/28-дневном исследовании

Приложение 6.1.11

Оценка кожной токсичности при повторном воздействии в 21/28-дневном исследовании

Идентичен международному документу OECD Test N 410 "Repeated Dose Dermal Toxicity: 21/28-day Study" (ОЭСР Тест N 410 "Кожная токсичность повторной дозы: 21/28-дневное исследование"). Принят 12 мая 1981 года. Перевод с английского языка (еn). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает требования к исследованию кожной токсичности химических веществ.

1.2. Метод обеспечивает получение информации о токсичности вещества при накожном пути поступления при повторном воздействии.

2. Общие положения

2.1. Указанный метод исследования предназначен для изучения субхронической кожной токсичности химических веществ в целях получения информации о воздействии на организм человека в результате повторного нанесения на кожу в течение 21/28 дней.

2.2. При оценке токсичных свойств химического вещества определение субхронической кожной токсичности может быть проведено после получения исходной информации о токсичности в ходе испытания острой токсичности. Исследование острой токсичности предоставляет информацию о возможных опасностях для здоровья, которые могут возникнуть в результате повторной экспозиции на кожу в течение ограниченного периода времени.

2.3. Принципы проведения 21- или 28-дневного дермального исследования повторной дозы достаточно схожи, что позволяет в одном методе рассмотреть испытания и с той, и с другой продолжительностью. Основное отличие заключается во времени, в течение которого происходит дозирование.

3. Описание тестового метода

3.1. Принципы

3.1.1. Исследуемое вещество наносят ежедневно на кожу нескольким группам экспериментальных животных, одна доза на группу, в течение 21/28 дней.

3.1.2. Необходимы следующие сведения об исследуемом веществе:

- агрегатное состояние: твердое или жидкое;

- химическая идентификация исследуемого вещества;

- чистота (примеси) исследуемого вещества;

- характеристики растворимости;

- pH (при необходимости);

- стабильность, включая стабильность в растворителе, при использовании;

- точка плавления/точка кипения.

3.1.3. В течение периода нанесения вещества животные ежедневно обследуются для выявления признаков интоксикации. Животных, которые погибают в ходе испытания, подвергают аутопсии, выживших животных после завершения испытания умерщвляют и подвергают аутопсии.

3.2. Животные

Выбор вида

3.2.1. Необходимо использовать молодых здоровых особей из обычных лабораторных линий. Для проведения испытания следует использовать половозрелых крыс (с массой тела 200-300 г), кроликов (с массой тела 2,0-3,0 кг) или морских свинок (с массой тела 350-450 г). В случае использования других видов необходимо привести обоснование.

3.2.2. В случае, если субхроническое исследование кожной токсичности проводится перед долгосрочным исследованием, следует в обоих исследованиях использовать животных одной породы и одного и того же происхождения.

Подготовка

3.2.3. Следует использовать животных обоих полов. Самки должны быть нерожавшими и небеременными. При испытании каждой дозы следует использовать, по крайней мере, 10 животных (5 самок и 5 самцов) со здоровой кожей.

3.2.4. Если предполагается промежуточное умерщвление животных, то количество животных в группах должно быть увеличено на число планируемых к забою животных. Также может быть составлена дополнительная (вспомогательная) группа из 10 животных (по 5 животных каждого пола), которая будет подвергнута воздействию дозой высокого уровня в течение 21/28 дней с последующим наблюдением в течение 14 дней после завершения нанесения вещества для контроля обратимости и стойкости изменений появления отдаленных токсических эффектов.

3.2.5. Здоровых молодых половозрелых животных акклиматизируют к лабораторным условиям, по крайней мере, в течение 5 дней до испытания. Перед испытанием животные распределяются на экспериментальную и контрольную группы в произвольном порядке. Волосяной покров спинной области туловища экспериментальных животных должен быть удален незадолго до начала испытания. Шерсть может быть выбрита, но производить бритье следует приблизительно за 24 часа до начала испытания. Повторная стрижка или бритье должны производиться еженедельно. При стрижке или бритье волосяного покрова необходимо соблюдать осторожность во избежание повреждений кожи, могущих повлиять на ее проницаемость, за исключением случаев, когда это предусмотрено методикой испытания. Должно быть очищено не менее 10% площади поверхности тела. Для принятия решения о том, какая площадь кожи должна быть очищена от волосяного покрова и каковы должны быть размеры участка для нанесения вещества, следует учитывать массу животного. При тестировании твердых веществ, которые можно растереть в порошок, их следует измельчить, причем исследуемое вещество должно быть достаточно увлажнено водой или подходящим растворителем, чтобы обеспечить хороший контакт с кожей. При использовании растворителя следует учитывать его влияние на проницаемость кожи для исследуемого вещества. Жидкие исследуемые вещества обычно используются неразбавленными.

Содержание

3.2.6. Животных следует содержать в клетках отдельно. Температура в помещении, где содержатся экспериментальные животные, должна составлять для грызунов или для кроликов, оптимальный уровень относительной влажности - 30-70%. Допустимо использование стандартных лабораторных режимов питания с неограниченным потреблением питьевой воды. Освещение должно быть искусственным в режиме 12 часов при свете/12 часов в темноте.

3.3. Группы доз и дозировка

3.3.1. Следует использовать не менее трех опытных групп (трех уровней доз), одну контрольную группу, которая не должна подвергаться воздействию исследуемого вещества, при необходимости - контрольную группу с нанесением растворителя. За исключением нанесения исследуемого вещества, с животными из контрольной группы следует обращаться тем же способом, что и с экспериментальными группами.

3.3.2. Самый высокий уровень дозы должен привести к токсическим эффектам, но не вызывать смертельных исходов, которые могут препятствовать обоснованной оценке. Самый низкий уровень дозы не должен вызывать никаких признаков интоксикации. В том случае, если есть приемлемая оценка воздействия на человека, самый низкий уровень должен превышать ее. Средний уровень дозы в идеале должен вызвать минимальные видимые токсические эффекты. Если используются более чем одна промежуточная доза, их уровни должны быть распределены так, чтобы можно было произвести градацию токсических эффектов. В группе с малым уровнем дозы, в промежуточных и контрольных группах число смертельных исходов должно быть низким, чтобы обеспечить значимую (статистически достоверную) оценку результатов.

3.3.3. Если при нанесении исследуемое вещество вызывает сильное раздражение кожи, его концентрация может быть уменьшена, хотя это может привести к снижению или отсутствию других токсических эффектов при дозе высокого уровня. Однако при сильном повреждении кожи в начале исследования может возникнуть необходимость прекратить испытание и провести новое исследование при более низких концентрациях.

3.3.4. Пороговый тест. Если при испытании одного уровня дозы, составляющего не менее 1 000 мг/кг массы тела (при том, что ожидаемое воздействие на человека может указывать на необходимость использования дозы более высокого уровня), с использованием процедур, описанных для данного исследования, не выявлено видимых токсических эффектов, и если токсичность исследуемого вещества является маловероятной на основании данных, полученных для соединений, близких по структуре, то полное исследование с использованием трех уровней доз не является необходимым.

3.4. Методика проведения исследования

3.4.1. Животных обрабатывают исследуемым веществом не менее 6 часов в день в течение 7 дней в неделю на протяжении 21/28 дней. Однако, исходя прежде всего из практических соображений, считается приемлемым нанесение вещества 5 дней в неделю. Животных вспомогательной группы, предусмотренной для последующих наблюдений, выдерживают в течение 14 дней после эксперимента, чтобы выявить способность к восстановлению или стойкость токсических эффектов.

3.4.2. Исследуемое вещество следует наносить равномерно на участок, составляющий примерно 10% от общей площади поверхности тела. При использовании высокотоксичных веществ поверхность участка для нанесения вещества может быть меньше, но большая часть его должна быть покрыта тонкой и равномерной пленкой насколько это возможно.

3.4.3. Между нанесениями исследуемого вещества, оно должно контактировать с кожей посредством пористой марлевой повязки, зафиксированной не вызывающей раздражения лентой. Участок тела, через который воздействует исследуемое вещество, должен быть покрыт способом, позволяющим удерживать испытуемое вещество, на которое сверху наложена марлевая повязка, и не позволяющим животным проглотить испытываемое вещество. Можно использовать ограничители движения для препятствия слизыванию вещества, но полная иммобилизация не рекомендуется.

3.4.4. Если наблюдаются признаки токсичности, они должны быть зарегистрированы, включая время их выявления, степень и продолжительность. Наблюдения за животными должны включать: изменения кожи и волосяного покрова, глаз и слизистых оболочек, а также органов дыхания, кровообращения, вегетативной и центральной нервных систем, соматомоторной деятельности и модели поведения, но не ограничиваться только этим. Измерения потребления пищи и взвешивание животных следует проводить еженедельно. Регулярное наблюдение за животными необходимо, чтобы гарантировать, что животное не выбыло из исследования по причине каннибализма, аутолиза тканей или дистопии. При завершении исследования всех выживших животных не вспомогательных, экспериментальных групп умерщвляют. При обнаружении умирающих животных они должны быть удалены и умерщвлены.

3.5. Наблюдение

3.5.1. По крайней мере один раз в день должен быть проведен тщательный клинический осмотр. Дополнительные наблюдения следует проводить ежедневно, принимая необходимые меры для минимизации потери животных при исследовании, например, аутопсию или охлаждение животных, найденных мертвыми, и изоляцию или умерщвление слабых или умирающих животных.

3.6. Гематология и клиническая биохимия

3.6.1. Для всех животных при завершении исследования должны быть выполнены гематологические исследования с определением гематокрита, концентрации гемоглобина, количества эритроцитов, общего и дифференциального количества лейкоцитов, а также величины потенциала свертывания, таких как время свертывания крови, протромбиновое время, тромбопластиновое время или количество тромбоцитов и биохимическое исследование крови, при котором достаточным является определение параметров крови, характеризующих функции печени и почек.

3.6.2. Выбор специальных исследований будет зависеть от наблюдения за механизмом действия вещества. Предполагаемый перечень таких исследований: измерения уровней кальция, фосфора, хлора, натрия, калия, уровня глюкозы натощак (с периодами голодания для соответствующих видов); определение глутаминовой пировиноградной трансаминазы сыворотки (аланинаминотрансфераза сыворотки), глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы сыворотки (аспартатаминотрансфераза сыворотки), орнитиндекарбоксилазы, гамма-глутамилтранспептидазы, азота мочевины, белка, креатинина крови, общего билирубина и общего белка сыворотки.

3.6.3. Другие исследования, которые могут потребоваться для адекватной токсикологической оценки, включают анализ липидов, гормонов, кислотно-щелочного баланса, метгемоглобина, активности холинэстеразы. При необходимости расширить исследования наблюдаемых эффектов может быть проведен дополнительный клинический биохимический анализ.

3.6.4. Анализ мочи требуется производить в случаях, когда есть показание, основанное на ожидаемой или наблюдаемой токсичности.

3.6.5. Если исторических исходных данных недостаточно, то перед началом дозирования следует уделить внимание определению гематологических и клинических биохимических показателей.

4. Патология

4.1. Макроскопическая аутопсия

4.1.1. Все животные в исследовании должны быть подвергнуты полной макроскопической аутопсии, которая включает в себя осмотр внешней поверхности тела, всех отверстий, черепных, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Печень, почки, надпочечники и яички должны быть взвешены влажными как можно скорее после вскрытия, чтобы избежать высыхания. Следующие органы и ткани должны быть сохранены в подходящей среде для дальнейшего проведения возможной гистопатологической экспертизы: участки нормальной и обработанной кожи, печень, почки и органы-мишени, то есть те органы, которые показывают макроскопические повреждения или изменения в размерах.

4.2. Гистопатология

4.2.1. Гистологическое исследование должно быть выполнено на сохранившихся органах и тканях животных группы с высоким уровнем дозы и контрольной группы. Эти исследования могут быть распространены на животных групп с другими дозами, при необходимости, чтобы исследовать изменения, наблюдаемые в группах с высоким уровнем дозы.

4.2.2. Животных вспомогательной группы следует обследовать гистологически особо обращая внимание на те органы и ткани, в которых выявлены эффекты воздействия вещества в других экспериментальных группах.

5. Данные и отчет

5.1. Данные об испытании

5.1.1. Данные могут быть представлены в табличной форме с указанием для каждой экспериментальной группы количества животных на начало испытания; количества животных, имеющих поражения; тип поражений и процент животных с каждым видом поражения.

5.1.2. Все наблюдаемые результаты, количественные и случайные, должны быть оценены соответствующим статистическим методом. Может быть использован любой общепринятый статистический метод. Статистические методы должны быть выбраны в ходе планирования исследования.

5.1.3. Результаты исследования следует рассматривать с точки зрения наблюдаемых токсических эффектов, аутопсии и гистопатологических данных. Оценка будет включать в себя отношение между дозой исследуемого вещества и наличием или отсутствием, частотой и тяжестью нарушений, в том числе поведенческих и клинических нарушений, макроскопических поражений, идентифицированных органов-мишеней, изменениями массы тела, влияниями на смертность и любыми другими общими или специфическими токсическими эффектами. Надлежащим образом проведенное 21/28-дневное исследование предоставит информацию о последствиях повторного попадания на кожу вещества и может показать необходимость дальнейшего продолжительного исследования. Исследование также может предоставить информацию о выборе доз для более продолжительных исследований.

5.1.4. Данное исследование кожной токсичности предоставляет информацию о последствиях повторного попадания на кожу того или иного вещества. Экстраполяция результатов исследования на человека действует в ограниченной степени, но она может дать полезную информацию о степени кожной резорбции вещества.

5.2. Отчет об испытании

Отчёт об исследовании должен содержать следующую информацию:

- используемые виды/линии;

- данные о токсической реакции в зависимости от пола и дозы;

- время смерти в ходе исследования или количество животных, доживших до окончания эксперимента;

- токсические или другие эффекты;

- характер, точность и продолжительность наблюдений за каждым признаком нарушения и его последующее развитие (были выявленные изменения промежуточными или постоянными);

- данные о питании и массе тела животных;

- выполненные гематологические испытания и результаты в сравнении с исходными данными;

- выполненные клинические биохимические испытания и результаты в сравнении с исходными данными;

- данные аутопсии;

- подробное описание всех гистологических данных;

- статистическая обработка результатов (в случае необходимости).