Приложение Б (рекомендуемое). Пероксидазный тест на подтверждение наличия гваякола

Приложение Б
(рекомендуемое)

Пероксидазный тест
на подтверждение наличия гваякола

Б.1 Сущность

Пероксидазный тест может применяться для подтверждения способности исследуемых микроорганизмов образовывать гваякол из ванилиновой кислоты. Такие виды, как А. acidoterrestris, A. acidiphilus, A. herbarius и пр., могут давать положительные результаты в данном тесте, но необязательно будут продуцировать гваякол во всей соковой продукции. Такие виды, как A. acidocaldarius, дают отрицательный результат в этом тесте. Поскольку результаты могут варьироваться в зависимости от активности исследуемой культуры и видов, важно включить в тест положительные и отрицательные контрольные культуры, т.е. A. acidoterrestris и A. acidocaldarius, соответственно, которые были выращены в тех же условиях, что и тестируемые колонии.

Определение основано на изменении цвета среды YSG с ванилиновой кислотой после реакции окисления пероксидом водорода. Реакция окисления катализируется пероксидазой. Гваякол окисляется до органического соединения красно-коричневого цвета, 3,3'-диметокси-4,4'-дифенилхинона (тетрагваякол) по следующей схеме:

Использование YSG-бульона с ванилиновой кислотой позволяет за короткий промежуток времени накопить концентрации гваякола на уровне 10 .

Б.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы

Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы - по разделу 6.

Б.3 Приготовление реагентов*

Б.3.1 Для проведения пероксидазного теста на наличие гваякола используют следующие реактивы:

- кислота 4-гидрокси-2-метоксибензойная (ванилиновая), , с массовой долей основного вещества не менее 97%;

- пероксид водорода по ГОСТ 10929 с массовой долей пероксида водорода 29% - 35%;

- пероксидаза хрена, лиофилизированный препарат с показателем чистоты RZ3, раствор с ферментативной активностью 5 Е/мг;

- кислота лимонная по ГОСТ 3652, раствор с массовой концентрацией 200 , готовят по ГОСТ 10444.1;

калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198 или двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493.

Б.3.2 Приготовление YSGVA-бульона с содержанием 250  ванилиновой кислоты

Взвешивают на весах 0,125 г ванилиновой кислоты и растворяют в стакане при перемешивании в 500  YSG-бульона.

Стерилизуют бульон путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120°С. После автоклавирования разливают по 2  в пробирки.

Б.3.3 Приготовление фосфатного буферного раствора

97 г двузамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 500  в дистиллированной воде, доводят до метки и перемешивают.

Стерилизуют путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120°С.

Буферный раствор хранят в склянке из темного стекла с плотно закрытой пробкой - не более 1 мес.

Б.3.4 Приготовление раствора пероксида водорода с объемной долей 1%

3,5  пероксида водорода переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100  и доводят объем дистиллированной водой до метки.

Раствор готовят непосредственно перед применением.

Б.3.5 Приготовление раствора гваякола с содержанием 1000 мг/ (контрольный раствор)

Взвешивают на весах 1,0 г гваякола и растворяют в мерной колбе вместимостью 1000  в дистиллированной воде, доводят до метки и перемешивают.

Стерилизуют путем автоклавирования в течение 10 мин при температуре 120°С.

Срок хранения раствора в холодильнике при температуре не более 10°С - не более 1 мес.

Б.4 Обнаружение

Б.4.1 Для каждой группы исследуемых колоний готовят по пять пробирок с 2  YSGVA-бульона.

Б.4.2 В первую пробирку с YSGVA-бульоном с помощью петли переносят несколько колоний (около 5 - 10, в зависимости от их размеров) с посева YSG-агара, культивированного при температуре (451)°С так, чтобы получилась умеренно густая суспензия. Тщательно перемешивают.

Б.4.3 Засевают положительную (A. acidoterrestris) и отрицательную (A. acidocaldarius) контрольные культуры в дополнительные YSGVA-бульоны. Тщательно перемешивают.

Б.4.4 Параллельно инкубируют еще два YSGVA-бульона без инокуляции: один используется в качестве холостой пробы, а второй - для контроля гваякола. В пробирку для контроля на гваякол добавляют 100  раствора гваякола.

Б.4.5 Инкубируют все пробирки при температуре (451)°С на водяной бане не менее 3 ч. Затем охлаждают содержимое пробирок до комнатной температуры.

Б.4.6 В каждую из трех пробирок с культурами последовательно добавляют:

- 1  фосфатного буфера;

- 20 мм раствора ;

- 20  раствора пероксидазы.

Б.4.7 Перемешивают содержимое пробирок и оставляют на 5 - 10 мин.

Б.4.8 Оценивают изменение цвета в пробирках и сравнивают с изменениями в контрольной пробе и пробиркой с гваяколом:

- положительная пробирка с культурой (коричневый цвет);

- отрицательная пробирка с культурой (бледный бежево-коричневый цвет, но без изменений);

- холостая проба (бледный бежево-коричневый цвет, но без изменений);

- контрольная пробирка на гваякол (густой коричневый/оранжевый цвет).

Б.4.9 Записывают результаты теста на гваякол как положительные для пробирок, показавших положительную реакцию, и как отрицательные для пробирок, показавших отрицательную реакцию.

Тест оценивают, как положительный или отрицательный для каждой группы исследованных колоний. Если результат промежуточный, то исследование повторяют с применением более насыщенной посевной культуры и соответствующих контрольных проб (положительной и отрицательной) или увеличивают период культивирования.