Приложение 6.8.5. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

Приложение 6.8.5

Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro

Идентичен международному документу OECD TG N 476 "In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test" (ОЭСР Руководство N 476 "Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro"). Принят 21 июля 1997 г. Перевод с английского языка (en). Степень соответствия - модифицированный (MOD).

1. Область применения

1.1. Настоящий метод исследования устанавливает порядок проведения испытания химических веществ с помощью метода оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro. Метод оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro может быть использован для анализа генных мутаций, индуцируемых химическими соединениями. Наиболее часто используются следующие культуры: мышиная лимфома L5178Y, клеточные линии СНО, AS52, и V79 китайского хомячка; лимфобластные клетки человека ТК6. В этих клеточных линиях для изучения мутаций наиболее часто исследуются генетические маркеры, оценивающие мутации генов тимидинкиназы (ТК) и гипоксантин-гуанидин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и трансгена ксантин-гуанидин фосфорибозилтрасферазы (XPRT). ТК, HPRT и XPRT выявляют различные спектры генетических событий. Аутосомная локализация ТК и XPRT позволяет выявлять генетические события (т.е. большие делеции), не определяемые в HPRT локусе Х-хро- мосомы.

2. Общие положения

2.1. В тесте оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro используют культуры перевиваемых клеточных линий или клеточные штаммы. Клетки отбирают на основе способности роста в культуре и стабильности частоты спонтанных мутаций. Для тестов in vitro обычно требуется использовать экзогенный источник метаболической активации. Система метаболической активации не может полностью воспроизводить условия, присутствующие у млекопитающих in vivo. Строго следует избегать условий, которые могут привести к результатам, не отражающим реальную мутагенность. Позитивные результаты, не отражающие реальную мутагенность, могут возникать вследствие изменения рН, осмотической концентрации раствора, высокого уровня токсичности.

2.2. Тест применяют для скрининга потенциальной мутагенности и канцерогенности для млекопитающих. Многие вещества, позитивные в данном тесте, являются канцерогенами для млекопитающих. Однако нет высокой корреляции между результатами данного теста и канцерогенностью. Степень корреляции зависит от класса химических соединений. Возрастает количество данных, показывающих, что имеются канцерогены, которые не эффективны в данном тесте, поскольку они действуют через другие, негенотоксические, механизмы или механизм их действия не работает в этих клетках [6].

3. Принцип метода

3.1. Клетки, дефицитные по тимидинкиназе (ТК) вследствие мутации , резистентны к цитотоксическому эффекту пиримидинового аналога трифтортимидина (ТФТ). Клетки, профицитные по тимидинкиназе, чувствительны к ТФТ, который вызывает ингибицию клеточного метаболизма и останавливает клеточное деление. Только мутантные клетки способны пролиферировать в присутствии ТФТ, в то время как содержащие тимидинкиназу нормальные клетки не пролиферируют. Аналогично, клетки, дефицитные по HPRT или XPRT, отбираются по резистентности к 6-тиогуанину (ТГ) или 8-азагуанину (АГ). При тестировании генных мутаций in vitro следует тщательно анализировать особенности исследуемых веществ, проверяя, не являются ли они аналогами оснований или соединениями, связанными с селективными агентами, используемыми в данной тест-системе. Например, любая ожидаемая селективная токсичность исследуемого соединения должна изучаться для мутантных и немутантных клеток. Приемлемость выбора система/агент должна быть подтверждена, когда исследуемое соединение по химической структуре связано с селективным агентом.

3.2. Клеточная суспензия или клеточный монослой подвергаются воздействию исследуемого соединения как в варианте с метаболической активацией, так и без нее в течение адекватного интервала времени и затем культивируется для определения цитотоксичности и фенотипической экспрессии до отбора мутантов. Цитотоксичность обычно оценивают по соотношению эффективности клонирования (выживаемости) или по соотношению общего роста этих культур после воздействия. Обработанные культуры содержат в культуральной среде необходимый период времени, характерный для каждого селективного локуса и клеточного типа, чтобы проявилась близкая к оптимальной фенотипическая экспрессия индуцированных мутаций. Частоту мутаций определяют путем посева определенного числа клеток в содержащую селективный агент культуральную среду для выявления мутантных клеток и в среду без селективного агента для определения эффективности клонирования (выживаемости). После соответствующего времени инкубации подсчитывают колонии. Частоту мутаций определяют по числу мутантных колоний в селективной среде и числу колоний в неселективной среде.

4. Описание метода

4.1. Материалы

Клетки

4.1.1. В тесте используют различные типы клеток, включая субклоны клеток L5178Y, СНО, AS52, V79 или ТК6. Используемые клетки должны быть чувствительны к химическим мутагенам, иметь высокую эффективность клонирования и стабильный уровень спонтанных мутаций. Клетки необходимо проверять на загрязнение микоплазмой. Клетки не следует использовать при наличии загрязнения.

4.1.2. Предварительно должна быть определена чувствительность и сила теста. Число клеток, количество культур, концентрации исследуемого вещества должны отвечать этим параметрам. Минимальное число выживших после обработки клеток, используемое на каждой стадии теста, должно основываться на спонтанной частоте мутаций. Общее правило - использовать то количество клеток, которое по крайней мере в 10 раз выше спонтанной частоты мутаций. Рекомендуется использовать по крайней мере клеток. Следует учитывать адекватные исторические данные по клеточной системе, чтобы контролировать стабильность теста.

Среда и условия культивирования

4.1.3. Необходимо использовать соответствующую культуральную среду и условия инкубации (культуральная посуда, температура, концентрация и влажность). Культуральную среду выбирают в соответствии с используемым в тесте типом клеток и селективной системой. Особенно важно, чтобы выбранные условия культивирования обеспечивали оптимальный рост клеток в течение периода экспрессии и оптимальную колонийобразующую способность как мутантных, так и немутантных клеток.

Приготовление культур

4.1.4. Клетки берут из сток культуры, высевают в культуральную среду и инкубируют при 37°С. Перед использованием в тесте культуры необходимо очистить от предсуществующих мутантных клеток.

Метаболическая активация

4.1.5. Исследуемое вещество тестируют в культуре в вариантах в присутствии системы метаболической активации и без нее. Наиболее часто используемая система включает кофакторы и постмитохондриальную фракцию (S9) печени грызунов, обработанных индукторами ферментов, такими как Arochlor или комбинация фенобарбитала и . Обычно используют постмитохондриальную фракцию в диапазоне концентраций, соответствующих 1-10% от конечного объема среды. Выбор и условия системы метаболической активации зависят от класса исследуемого химического вещества. В некоторых случаях возможно проведение опыта с более чем одной концентрацией постмитохондриальной фракции. Ряд методик, основанных на использовании генноинженерных клеточных линий, экспрессирующих специфические активирующие клеточные ферменты, могут обладать эндогенной активацией. Выбор клеточных линий должен быть научно обоснован (например, присутствие изозима цитохрома Р450, метаболизирующего исследуемое вещество).

Исследуемое вещество/подготовка

4.1.6. Твердые вещества следует растворять или суспендировать в соответствующих растворителях или разбавителях и раствор готовить перед обработкой клеток. Жидкие вещества можно добавлять прямо в культуру и/или разводить перед введением. Свежие препараты следует использовать до тех пор, пока данные об их стабильности указывают на приемлемость условий хранения.

4.2. Условия испытания

Растворитель/разбавитель

4.2.1. Растворитель/разбавитель не должен химически взаимодействовать с исследуемым веществом и не должен влиять на выживаемость клеток и активность S9-системы. Если используется неизвестный растворитель, его применение должно быть обосновано данными, показывающими его совместимость с данным тестом. Рекомендуется, если возможно, использовать в первую очередь водные растворы/суспензии. При исследовании не растворимых в воде веществ, используют органические растворители, не содержащие воды. Вода может быть удалена с помощью молекулярного сита.

Воздействующие концентрации

4.2.2. Основными критериями при выборе максимальной концентрации вещества являются цитотоксичность, растворимость в тест-системе, изменение рН или осмотической концентрации.

4.2.3. Цитотоксичность должна быть определена в основном эксперименте в вариантах с метаболической активацией и без нее, используя в качестве показателей эффективность клонирования (выживаемость) или относительный общий рост. Полезно определить цитотоксичность и растворимость в предварительном эксперименте.

4.2.4. Следует использовать по крайней мере 4 информативных концентрации. При наличии цитотоксичности концентрации должны быть в диапазоне от максимальной до минимальной по токсичности или до отсутствия токсичности. Обычно диапазон между концентрациями должен быть в пределах от 2 раз до . Если максимальная концентрация основана на цитотоксичности, то она должна давать приблизительно 10-20% (но не меньше 10%) уровень относительной выживаемости (относительной эффективности клонирования) или относительного общего роста. Для нецитотоксичных веществ максимальные концентрации следует брать 5 мг/мл, 5 мкл/мл или 0,01 М, выбирая наименьшую.

4.2.5. Относительно нерастворимые вещества следует тестировать на уровнях выше или ниже границы их растворимости в культуральных условиях. Данные по растворимости следует определять на культуральной среде, в которой обрабатывают клетки. Полезно оценить растворимость в начале и конце обработки, так как растворимость может меняться во время обработки клеток из-за присутствия клеток, S9, сыворотки и т.д. Нерастворимость можно определять на глаз. Преципитат не должен мешать анализу результатов.

Контроли

4.2.6. Соответствующие положительные и отрицательные (растворитель или разбавитель) контроли в вариантах с метаболической концентрацией и без нее должны быть включены в каждый эксперимент. В варианте с метаболической активацией вещество, используемое в качестве положительного контроля, должно дать мутагенный ответ при данной системе метаболической активации.

4.2.7. Примеры положительных контролей.

Условия метаболической активации	Локус	Химическое вещество и номер CAS
Отсутствие экзогенной метаболической активации	HPRT	Этилметансульфонат [CAS N 62-50-0] Этилнитрозомочевина [CAS N 759-73-9]
	ТК (малые или большие колонии)	Метилметансульфонат [CAS N 66-27-3]
	XPRT	Этилметансульфонат [CAS N 62-50-0] Этилнитрозомочевина [CAS N 759-73-9]
Присутствие экзогенной метаболической активации	HPRT	3-метилхолантрен [CAS N 56-49-5] N-нитрозодиметиламин [CAS N 62-75-9] 7,12-диметилбензантрацен [CAS N 57-97-6]
	ТК (малые или большие колонии)	Циклофосфамид (моногидрат) [CAS N 50-18-0 (6055-19-2)] Бензо(а)пирен [CAS N 50-32-8] 3-метилхолантрен [CAS N 56-49-5]
	XPRT	N-нитрозодиметиламин (для высоких уровней S-9 [CAS N 62-75-9] Бензо(а)пирен [CAS N 50-32-8]

4.2.8. Возможно использование других положительных контролей. Например, если лаборатория имеет накопленные данные по 5-бром-2'-дезоксиуридину [CAS N 59-14-3], то это соединение может быть использовано как положительный контроль. При необходимости допустимо использование химические вещества того же класса, что и известные позитивные контроли.

4.2.9. Отрицательный контроль - растворитель или разбавитель в культуральной среде. Обработка культуры проводится также как в экспериментальных группах. Дополнительно вводят контроль "культура без обработки", пока накопленные в лаборатории данные (исторический контроль) не покажут отсутствие вредного или мутагенного эффекта выбранного растворителя.

4.3. Проведение эксперимента

Обработка культуры

4.3.1. Пролиферирующие клетки обрабатывают веществом в условиях с метаболической активацией и без нее. Длительность воздействия должна быть оптимальной (обычно эффективна от 3 до 6 ч). Время экспозиции может охватывать один или более клеточных циклов.

4.3.2. Для каждой концентрации можно использовать либо две, либо одну культуру. При использовании одной культуры число концентраций следует увеличить, чтобы было адекватное число культур для анализа (т.е. по крайней мере 8 концентраций). Необходимо ставить 2 культуры с отрицательным контролем.

4.3.3. Тестирование газообразных или летучих соединений следует проводить, используя адекватные методики, такие как герметически закрытые культуральные флаконы.

Оценка выживаемости, жизнеспособности и частоты мутаций

4.3.4. После окончания воздействия клетки отмывают и культивируют для оценки выживаемости и для экспрессии мутантного фенотипа. Оценку цитотоксичности, определяя относительную эффективность клонирования (выживаемость) и относительный общий рост культуры, обычно проводят после периода воздействия.

4.3.5. Для каждого локуса имеется определенный период времени, необходимый для оптимальной экспрессии фенотипа вновь индуцированных мутаций (мутантов) (для HPRT и XPRT необходимо по крайней мере 6-8 дней, для ТК - 2 дня). Клетки выращивают в среде в присутствии и без селективного агента для определения соответственно числа мутантов и эффективности клонирования. Оценку выживаемости (используемую для расчета частоты мутантов) проводят по окончании времени экспрессии, высевая клетки на неселективную среду.

4.3.6. Если вещество позитивно в -тесте на клетках L5178Y, определяют размер колоний по крайней мере на одной экспериментальной культуре (наивысшая позитивная концентрация) и на культурах отрицательного и позитивного контроля. Если вещество дало отрицательный результат в -тесте на клетках L5178Y, размер колоний определяют в культурах отрицательного и позитивного контроля. В исследованиях на также можно проводить анализ размера колоний.

5. Результаты и отчет

5.1. Обработка результатов

5.1.1. Данные должны включать определение цитотоксичности и выживаемости клеток, подсчет колоний и частоту мутаций для экспериментальных и контрольных культур. В случае положительного ответа в тесте на клетках L5178Y колонии измеряют, используя критерии отнесения колоний к малым и большим, по крайней мере в варианте с одной концентрацией вещества (наивысшей концентрацией, давший положительный эффект) и в культурах отрицательного и позитивного контроля. Молекулярная и цитогенетическая природа мутантов, образующих большие и малые колонии, в деталях рассмотрена в ряде работ. В -тесте колонии подсчитывают, используя критерии нормального роста (большие колонии) и медленного роста (малые колонии). Мутантные клетки, имеющие более тяжелые генетические нарушения, имеют более длительный период удвоения и соответственно формируют небольшие колонии. Спектр этих нарушений колеблется от полной потери гена до кариотипически выявляемых хромосомных аберраций. Образование малых колоний связано с химическими веществами, индуцирующими "большие" хромосомные аберрации. Мутантные клетки с менее серьезными нарушениями растут со скоростью, сходной с родительскими клетками, и формируют большие колонии.

5.1.2. Должны быть представлены выживаемость (относительная эффективность клонирования) и относительный общий рост. Частота мутаций приводится как число мутантных клеток на общее число выживших клеток.

5.1.3. Данные приводят по отдельным культурам. Дополнительно все данные следует объединить (суммировать) в табличной форме.

5.1.4. Нет требований к верификации четко положительного ответа. Противоречивые результаты следует прояснить, проводя дальнейшее тестирование, предпочтительно используя модифицированные экспериментальные условия. Отрицательные результаты следует в отдельных случаях подтверждать. В тех случаях, когда подтверждение отрицательных результатов не считается необходимым, правомерность этого должна быть обоснована. Модификация параметров исследования, варьирование условий могут быть проведены в последующих экспериментах при противоречивых или отрицательных результатах. Параметры, которые могут быть модифицированы, включают диапазон концентраций и условия метаболической активации.

Оценка и интерпретация результатов

5.1.5. Существует ряд критериев для определения положительного результата: зависимость от концентрации или воспроизводимое повышение частоты мутаций. На первом месте должна быть биологическая обоснованность результатов. Дополнительно при оценке результатов могут быть использованы статистические методы. Статистическая значимость не должна быть единственным определяющим фактором при оценке положительного ответа.

5.1.6. Исследуемое вещество, для которого все выше приведенные критерии отрицательны, считается немутагеном в данной тест-системе.

5.1.7. Хотя в большинстве исследований получают четкие положительные или отрицательные результаты, в редких случаях данные не позволяют сделать заключение об активности вещества. Результаты могут оставаться противоречивыми или сомнительными, несмотря на то, что эксперименты несколько раз повторены.

5.1.8. Положительные результаты в тесте оценки генных мутаций на клетках млекопитающих in vitro показывают, что исследуемое вещество индуцирует генные мутации в используемых культивируемых клетках млекопитающих. Выявленная зависимость эффекта от концентрации, которая повторяется, наиболее значима. Отрицательные результаты показывают, что при данных условиях исследуемое вещество не индуцирует генные мутации в используемых культивируемых клетках млекопитающих.

5.2. Отчет

Отчет должен включать следующую информацию.

Исследуемое соединение:

- идентификационные данные и номер CAS, если известен;

- физическую природу и чистоту;

- физико-химические параметры, имеющие значимость для данного исследования;

- стабильность веществ.

Растворитель/разбавитель:

- обоснование выбора растворителя/разбавителя;

- растворимость и стабильность исследуемого вещества в растворителе/разбавителе, если известны.

Клетки:

- тип и источник клеток;

- число клеточных культур;

- число пассажей, если используются;

- методы поддержания клеточных культур, если используется;

- отсутствие микоплазмы.

Условия эксперимента:

- обоснование выбора концентраций и числа клеточных культур, включающее данные по цитотоксичности и ограничения по растворимости, если имеются;

- состав среды, концентрация ;

- концентрации исследуемого вещества;

- объем растворителя и количество добавленного исследуемого вещества;

- температура инкубации;

- длительность обработки культуры;

- клеточную плотность во время обработки;

- тип и состав системы метаболической активации, включая критерии приемлемости;

- позитивные и отрицательные контроли;

- продолжительность периода экспрессии (включая число высеянных клеток, субкультуры, протоколы посева, если используются);

- селективный агент(ы);

- критерии отнесения результата как положительный, отрицательный или сомнительный;

- методы, используемые для подсчета выживших и мутантных клеток;

- определение, какого размера и типа колоний учитываются (включая критерии отнесения колоний к "малым" и "большим").

Результаты:

- признаки токсичности;

- признаки преципитации;

- данные по рН и осмотической концентрации во время обработки исследуемым веществом, если определяли;

- размер колоний, если учитывали по крайней мере для позитивных и негативных контролей;

- оценка зависимости эффекта от дозы, где это возможно;

- статистический анализ, если проводили;

- данные негативного (растворитель/разбавитель) и позитивного контроля;

- исторические данные по негативному (растворитель/разбавитель) и позитивному контролю с указанием пределов колебаний, среднего значения и стандартного отклонения;

- частота мутантов.

Обсуждение результатов.

Заключение.