Приложение 1. Методика количественного определения афлатоксинов B1 и C1 в кормах

Приложение 1

Методика количественного определения афлатоксинов и в кормах
(утв. Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 7 апреля 1980 г.)

Метод основан на экстракции токсинов из кормов водным ацетоном, очистке экстракта от сопутствующих примесей гексаном, переэкстракции токсинов в хлороформ или бензол, их очистке на хроматографической колонке с силикагелем и окисью алюминия. Идентификация и количественное определение основано на методе хроматографии экстракта в тонком слое с использованием пластинок "Силуфол".

Чувствительность метода составляет 10 мкг/кг, время анализа - 3 часа.

1. Подготовка образца к анализу и экстрагирование токсинов

Полученный для исследования образец тщательно измельчают и перемешивают. Для анализа отбирают пробу массой 50 г в колбу емкостью 500 мл с притертой пробкой. Навеску заливают 150 мл смеси ацетон-вода (85 + 15), закрывают пробкой и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 45 мин. Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр в мерный цилиндр на 100 мл, отбирая первые 75 мл фильтрата.

2. Очистка экстракта

75 мл фильтрата переносят в делительную воронку на 500 мл. Цилиндр ополаскивают 5 мл ацетона и сливают в ту же делительную воронку. К фильтрату приливают 50 мл гексана, закрывают пробкой и энергично встряхивают 1,5-2 минуты. Затем в делительную воронку приливают 120 мл 4-процентного раствора NaCl, аккуратно перемешивают содержимое воронки и дают слоям разделиться. После этого нижний водно-ацетоновый слой сливают во вторую делительную воронку и в ней проводят переэкстракцию токсинов из водного ацетона в бензол или хлороформ.

2.1. При использовании хлороформа в делительную воронку приливают 25 мл его, аккуратно перемешивают и дают слоям разделиться. После разделения слоев нижний слой сливают в колбу на 200-250 мл через бумажный фильтр со слоем безводного сульфата натрия. Операцию переэкстрагирования повторяют еще трижды, каждый раз сливая нижний слой в ту же колбу. После этого промывают фильтр 10 мл хлороформа, полученный объединенный экстракт упаривают на водяной бане до объема 5 мл и используют для очистки на хроматографической колонке.

2.2. При переэкстракции афлатоксинов из водного ацетона в бензол в делительную воронку с экстрактом после обезжиривания гексаном вносят 25-30 мл бензола, встряхивают и после разделения слоев нижний слой отбрасывают, а бензольный экстракт, оставшийся в воронке, сливают в колбу на 100 мл. Делительную воронку промывают 10 мл бензола и сливают в ту же колбу. Объединенный бензольный экстракт упаривают на водяной бане, перерастворяют в 5 мл хлороформа и используют для очистки на хроматографической колонке.

2.3. В нижнюю часть хроматографической колонки помещают ватную пробку, вносят силикагель (высота столбика - 1 см) и на силикагель наслаивают окись алюминия (высота столбика - 2-2,5 см). На окись алюминия помещают слой безводного сульфата натрия 3 см. Колонку по мере наполнения обстукивают для лучшего уплотнения сорбентов.

В колонку количественно переносят упаренный до 5 мл экстракт, дают ему впитаться и элюируют токсины 100 мл смеси хлороформ - ацетон (9:1) под слабым разряжением, собирая элюат в колбу Бунзена. Из колбы Бунзена элюат количественно переносят в колбу Эрленмейера на 200 мл и упаривают на водяной бане до объема 4-5 мл. Упаренный элюат количественно переносят в мерную пробирку на 10 мл хлороформом и доводят объем до метки (основной раствор). Полученный экстракт используют для тонкослойной хроматографии.

3. Тонкослойная хроматография.

На пластинке отмечают линию старта в 1,5-2,0 см от нижнего края пластинки и наносят 20, 5, 2, 1 и 20 мкл из основного раствора (пробы 1, 2, 3, 4, 5 соответственно). На ту же пластинку в пятно основного раствора пробы 5 вносят 5 мкл стандартного раствора смеси афлатоксинов и рядом наносят на пластинку пробу стандартного раствора афлатоксинов в количестве 5 мкл (концентрация афлатоксинов и в стандартном растворе должна быть равна 1 мкг/мл каждого и по 0,5 мкг/мл для афлатоксинов и ). Пластинку подсушивают на воздухе до удаления растворителя и проводят последовательную хроматографию в двух системах растворителей. Сначала пластинку помещают в камеру, насыщенную парами системы толуол - этилацетат - 85% муравьиная кислота (5:4:1). Когда фронт растворителя поднимается на 10 см над линией старта, пластинку вынимают из камеры, подсушивают на воздухе и помещают в камеру с системой хлороформ - метанол (99:1) и разгоняют в том же направлении на расстояние 13 см от линии старта*. Пластинку просматривают в УФ-лучах (365 нм) афлатоксинов , , , равно соответственно 0,34; 0,29; 0,26 и 0,22. Вместо системы хлороформ - метанол (99:1) можно использовать систему четыреххлористый углерод - ацетон - уксусная кислота (20:10:1). Афлатоксинов в этом варианте - 0,38; 0,35; 0,33 и 0,29 соответственно для , , и . Если в пробе 4 отмечается интенсивная флуоресценция, соответствующая по величине и характеру свечения стандарту, делают разведение основного раствора в 50 раз. Для этого 0,1 мл основного раствора переносят в мерную пробирку на 5 мл и доводят объем раствора до метки хлороформом. Из приготовленного раствора на пластинку наносят 10 и 5 мкл (пробы 6 и 7) и проводят последовательную хроматографию, как описано выше. Концентрацию афлатоксинов определяют по таблице.

Примечание. * - Если необходимо определить только афлатоксин , хроматографируют пластинку только в системе толуол - этилацетат - 85% муравьиная кислота (5:4:1).

Номер пробы, в которой отмечают флуоресценцию	Концентрация и (мкг/кг)
1	10-20
2	>20
3	>50
4	>100
6	>500
7	>1000

4. Для более точного определения афлатоксинов в образце готовят разведение основного раствора в 2; 5; 10 или более раз и из приготовленного раствора наносят на пластинку постепенно увеличивающиеся в объеме пробы. После разгонки пластинки в хроматографических камерах ее проявляют в УФ-свете, отмечая наименьший объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию. Концентрацию каждого афлатоксина вычисляют по формуле:

, где:

V - конечный объем основного раствора с учетом разведений (мл);

W - навеска образца, соответствующая экстракту, вносимому на колонку (25 г);

200 - коэффициент пересчета токсина на кг корма с учетом минимально детектирующих количеств афлатоксинов на пластинке;

1,2 - коэффициент, учитывающий потери определяемых веществ в ходе анализа;

n - объем пробы, дающий на пластинке минимальную флуоресценцию (мкл);

G - концентрация афлатоксинов и (мкг/кг).