Приложение А (обязательное). Приготовление липазы и проверка ее активности

Приложение А
(обязательное)

Приготовление липазы и проверка ее активности

А.1 Приготовление липазы

Охлаждают 5 кг свежей свиной поджелудочной железы до 0°С. Удаляют твердый жир и соединительную ткань, ее окружающую, и измельчают железу до получения жидкой пасты. Перемешивают эту пасту с 2,5 безводного ацетона в течение 4 - 6 ч на холоде и затем центрифугируют. Экстрагируют остаток еще трижды таким же объемом ацетона; дважды - смесью ацетона и этилового эфира в соотношении 1 : 1 по объему и дважды - этиловым эфиром. Высушивают остаток в течение 48 ч под вакуумом до образования порошка. Порошок хранят в холодильнике.

А.2 Проверка активности липазы

Готовят масляную эмульсию, встряхивая смесь 165  гуммиарабика концентрации 100 , 15 г дробленого льда и 20  предварительно нейтрализованной пробы в течение 10 мин на пригодном для этой цели миксере. Наливают последовательно 10  эмульсии, 0,3  раствора холата натрия (200 ) и 20  дистиллированной воды в стакан вместимостью 50 . Помещают стакан в водяную баню при 37°С (см. примечание 1). В стакан опускают электроды рН-метра и пропеллерную мешалку и, используя бюретку вместимостью 5 , приливают по каплям раствор гидроокиси натрия с (NaOH) = 0,1 до тех пор, пока не будет достигнуто значение рН 8,5. Приливают соответствующий (см. примечание 2) и точно отмеренный объем 0,1%-ной водной суспензии анализируемого порошка липазы. Как только рН достигнет значения 8,3 по шкале рН-метра, включают секундомер и добавляют раствор NaOH так, чтобы значение рН 8,3 сохранялось. Записывают объем раствора щелочи, приливаемого каждую минуту в течение 10 мин. Наносят полученные данные на график, откладывая на оси Х время в минутах и на оси Y объем в сантиметрах кубических раствора щелочи, использованного для поддержания постоянного значения рН. Результат должен выражаться в виде прямой линии.

Примечания

1 Когда используют жидкое масло, гидролиз проводят при 37°С. Однако для испытания устанавливают температуру 40°С, позволяющую проанализировать жиры, имеющие температуру плавления до 45°С.

2 Для испытания образцов используют такое количество суспензии липазы, при котором потребляется 1  раствора щелочи за 4 - 5 мин. Такой результат обычно достигается при использовании 2  - 5  суспензии липазы, то есть от 1 до 5 мг порошка.

Единица липазы определяется как количество энзима, которое требуется для высвобождения 1 мкмоль кислоты в минуту при 37°С и рН 8,3.

Активность липазы А, выраженную в единицах липазы на миллиграмм использованного порошка, определяют по формуле

,

(А.1)

где V - объем израсходованного раствора гидроокиси натрия, разделенный на время, рассчитанный по графику, ;

с - концентрация раствора гидроокиси натрия, (с = 100);

m - масса испытуемой пробы порошка липазы; используемая липаза должна иметь активность от 8 до 20 единиц липазы на миллиграмм.