9 Порядок проведения испытания (см. приложение А)

9 Порядок проведения испытания (см. приложение А)

9.1 Проба для испытания и исходная суспензия

9.1.1 См. соответствующую часть ISO 6887 или ISO 8261, или стандарта на конкретный продукт.

9.1.2 Для приготовления исходной суспензии помещают количество (х) пробы для испытания (известной массы или объема) в известный объем PSB бульона (В.1), для достижения разведения 1/10 (по массе к объему или объему к объему). Гомогенизируют суспензию, используя перистальтический блендер в течение 2 мин.

9.1.3 Готовят вторую исходную суспензию по тому же принципу с ITC бульоном (В.2) так, чтобы получить соотношение навески к среде обогащения разведением 1/100 (масса к объему или объем к объему).

9.2 Обогащение

Инкубируют две исходные суспензии (9.1.2 и 9.1.3) следующим образом:

a) PSB среду при температуре от 22°С до 25°С от 42 до 72 ч с перемешиванием или в течение пяти дней без перемешивания.

b) ITC среду при температуре 25°С в течение 48 ч.

9.3 Пересев и идентификация

9.3.1 После инкубации в среде обогащения (9.2) необходимо провести следующие операции:

9.3.2 Культуру, выросшую на PSB бульоне (9.2), пересевают посредством петли (6.11) на поверхность чашки Петри с CIN агаром (В.3) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.3 Используя стерильную пипетку (6.9), переносят 0,5  культуры, выросшей на PSB бульоне (9.2), в 4,5  раствора гидроксида калия (В.21) и перемешивают. После выдержки в течение (205) с инокулируют с помощью петли (6.11) поверхность чашки с CIN агаром (В.3) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.4 Культурой, выросшей на ITC бульоне (9.2), инокулируют с помощью петли (6.11) поверхность чашки с SSDC агаром (В.4) для получения хорошо изолированных колоний.

9.3.5 Переворачивают чашки вверх дном (9.3.2 - 9.3.4) и помещают их в термостат (6.2) при температуре 30°С.

9.3.6 После инкубирования в течение 24 ч проверяют чашки с помощью увеличительного стекла (6.14), предпочтительно снабженного косым светом (6.13) с целью выявления присутствия колоний, типичных для Yersinia enterocolitica по следующим признакам:

a) на CIN агаре типичные колонии Yersinia enterocolitica мелкие (1 мм), ровные с красным центром и полупрозрачными краями, при проверке с помощью косого света (6.13) не имеют радужного перелива и тонко гранулированы;

b) на SSDC агаре типичные колонии Yersinia enterocolitica мелкие (1 мм) и серые с расплывчатыми краями, не обладают радужным переливом и тонко гранулированы при проверке под лучами косого света.

Примечание - Косой падающий свет помогает отличать типичные колонии Yersinia enterocolitica от похожих колоний бактерий рода Pseudomonas.

9.3.7 Если рост колоний медленный - окраска слабая или если нет типичных колоний - продолжается инкубация в чашках до 48 ч, и затем их снова просматривают.

9.4 Подтверждение

9.4.1 Для биохимической идентификации может быть использован коммерчески доступный и позволяющий проводить идентификацию Yersinia enterocolitica набор. Некоторые минимальные наборы для биохимической идентификации не идентифицируют точно такие виды бактерий рода Yersinia как Yersinia mollaretii и Yersinia bercovieri (прежние биовары Yersinia enterocolitica 3А и 3В) и Yersinia intermedia, которые идентифицируются как Yersinia enterocolitica. В этом случае должно быть проведено определение образования кислоты из муката. Требуется улучшение различительных тестов данных минимальных наборов для биохимической идентификации.

9.4.2 Отбор колоний для подтверждения

9.4.2.1 Для подтверждения берут с каждой чашки каждой селективной среды (см. 9.3.2 - 9.3.4) пять колоний, считающихся типичными или предположительно типичными. Переносят отобранные колонии на поверхность чашек с питательным агаром (В.5) таким образом, чтобы получить рост хорошо изолированных колоний.

Посевы инкубируют при температуре 30°С в течение 24 ч.

Проверяют чашки на чистоту культуры. Если присутствуют смешанные культуры, то переносят каждую индивидуальную колонию снова на питательный агар и инкубируют, как указано выше.

Используют только чистые культуры для биохимических подтверждений и тестов на патогенность.

9.4.2.2 Плазмиды, которые определяют свойства патогенности бактерий рода Yersinia, могут быть спонтанно потеряны во время культивирования свыше 30°С или при длительном культивировании при температуре ниже 30°С.

Поэтому их сохраняют как замороженные культуры путем немедленного культивирования каждой чистой культуры в настое телячьего бульона (В.22).

Посевы инкубируют при температуре от 22°С до 25°С в течение от 24 до 48 ч. Добавляют 10%-ный стерильный глицерин (В.23), хорошо перемешивают и замораживают, предпочтительно до температуры минус 70°С.

9.4.3 Тесты для определения принадлежности культур к Yersinia enterocolitica

9.4.3.1 При помощи петли (6.11) инокулируют среды по 9.4.3.2 - 9.4.3.4 и проводят определение оксидазы, как описано в 9.4.3.5, для каждой культуры, полученной из колоний, отобранных по 9.4.2.

9.4.3.2 Определение уреазы (гидролиза мочевины)

Необходимо использовать прочный инструмент для инокуляции бульона под поверхность уреаза/индол среды (В.6).

Посевы инкубируют при температуре 30°С в течение 24 ч, предпочтительно на водяной бане.

Розовато-фиолетовый или красно-розовый цвета указывают на положительную уреазную реакцию. Yersinia enterocolitica в большинстве случаев дает положительную реакцию на уреазу в течение от 1 до 5 мин. Скорость позитивной реакции может быть критерием диагностической оценки.

Оранжево-желтый цвет указывает на негативную уреазную реакцию (отсутствие гидролиза мочевины). Может иметь место ложная негативная реакция, если среда инокулирована микроорганизмами, не относящимися к Yersinia enterocolitica.

9.4.3.3 Определение образования индола

Добавляют от 0,1 до 0,2  реактива (В.7) в пробирки (9.4.3.2) для выявления индола. Красное кольцо, которое образуется в течение 15 мин на поверхности среды, указывает на позитивную реакцию.

9.4.3.4 Определение роста на агаре Клиглера

Проводят посев уколом столбика агара и затем проводят посев по всей скошенной поверхности (В.7.2).

Посевы инкубируют при температуре 30°С в течение от 24 до 48 ч.

Интерпретируют изменения в среде следующим образом:

a) столбик агара

- желтый - глюкоза положительная (ферментирует глюкозу);

- красный или неизменившийся: глюкоза отрицательная (глюкозу не ферментирует);

- черный - образование сероводорода;

- пузырьки или разрывы - образование газа из глюкозы;

b) скошенная поверхность агара

- желтая: лактоза положительная (утилизация лактозы);

- красная или неизменившаяся: лактоза отрицательная (нет утилизации лактозы).

9.4.3.5 Выявление оксидазы

Используя стеклянный стержень или петлю из платины/иридия (6.11), отбирают часть каждой выбранной типичной колонии (9.4.2) и распределяют ее на слегка влажной (одна капля) фильтровальной бумаге с реактивом на оксидазу (В.9) или на диске, который имеется в продаже. Не используют петлю или проволоку из никеля/хрома (см. 6.11).

Тест считается отрицательным, если цвет фильтровальной бумаги не изменился на розовато-лиловый, фиолетовый или глубокий голубой в течение 10 с.

9.4.4 Тесты биохимического подтверждения

9.4.4.1 Отбор колоний и процедура

9.4.4.1.1 Идентификация колоний включает:

- гидролиз мочевины: положительная;

- образование индола: положительная или отрицательная;

- ферментация глюкозы: положительная;

- образование газа из глюкозы: отрицательная;

- ферментация лактозы: отрицательная;

- образование сероводорода: отрицательная;

- выявление оксидазы: отрицательная.

Примечания

1 Мочевиноотрицательные виды существуют, но не известны как патогенные.

2 При образовании газа из глюкозы может образовываться несколько пузырьков. Хотя считается, что Yersinia, как правило, ферментирует углеводы без образования газа, некоторые виды Yersinia enterocolitica (такие, как Yersinia enterocolitica биовар 3) могут образовывать один или два пузырька (слабое газообразование).

3 Некоторые виды Yersinia enterocolitica являются лактозоположительными и извлекаются главным образом из молочных продуктов. Согласно современным знаниям они, в основном, не патогенны.

9.4.4.1.2 Используя петлю или проволоку (6.11), инокулируют среды по 9.4.4.2 - 9.4.4.5 каждой культурой, полученной из изолированных колоний (9.4.2) на питательном агаре и отобранных согласно 9.4.4.1.1.

9.4.4.2 Выявление лизиндекарбоксилазы

Проводят посевы под поверхность жидкой среды (В.10). Если пробирки не полностью наполнены средой и негерметичны, то покрывают их поверхность расплавленным (нагретым и затем сразу охлажденным, но так, что остается жидким) вазелиновым маслом или стерильным жидким парафином.

Посевы инкубируют при 30°С в течение 24 ч.

Фиолетовый цвет после инкубирования свидетельствует о положительной реакции. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.4.4.3 Выявление орнитиндекарбоксилазы

Проводят посевы под поверхность жидкой среды (В.11). Если пробирки не полностью наполнены средой и негерметичны, то наслаивают на поверхность расплавленное (нагретое и затем сразу охлажденное, но так, чтобы оставалось жидким) вазелиновое масло или стерильный жидкий парафин.

Инкубируют при 30°С в течение 24 ч.

Фиолетовый цвет после инкубирования свидетельствует о положительной реакции.

Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.4.4.4 Ферментация сахарозы, рамнозы, тригалозы и ксилозы

Инокулируют каждую среду (В. 12) под поверхность жидкости.

Посевы инкубируют при 30°С в течение 24 ч.

Желтый цвет после инкубирования свидетельствует о положительной реакции. Красный цвет указывает на отрицательную реакцию.

9.4.4.5 Определение гидролиза цитрата

Засевают скошенную поверхность агара (В.13). Крышки пробирок закрывают неплотно так, чтобы воздух мог поступать для создания аэробных условий роста.

Посевы инкубируют при 30°С в течение 24 ч.

Реакция положительная, если среда становится голубой.

9.4.4.6 Выявление твин-эстеразы

Засевают скошенную поверхность агара (В.14).

Посевы инкубируют при 25°С в течение пяти дней и периодически проверяют. Реакция положительна если зоны просветления стремительно расширяются в зависимости от появления микрокристаллов олеата кальция.

9.4.5 Тест на условную патогенность.

9.4.5.1 Отбор колоний и процедура

9.4.5.1.1 Для изучения используют колонии, которые имеют следующие характеристики:

- выявление лизиндекарбоксилазы: отрицательная;

- выявление орнитиндекарбоксилазы: положительная;

- ферментация рамнозы: отрицательная;

- ферментация сахарозы: положительная;

- гидролиз цитрата: отрицательная.

Примечания

1 Редкие виды условно-патогенных бактерий Yersinia enterocolitica, являющиеся сахарозоотрицательными, выделяют из свинины.

2 У биоваров Yersinia enterocolitica 4 и 5 отмечена отрицательной реакцией на орнитиндекарбоксилазу.

9.4.5.1.2 Используя петлю или проволоку (6.11), инокулируют среды по 9.4.5.2 - 9.4.5.4 каждой чистой культурой на питательном агаре из отобранных колоний (9.4.5.1).

9.4.5.2 Ферментация эскулина

Засевают скошенную поверхность (В.15) агара. Посевы инкубируют при 30°С в течение 24 ч.

Черный ореол вокруг колоний указывает на положительную реакцию.

Примечание - Этот тест для ферментации эскулина эквивалентен тесту для ферментации салицина.

9.4.5.3 Выявление пиразиномидазы

Инокулируют скошенную поверхность среды (В.17).

Посевы инкубируют при (301)°С в течение 48 ч.

Добавляют 1  1%-ного железо (II) аммоний сульфата (В.18)

Появление через 15 мин розовато-коричневого цвета указывает на положительную реакцию.

9.4.5.4 Тест на усвоение кальция при 37°С

9.4.5.4.1 Тест на усвоение кальция при 37°С может быть заменен утилизацией ацетата натрия.

Примечание - Тесты, инкубируемые при 37°С, могут повлечь потерю этого свойства, так как гены, в которых закодировано данное свойство, находятся в плазмидах.

9.4.5.4.2 Из каждой чистой культуры, изолированной на питательном агаре (9.4.5.1), суспендируют небольшую порцию колонии в растворе хлорида натрия (В.20) для получения суспензии с содержанием приблизительно 1000 бактерий в .

Инокулируют 0,1  каждой суспензии:

- две чашки с казеин-соевым агаром (В.16), и

- две чашки с казеин-соевым агаром с магнием и оксалатом (В. 19).

Инкубируют одну чашку каждой среды при температуре 25°С в течение 48 ч, и другую - при температуре 37°С в течение 48 ч.

9.4.5.4.3 Реакция считается положительной, если при 25°С колонии стандартного размера и если при 37°С, в присутствии магния и оксалата, ингибирование культуры проявляется в том, что 20% колоний меньше по размеру, достигая 0,1 мм в диаметре, а остальные от 0,5 до 1 мм.

Те колонии, которые ингибируются, являются зависимыми от кальция и считаются условно патогенными.

9.4.6 Интерпретация биохимических тестов и тестов на патогенность

9.4.6.1 Виды условно-патогенных бактерий Yersinia enterocolitica в основном показывают реакции, представленные в таблице 1; могут быть проведены дополнительные тесты (см. таблицу С.1).

Таблица 1 - Интерпретация биохимических тестов и тестов на патогенность для Yersinia enterocolitica

Тест	Реакция
Определение вида
Мочевина (9.4.3.2)	+
Индол (9.4.3.3)	-/+(a)
Глюкоза (9.4.3.4)	+
Образование газа из глюкозы (9.4.3.4)	-
Лактоза (9.4.3.4)	-
Сероводород (9.4.3.4)	-
Оксидаза (9.4.3.5)	-
Лизин декарбоксилаза (9.4.4.2)	-
Орнитин декарбоксилаза (9.4.4.3)	+
Сахароза (9.4.4.4)	+
Трегалоза (9.4.4.4)	+/-(b)
Рамноза (9.4.4.4)	+/-(b)
Ксилоза (9.4.4.4)	+/-(b)
Цитрат (9.4.4.5)	-
Твин-эстераза (9.4.4.6)	+/-(b)
Определение патогенное
Эскулин (9.4.5.2)	-
Пиразиномидаза (9.4.5.3)	-
Зависимость от кальция при 37°С (9.4.5.4)(с)	+
(a) Биовар 1 и несколько сероваров биовара 2 индол положительны. Биовары 3, 4, 5 и некоторые серовары биовара 2 индол отрицательны. (b) В зависимости от биовара Yersinia enterocolitica (приложение С). (c) Характеристика патогенности закодирована в вирулентности плазмид.

9.4.6.2 Определение биовара Yersinia enterocolitica в соответствии с тестами, предложенными в таблице Д.1 (приложение Д) должно проводиться, главным образом, для подтверждения условной патогенности (Твин-эстераза, эскулин, пиразинамидаза, индол, ксилоза, трегалоза). Биовары Yersinia enterocolitica 1В, 2, 3, 4 и 5 являются патогенными.

9.4.6.3 Тесты на эскулин и пиразинамидазу проводят с целью выявления условной патогенности. Виды, показывающие эскулин и/или пиразинамидаза положительную реакцию и отрицательную реакцию на зависимость от кальция при 37°С, не являются патогенными. Виды, показывающие эскулин и пиразинамидаза отрицательную реакцию и положительную реакцию на зависимость от кальция при 37°С являются патогенными. Тесты на выявление патогенности следует проводить регулярно.

9.4.6.4 По эпидемиологическим показаниям должно быть проведено выявление соматических антигенов бактерий Yersinia enterocolitica. Для условно-патогенных видов используют соответствующие антисыворотки, обычно принадлежащие сероварам О:3, О:8 и О:5,27.