Межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 "Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. N 228-ст)

Microbiology of food and animal feeding stuffs. Methods for detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 2. Colony-count technique

Дата введения - 1 июля 2014 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС")

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335)

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. N 43)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Киргизия	KG	Кыргызстандарт
Россия	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт
Узбекистан	UZ	Узстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 июня 2013 г. N 228-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO/TS 10272-2-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2014 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу ISO/TS 10272-2:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method fordetection and enumeration of Campylobacter spp. - Part 2: Colony-count technique (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод обнаружения и подсчета бактерий Campylobacter spp. Часть 2. Метод подсчета колоний)

Международный стандарт разработан подкомитетом SC 9 "Микробиология" технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 "Пищевые продукты" Международной организации по стандартизации (ISO).

Перевод с английского языка (en).

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий стандарт, и международных стандартов, на которых даны ссылки, имеются в национальных (государственных) органах по стандартизации указанных выше государств.

Степень соответствия - идентичная (IDT).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53993-2010/ISO/TS 10272-2:2006

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета Campylobacter spp.

Настоящий стандарт распространяется:

- на пищевую продукцию и корма для животных;

- пробы окружающей среды в области производства и обращения пищевой продукции.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ISO 6887 (все части) Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований)

ISO 7218 Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации для микробиологических исследований)

ISO 8261 Milk and milk products. General guidance for the preparation of tests samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты. Общие правила приготовления испытуемых проб для анализа, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований)

ISO/TS 11133-1 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории)

ISO/TS 11133-2 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Guidelines on preparation and production of culture media - Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 2: Практические руководящие указания по определению эффективности питательных сред)

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 Campylobacter (Campylobacter): Микроорганизмы, образующие характерные колонии на твердой селективной среде, при инкубировании в аэробных условиях при температуре 41,5°С, но не при температуре 25°С, и которые обладают характерной подвижностью, биохимическими свойствами и способностью к росту, при условии проведения испытаний в соответствии с настоящим стандартом.

Примечание - Наиболее часто встречающимися видами являются Campylobacter jejuni и Campylobacter coli. Вместе с тем, были описаны и другие виды (Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis и некоторые другие).

3.2 подсчитанное число Campylobacter (count of Campylobacter): Число Campylobacter, обнаруженное в миллилитре или в грамме испытуемой пробы, когда испытания проводят в соответствии с настоящим стандартом.

4 Сущность метода

4.1 Приготовление разведений

Приготовление десятичных разведений на основе испытуемой пробы - по ISO 6887 и ISO 8261.

4.2 Подсчет

Испытуемую пробу наносят на твердую селективную среду, модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (агар mCCD), если продукт является жидким, или на исходную суспензию в случае других продуктов.

При соблюдении тех же условий приготовляют другие чашки, используя десятикратные разведения испытуемой пробы или исходной суспензии.

Чашки инкубируют при температуре 41,5°С в аэробных условиях в течение 40 - 48 ч.

Колонии, предположительно Campylobacter, пересевают на неселективную агаровую среду, колумбийский кровяной агар, затем подтверждают посредством исследования под микроскопом и надлежащего биохимического испытания и теста на контроль роста.

Количество Campylobacter в 1  или в грамме испытуемой пробы рассчитывают на основе количества подтвержденных типичных колоний в чашке.

5 Питательные среды и реактивы

5.1 Общие положения

Качество подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания Campylobacter - по ISO 7218, ISO/TS 11133-1 и ISO/TS 11133-2.

5.2 Разбавитель - по ISO 6887.

5.3 Модифицированный агар с углем, цефоперазоном и дезоксихолатом (агар mCCD)

5.3.1 Базовая среда

5.3.1.1 Состав:

мясной экстракт - 10,0 г;

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

древесный уголь - 4,0 г;

продукт ферментативного переваривания казеина - 3,0 г;

натрия дезоксихолат - 1,0 г;

железа (II) сульфат - 0,25 г;

натрия пируват - 0,25 г;

агар - 8,0 - 18,0 г*;

вода - 1000 .

5.3.1.2 Приготовление

Основные компоненты или полную сухую базовую среду растворяют в воде, доводя до кипения. При необходимости корректируют рН так, чтобы после стерилизации он был равен (7,40,2) при температуре 25°С. Базовую среду переносят в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

5.3.2 Раствор антибиотиков

5.3.2.1 Состав:

цефоперазон - 0,032 г;

амфотерицин В - 0,01 г;

вода - 5 .

5.3.2.2 Приготовление

Компоненты растворяют в воде. Стерилизуют путем фильтрации.

5.3.3 Полная среда

5.3.3.1 Состав:

базовая среда (5.3.1) - 1000 ;

раствор антибиотиков (5.3.2) - 5 .

5.3.3.2 Приготовление

Раствор антибиотиков добавляют в базовую среду, охлажденную до температуры (472)°С, затем тщательно перемешивают. Около 15  полной среды добавляют в стерильные чашки Петри (6.8). Дают затвердеть. Непосредственно перед использованием тщательно высушивают агаровые чашки, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до тех пор, пока поверхность агара не утратит видимую влагу. Если их готовят заранее, невысушенные агаровые чашки следует хранить не более 4 ч при комнатной температуре или в темном месте при (53)°С не более семи дней.

5.3.3.3 Проверка эффективности

Определение селективности и производительности - по ISO 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ISO 11133-2, таблица В.5.

5.4 Колумбийский кровяной агар

5.4.1 Базовая среда

5.4.1.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 23,0 г;

крахмал - 1,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

агар - 8,0 - 18,0 г*;

вода - 1000 .

5.4.1.2 Приготовление

Основные компоненты или полную сухую среду растворяют в воде, доводя до кипения. При необходимости корректируют рН так, чтобы после стерилизации он был равен (7,30,2) ед. рН при температуре 25°С. Базовую среду переносят в колбы подходящей вместимости. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

5.4.2 Стерильная дефибринированная баранья кровь.

5.4.3 Полная среда

5.4.3.1 Состав:

базовая среда (5.4.1) - 1000 ;

стерильная дефибринированная баранья кровь (5.4.2) - 50 .

5.4.3.2 Приготовление

Соблюдая стерильность, добавляют кровь к базовой среде, охлажденной до температуры (472)°С, затем перемешивают. Около 15  полной среды добавляют в стерильные чашки Петри (6.8). Дают затвердеть. Непосредственно перед использованием тщательно высушивают агаровые чашки, предпочтительно с открытыми крышками и поверхностью агара вниз, в сушильном шкафу (6.2) в течение 30 мин или до тех пор, пока поверхность агара не утратит видимую влагу. Если их готовят заранее, невысушенные агаровые чашки следует хранить не более 4 ч при комнатной температуре или не более семи дней при (53)°С.

5.4.3.3 Проверка эффективности

Определение селективности и производительности сред - по ISO/TS 11133-1. Информация о проверке эффективности - по ISO/TS 11133-2. Контрольные штаммы С. coli АТСС 43478 или С. jejuni АТСС 33291 должны демонстрировать значительный рост на колумбийском кровяном агаре после аэробной инкубации в течение 24 ч при температуре 37°С.

5.5 Жидкая среда для бруцелл

5.5.1 Состав:

продукт ферментативного переваривания казеина - 10,0 г;

продукт ферментативного переваривания животных тканей - 10,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

экстракт из дрожжей - 2,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

натрия гидросульфит - 0,1 г;

вода - 1 000 .

5.5.2 Приготовление

Основные компоненты или полную сухую среду растворяют в воде, в случае необходимости проводя нагрев. При необходимости корректируют рН так, чтобы после стерилизации он был равен (7,00,2) ед. рН при температуре 25°С. Среду разливают порциями по 10  в пробирки. Стерилизуют в автоклаве (6.1) при температуре 121°С в течение 15 мин.

5.5.3 Проверка эффективности

Определение селективности и производительности сред - по ISO/TS 11133-1. Информация о критериях эффективности - в ISO/TS 11133-2, таблица В.4.

5.6 Реактив для обнаружения оксидазы

5.6.1 Состав:

N,N,N',N'-тетраметил-1,4-фенилендиамина, дигидрохлорид - 1,0 г;

вода - 100 .

5.6.2 Приготовление

Растворяют данный компонент в воде непосредственно перед использованием.

6 Оборудование и химическая стеклянная посуда

Используют микробиологическое лабораторное оборудование по ИСО 7218 и, в частности, нижеприведенное.

6.1 Оборудование для сухой стерилизации (сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ISO 7218.

6.2 Сушильный шкаф, ламинарный бокс или термостат, способные функционировать в диапазоне температур от 37°С до 55°С.

6.3 Термостат, работающий при температуре (41,51)°С.

6.4 Термостат, работающий при температуре (251)°С.

6.5 Водяная баня, работающая в диапазоне 44°С - 47°С.

6.6 рН-метр с точностью 0,1 ед. рН при температуре 25°С.

6.7 Сосуды, пробирки, колбы, пригодные для стерилизации и хранения разбавителя и питательных сред.

6.8 Чашки Петри, предпочтительно с выемками, стеклянные или пластиковые, диаметром 90 - 100 мм.

6.9 Градуированные пипетки с полным сливом, с широким отверстием, номинальной вместимостью 1  и 10 , градуированные с делениями 0,1 .

6.10 Резиновые груши или любая другая система безопасности, которую можно адаптировать к градуированным пипеткам.

6.11 Стерильные петли из проволоки платино-иридиевой, никелево-хромовой диаметром приблизительно 3 мм или стеклянная или пластиковая палочка.

Примечание - Никелево-хромовая петля не пригодна для использования в испытании с оксидазой (см. 9.4.3).

6.12 Шпатель, стеклянный или пластиковый.

6.13 Микроскоп, предпочтительно с фазовым контрастом (для наблюдения характерной подвижности Campylobacter).

6.14 Надлежащее оборудование для достижения аэробных условий с содержанием кислорода (52)%, диоксида углерода (103)%, альтернативного водорода 10%, с соблюдением баланса азота. Используют подходящие герметичные контейнеры, способные удерживать чашки Петри, например, бактериологические анаэробные сосуды. Необходимые аэробные условия достигаются при использовании имеющихся в продаже газогенераторных комплектов (следует в точности соблюдать производственные инструкции, в частности, те из них, которые относятся к объему сосуда и вместимости газогенераторного комплекта). В качестве альтернативы используют промывание сосуда надлежащей газовой смесью перед инкубацией.

7 Отбор проб

В лабораторию направляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или изменена в процессе транспортирования или хранения.

Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Отбор проб проводят в соответствии с конкретным стандартом на данную продукцию. Рекомендуется достижение соглашения заинтересованных сторон по отбору проб конкретного продукта при отсутствии соответствующего стандарта.

Принимая во внимание, что Campylobacter spp. весьма чувствительны к замораживанию, испытуемые пробы следует хранить при температуре (32)°С и анализировать в кратчайшие сроки. Принимают меры по предотвращению высыхания проб.

8 Приготовление испытуемой пробы

Испытуемую пробу приготовляют в соответствии с конкретным стандартом на определенные виды продукции. Если не существует конкретного стандарта, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны достигли соглашения по данному вопросу.

9 Методика проведения испытания

9.1 Подготовка пробы, исходной суспензии и разведение - по ISO 6887 и конкретному стандарту на определенные виды продукции.

Приготовляют единичную серию десятикратных разведений на основе испытуемой пробы, если продукция жидкая, или на основе исходной суспензии в случае продукции других видов.

9.2 Посев и инкубация

9.2.1 Используя стерильную пипетку (6.9), переносят 0,1  исходных суспензий (9.1) в обе чашки с агаровой средой mCCD (5.3). Тщательно и равномерно размазывают посев как можно быстрее по поверхности слоя, при этом не касаясь сторон чашки, используя стерильный шпатель (6.12), до тех пор пока на поверхности агара не исчезнет вся видимая жидкость.

При необходимости данную процедуру повторяют с последующими десятикратными разведениями.

Если для некоторых видов продукции необходимо оценить небольшое количество Campylobacter, предел подсчета может быть снижен на коэффициент 10 путем исследования 1,0  исходной суспензии.

1,0  посева распределяют на поверхности агаровой среды в широкой чашке Петри диаметром 140 мм или на поверхности агаровой среды в трех небольших чашках диаметром 90 мм, используя стерильный шпатель (6.12). В обоих случаях приготовляют дублирующие пробы, используя две большие чашки или шесть маленьких чашек.

9.2.2 Чашки (9.2.1) инкубируют при температуре 41,5°С в течение 40 - 48 ч в аэробных условиях (6.14).

9.3 Подсчет и отбор колоний для подтверждения

9.3.1 На агаре mCCD типичные колонии имеют сероватый цвет, нередко с металлическим отблеском, они плоские и влажные, с тенденцией к распространению. Размеры колоний уменьшаются на более сухой агаровой поверхности. Могут появиться другие формы колоний.

Отбирают чашки (9.2.2), содержащие менее 150 типичных или подозрительных колоний; эти колонии подсчитывают. Затем отбирают случайным образом пять таких колоний для субкультивирования для проведения подтверждающих испытаний (9.4).

9.3.2 Проводят штриховой посев каждой из отобранных колоний (9.3.1) на чашки с колумбийским кровяным агаром (5.4) с целью содействия развитию изолированных колоний. Чашки инкубируют в аэробных условиях при температуре 41,5°С в течение 24 - 48 ч. Для исследования морфологии, подвижности, аэробного роста при температуре 25°С, аэробного роста при температуре 41,5°С и наличия оксидазы используют чистые культуры.

9.4 Подтверждение вида Campylobacte