Приложение В (обязательное). Состав и приготовление питательных сред и реактивов

Приложение В
(обязательное)

Состав
и приготовление питательных сред и реактивов

B.1 Бульон, содержащий пептон, сорбит и желчные соли (PSB)

В.1.1 Состав:

ферментативный гидролизат казеина - 5,0 г;

сорбит - 10,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

натрий фосфорнокислый двузамещенный () - 8,23 г;

натрий фосфорнокислый однозамещенный моногидрат () - 1,2 г;

желчные соли - 1,5 г;

вода - 1000 .

В.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,60,2 при температуре 25°С.

Разливают среду в пробирки или колбы подходящей вместимости, чтобы получить порции, необходимые для испытуемых проб (см. 9.1.2).

Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.2 Бульон, содержащий иргазан, тикарциллин, хлорат калия (ITC)

B.2.1 Основа среды

B.2.1.1 Состав:

ферментативный гидролизат казеина - 10,0 г;

дрожжевой экстракт - 1,0 г;

магний хлористый 6-водный () - 60,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

малахитовый зеленый, 0,2% водный раствор - 5,0 ;

вода - 1000 .

B.2.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,90,2 при температуре 25°С.

Разливают основу среды в колбы (6.7) подходящей вместимости, для получения необходимых порций (например, 988  для 1 готовой среды). Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.2.2 Раствор тикарциллина (1 )

B.2.2.1 Состав

тикарциллин - 10,0 мг;

вода - 10 .

В.2.2.2 Приготовление

Растворяют тикарциллин в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.2.3 Иргазан [5-хлоро-2-(2,4-дихлорофенокси)фенол], спиртовой раствор (1 )

B.2.3.1 Состав:

иргазан - 10,0 мг;

этанол, 95% (по объему) - 10,0 .

B.2.3.2 Приготовление

Растворяют иргазан в этаноле перед использованием или хранят раствор при температуре минус 20°С не более четырех недель.

B.2.4 Раствор хлората калия (100 )

B.2.4.1 Состав:

калия хлорат () - 10,0 г;

вода - 100 .

B.2.4.2 Приготовление

Растворяют хлорат калия в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.2.5 Готовая среда

В.2.5.1 Состав:

основа среды (В.2.1) - 988 ;

раствор тикарциллина (В.2.2) - 1 ;

раствор иргазана (В.2.3) - 1 ;

раствор хлората калия (В.2.4) - 10 .

В.2.5.2 Приготовление

При необходимости, добавляют, соблюдая правила асептики, растворы тикарциллина, иргазана и хлората калия к основе среды, охлаждают до 47°С и перемешивают.

Асептически разливают среду в пробирки по 10  или колбы подходящей вместимости по 100  (см. 9.1.3), при этом должно быть минимальное соотношение свободного объема к объему среды (относительный анаэробиоз).

В.3 Агар, содержащий цефсулодин, иргазан и новобиоцин (CIN)

B.3.1 Основа среды

B.3.1.1 Состав:

ферментативный гидролизат желатина - 17,0 г;

ферментативный гидролизат казеина и тканей животных - 3,0 г;

дрожжевой экстракт - 2,0 г;

маннит - 20,0 г;

пируват натрия - 2,0 г;

натрия хлорид - 1,0 г;

магния сульфат 7-водный () - 0,01 г;

дезоксихолат натрия - 0,5 г;

нейтральный красный - 0,03 г;

кристаллический фиолетовый - 0,001 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.3.1.2 Приготовление

Растворяют при кипячении компоненты или дегидратированную основу в воде. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,40,2 при температуре 25°С.

Разливают основную среду в колбы (6,7) подходящего объема. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.3.2 Раствор цефсулодина (15 )

B.3.2.1 Состав:

цефсулодин - 1,5 г;

вода - 100 .

B.3.2.2 Приготовление

Растворяют цефсулодин в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.3.3 Иргазан [5-хлоро-2-(2,4-дихлорофенокси) фенол], спиртовой раствор (4 )

B.3.3.1 Состав:

иргазан - 0,4 г;

этанол, 95% (от объема) - 100 .

B.3.3.2 Приготовление

Перед применением растворяют иргазан в этаноле, допускается хранение раствора при температуре приблизительно минус 20°С не более четырех недель.

B.3.4 Раствор новобиоцина (2,5 )

B.3.4.1 Состав:

новобиоцин - 0,25 г;

вода - 100 .

B.3.4.2 Приготовление

Растворяют новобиоцин в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.3.5 Готовая среда

B.3.5.1 Состав:

основа среды (В.3.1) - 997 ;

раствор цефсулодина (В.3.2) - 1 ;

раствор иргазана (В.3.3) - 1 ;

раствор новобиоцина - 1 .

B.3.5.2 Приготовление

Добавляют асептически раствор каждого антибиотика к основе среды, охлажденной до 45°С, и перемешивают.

B.3.5.3 Приготовление чашек с CIN агаром

Разливают в стерильные чашки Петри (6.8) приблизительно по 15 - 20  готовой среды. Оставляют на горизонтальной поверхности для застывания.

B.4 Сальмонелла/Шигелла агар с дезоксихолатом натрия и хлоридом кальция (SSDC)

B.4.1 Состав:

дрожжевой экстракт - 5,0 г;

мясной экстракт - 5,0 г;

ферментный гидролизат животных тканей - 5,0 г;

лактоза - 10,0 г;

желчные соли - 8,5 г;

дезоксихолат натрия - 10,0 г;

хлорид кальция - 1,0 г;

цитрат натрия - 10,0 г;

тиосульфат натрия 5-водный () - 8,5 г;

железо (III) цитрат - 1,0 г;

бриллиантовый зеленый - 0,0003 г;

нейтральный красный - 0,025 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.4.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде при кипячении. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 7,40,2 при температуре 25°С. Не стерилизуют.

B.4.3 Приготовление чашек с SSDC агаром

Разливают в стерильные чашки Петри (6.8) приблизительно по 15 - 20  готовой среды, охлажденной до 45°С. Оставляют на горизонтальной поверхности для застывания.

Приготовленные заранее чашки с неподсушенным агаром должны храниться в темном месте одну неделю при температуре (82)°С в пластиковом пакете. Не следует охлаждать их до температуры (32)°С, так как в среде образуется осадок и ухудшаются ее характеристики.

B.5 Питательный агар

B.5.1 Состав:

мясной экстракт - 3,0 г;

пептон - 5,0 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.5.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,00,2 при температуре 25°С. Разливают среду в колбы (6.7) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.5.3 Приготовление чашек с питательным агаром

Разливают в стерильные чашки Петри (6.8) приблизительно по 15 - 20  готовой среды, охлажденной до 45°С. Оставляют на горизонтальной поверхности для застывания.

B.6 Среда уреаза/индол

B.6.1 Состав:

L-Триптофан, не содержащий индол - 3,0 г;

однозамещенный фосфорнокислый калий () - 1,0 г;

двузамещенный фосфорнокислый калий () - 1,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

мочевина - 20,0 г;

этанол 95% (по объему) - 10 ;

феноловый красный - 0,025 г;

вода - 1000 .

B.6.2 Приготовление

Растворяют L-Триптофан в воде, нагретой до 60°С, охлаждают, затем растворяют остальные компоненты в воде, размешивая их.

Альтернативный путь - размешивание дегидратированной основы в воде.

Если необходимо, регулируют рН так, чтобы он составлял 6,90,2 при температуре 25°С. Стерилизуют фильтрованием. Асептически разливают среду по 0,5  в стерильные пробирки размером 1250 мм (6.6). Хранят в темном месте при температуре (32)°С.

B.7 Реактив Ковача

B.7.1 Состав:

4-диметиламинобензальдегид - 5,0 г;

соляная кислота, плотностью = от 1,18 г/ до 1,19 - 25 ;

2-метилбутан-2-ол - 75 .

B.7.2 Приготовление

Растворяют 4-диметиламинобензальдегид в 2-метилбутан-2-оле на водяной бане при температуре 60°С. Охлаждают до комнатной температуры и помещают колбы в ледяную ванну. Затем осторожно добавляют соляную кислоту, медленно перемешивая. Хранят при температуре (32)°С во флаконах янтарного цвета. Не следует применять резиновые бутылочные крышки, так как они портят реактивы.

B.8 Агар Клиглера

B.8.1 Состав:

мясной экстракт - 3,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

казеин панкреатический пептон - 20,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

лактоза - 10,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

железо (II) сульфат - 0,2 г;

тиосульфат натрия 5-водный () - 0,3 г;

феноловый красный - 0,025 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.8.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя ее до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,40,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 10  в пробирки (6.6) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

Оставляют пробирки в наклонном положении, пока агар застывает, так, чтобы получить столбик приблизительно 3 см высотой и скошенную поверхность длиной 5 см.

B.9 Реактив для выявления оксидазы

B.9.1 Состав:

N,N,N',N'-тетраметил-пара-фенилендиамин дихлоргидрат - 1,0 г**;

вода - 100 .

B.9.2 Приготовление

Растворяют реактивы в воде непосредственно перед использованием.

Хранить при температуре (32)°С в темном месте не более одной недели.

B.10 Лизин декарбоксилазная среда

B.10.1 Состав:

L-лизин моногидрохлорид - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

бромкрезоловый пурпурный - 0,015 г;

вода - 1000 .

B.10.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, нагревая при необходимости.

Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,80,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 5  в пробирки, размером 9180 мм (6.6). Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.11 Орнитин декарбоксилазная среда

В.11.1 Состав:

L-орнитин моногидрохлорид - 5,0 г;

дрожжевой экстракт - 3,0 г;

глюкоза - 1,0 г;

бромкрезоловый пурпурный - 0,015 г;

вода - 1000 .

В.11.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, при необходимости производя нагрев. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,80,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 5  в пробирки, размером 9180 мм (6.6). Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.12 Среда для ферментации углеводов (пептонная вода с феноловым красным, рамнозой или сахарозой, или трегалозой, или ксилозой)

B.12.1 Основа среды

В.12.1.1 Состав:

пептон - 10,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

феноловый красный - 0,02 г;

вода - 1000 .

В.12.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, нагревая при необходимости. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,8 0,2, при температуре 25°С. Разливают основную среду в колбы (6.7) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 10 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.12.2 Растворы углеводов (рамнозы, сахарозы, трегалозы или ксилозы, 100 )

В.12.2.1 Состав:

углевод (рамноза, сахароза, трегалоза или ксилоза) - 10,0 г;

вода - 100 .

В.12.2.2 Приготовление

Готовят отдельные растворы каждого углевода, добавляя его в дистиллированную воду. Стерилизуют фильтрацией.

В.12.3 Готовая среда

В.12.3.1 Состав:

основа среды (В.12.1) - 900 ;

раствор углевода (В.12.2) - 100 .

В.12.3.2 Приготовление

Для каждого углевода добавляют асептически раствор углевода в основу среды, охлажденную до 45°С, и перемешивают.

Разливают с соблюдением правил асептики готовую среду по 100  в пробирки (6.6) или бутылки (6.7) подходящей вместимости.

B.13 Цитратная среда Симмонса

B.13.1 Состав:

натрия цитрат - 2,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

двузамещенный фосфорнокислый калий () - 1,0 г;

бромотимоловый голубой - 0,08 г;

аммония дигидрофосфат () - 1,0 г;

магния сульфат - 0,2 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.13.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя ее до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,80,2, при температуре 25°С. Разливают среду по 10  в пробирки (6.6) подходящей вместимости. Если новые пробирки не доступны, перед использованием необходимо тщательно очистить имеющиеся; важно, чтобы в них не оставалось веществ, способных помешать данному исследованию.

Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С. Оставляют пробирки в наклонном положении для получения скошенной поверхности и столбика высотой 2,5 см.

B.14 Среда для теста на Твин-эстеразу

B.14.1 Основа среды

В.14.1.1 Состав:

пепсиновый гидролизат мяса - 10,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

кальция хлорид () - 0,1 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

В.14.1.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, при необходимости нагревая. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,40,2 при температуре 25°С. Стерилизуют в течение 30 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С

B.14.2 Готовая среда

В.14.2.1 Состав:

основа (В.14.1) - 990 ;

Твин (сорбитол моно-олеат) - 10 .

В.14.2.2 Приготовление

Добавляют раствор Твин к жидкой основе и гомогенизируют. Стерилизуют в течение 30 мин в автоклаве (6.1) при температуре 110°С. Разливают среду по 2,5  в пробирки (6.6) подходящей вместимости.

Кладут пробирки практически в горизонтальное положение так, чтобы получить длинную скошенную поверхность с минимальным столбиком.

B.15 Агар с желчью и эскулином

B.15.1 Состав:

мясной экстракт - 3,0 г;

мясной пептон - 5,0 г;

эскулин - 1,0 г;

желчные соли - 40,0 г;

железо (III) цитрат - 0,5 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.15.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя ее до слабого кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 6,60,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 10  в пробирки (6.6) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

Оставляют пробирки в наклонном положении для получения столбика высотой 2,5 см.

B.16 Казеин-соевый агар

B.16.1 Состав:

ферментный гидролизат казеина - 15,0 г;

соевый пептон - 5,0 г; натрия хлорид - 5,0 г;

агар - 9 - 18 г*;

вода - 1000 .

B.16.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя ее до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,30,2 при 25°С. Разливают среду в колбы (6.7) подходящей вместимости и в количестве 830 . Эта среда требуется для использования в В.19.5.1. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.17 Казеин-соевый агар для выявления пиразинамидазы

В.17.1 Состав:

ферментный гидролизат казеина - 15,0 г;

соевый пептон - 5,0 г;

пиразинкарбоксиамид () - 1,0 г;

натрия хлорид - 5,0 г;

агар - 9 - 18 г*;

трис-малеат буфер (0,2 , рН 6) - 1000 .

В.17.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, доводя ее до кипения. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,30,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 10 в колбы (6.7) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

После стерилизации оставляют застывать в наклонном положении для получения длинной скошенной поверхности.

B.18 Раствор сульфата аммония железа (II) для выявления пиразинамидазы

B.18.1 Состав:

сульфат аммония железа (II) - 1,0 г;

вода - 100 .

B.18.2 Приготовление

Растворяют сульфат аммония железа (II) в воде. Желательно немедленное использование.

B.19 Казеин-соевый агар с магнием и оксалатом

B.19.1 Основа среды (см. В.16)

B.19.2 Раствор хлорида магния

В.19.2.1 Состав:

хлорид магния 6-водный () (0,25 ) - 5,09 г;

вода - 100 .

В.19.2.2 Приготовление

Растворяют хлорид магния в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.19.3 Раствор оксалата натрия

В.19.3.1 Состав:

оксалат натрия - 3,35 г;

вода - 100 .

В.19.3.2 Приготовление

Растворяют оксалат натрия в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.19.4 Раствор глюкозы

B.19.4.1 Состав:

глюкоза - 18,0 г;

вода - 100 .

B.19.4.2 Приготовление

Растворяют глюкозу в воде. Стерилизуют фильтрацией.

B.19.5 Готовая среда

В.19.5.1 Состав:

основа среды (В.16) - 830 ;

раствор хлорида магния (В.18.2) - 80 ;

раствор оксалата натрия (В.18.3) - 80 ;

раствор глюкозы (В.18.4) - 10 .

В.19.5.2 Приготовление

Добавляют асептически растворы хлорида магния, оксалата натрия и глюкозы к основе среды, охлажденной до 47°С, и перемешивают.

В.19.5.3 Приготовление чашек с агаром.

Разливают по 15 - 20  агара в каждую стерильную чашку Петри (6.8). Оставляют в горизонтальном положении для застывания.

B.20 Солевой раствор

B.20.1 Состав:

натрия хлорид - 5 г;

вода - 1000.

B.20.2 Приготовление

Растворяют хлорид натрия в воде. Разливают раствор в колбы (6.7) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С

B.21 Гидроксид калия в солевом растворе

B.21.1 Состав:

гидроксид калия (КОН) - 0,5 г;

солевой раствор (В.20) - 100 .

B.21.2 Приготовление

Растворяют гидроксид калия в солевом растворе. Разливают раствор в колбы (6.7) подходящей вместимости. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

Примечание - Раствор 40%-ного гидроксида калия может быть приготовлен и храниться при (32)°С. Разведение 1:80 этого раствора позволяет получать 0,5%-ный раствор КОН в 0,5%-ном растворе .

B.22 Настой телячьего бульона

B.22.1 Состав:

телячья настойка (дегидратированная) - 500 г;

ферментный гидролизат казеина - 10 г;

натрия хлорид - 5 г;

вода - 1000 .

B.22.2 Приготовление

Растворяют компоненты или дегидратированную основу в воде, при необходимости нагревая. Если необходимо, регулируют рН так, чтобы после стерилизации он составлял 7,40,2 при температуре 25°С. Разливают среду по 10  в пробирки (6.6) и закрывают. Стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

B.23 Стерильный глицерин

Разливают глицерин по 100  в колбы или бутылки и стерилизуют в течение 15 мин в автоклаве (6.1) при температуре 121°С.

_____________________________