Межгосударственный стандарт ГОСТ 31716-2012 (ISO 8069:2005) "Молоко сухое. Определение содержания молочной кислоты и лактатов" (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1777-ст)

Межгосударственный стандарт ГОСТ 31716-2012 (ISO 8069:2005)

"Молоко сухое. Определение содержания молочной кислоты и лактатов"
(введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1777-ст)

Dried milk. Determination of content of lactic acid and lactates

Дата введения - 1 июля 2013 г.

Введен впервые

ГАРАНТ:

Курсив в тексте не приводится

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2-2009 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 Подготовлен Московской государственной академией пищевых производств на основе аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4

2 Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол N 51 от 1 октября 2012 г.)

За принятие проголосовали:

Краткое наименование страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Код страны по МК (ИСО 3166) 004-97	Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Беларусь	BY	Госстандарт Республики Беларусь
Казахстан	KZ	Госстандарт Республики Казахстан
Кыргызстан	KG	Кыргызстандарт
Молдова	MD	Молдова-Стандарт
Российская Федерация	RU	Росстандарт
Таджикистан	TJ	Таджикстандарт

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 ноября 2012 г. N 1777-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31716-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5 Настоящий стандарт модифицирован по отношению к международному стандарту ISO 8069:2005 Dried milk - Determination of content of lactic acid and lactates (Молоко сухое. Определение содержания молочной кислоты и лактатов) путем изменения отдельных слов, ссылок, которые выделены в тексте курсивом.

Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен (разработан) настоящий межгосударственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Росстандарте.

Сведения о соответствии межгосударственных стандартов ссылочным международным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА.

Степень соответствия - модифицированная (MOD).

Стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 51196-2010 (ИСО 8069:2005)

6 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает ферментативный метод селективного определения в сухом молоке содержания D- и L-изомеров молочной кислоты и ее солей лактатов.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю "Национальные стандарты", составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применен следующий термин с соответствующим определением:

3.1 содержание L- и D-молочной кислоты и L- и D-лактатов: Массовая доля молочной кислоты и лактатов, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в миллиграммах молочной кислоты на 100 г сухих обезжиренных веществ.

4 Сущность метода

Навеску пробы сухого молока растворяют в теплой воде, далее фильтруют. В полученный фильтрат вносят следующие биохимические реактивы - ферменты, коферменты и активаторы, которые добавляют одновременно, но в указанной последовательности для проведения следующих реакций:

а) для окисления L- и D-молочной кислоты, L- и D-лактата в присутствии никотинамидадениндинуклеотида () до пирувата и преобразования в восстановленную форму НАДН-L-лактатдегидрогеназу (L-ЛДГ) и D-лактатдегидрогеназу (D-ЛДГ);

b) для преобразования в присутствии L-глутамата пирувата в L-аланин и L-глутамата в -кетоглутарат - глутамат-пируват-трансаминазу (ГПТ).

Количество образовавшегося НАДН, которое пропорционально содержанию L- и D-молочной кислоты и L- и D-лактатов, определяют спектрофотометрически измерением оптической плотности инкубационной смеси при длине волны 340 нм.

5 Реактивы

Используют реактивы только установленной аналитической степени чистоты. Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть бидистиллированной, полученной на стеклянном оборудовании, а вода, используемая для других целей, должна быть дистиллированной.

5.1 Раствор калия гексацианоферрата(II), с = 35,9

Растворяют в воде 35,9 г тригидрата калия гексацианоферрата (II). Разбавляют водой до 1000  и перемешивают.

5.2 Раствор цинка сульфата, с () = 71,8

Растворяют в воде 71,8 г гептагидрата сульфата цинка. Разбавляют водой до 1000  и перемешивают.

5.3 Растворы натрия гидроксида

5.3.1 Раствор I натрия гидроксида, с (NaOH) = 10

Растворяют в воде 400 г натрия гидроксида. Разбавляют водой до 1000  и перемешивают.

5.3.2 Раствор II натрия гидроксида, с (NaOH) = 0,1

Растворяют 4,0 г натрия гидроксида в воде. Разбавляют водой до 1000  и перемешивают.

5.4 Раствор глицерина (), с объемной долей глицерина 50%

5.5 Раствор аммония сульфата, с = 3,2

Растворяют 422,84 г аммония сульфата в воде. Разбавляют водой до 1000  и перемешивают.

5.6 Буферный раствор, рН 10

Растворяют 7,92 г глицилглицина () и 1,47 г L-глутаминовой кислоты () в 80  воды. Устанавливают рН (10,00,1) при 20°С раствором I гидроксида натрия (см. 5.3.1) и при постоянном перемешивании доводят объем раствора водой до 100 .

Раствор хранят не более 3 мес при температуре от 0°С до 5°С.

5.7 Раствор никотинамид-аденин-динуклеотида (НАД)

Растворяют 350 мг никотинамид-аденин-динуклеотида () в 10  воды.

Полученный раствор хранят в течение 1 мес при температуре от 0°С до 5°С. Во время использования сосуд с раствором должен быть погружен в емкость с дробленым льдом.

5.8 L-лактатдегидрогеназа (L-ЛДГ), из суспензии мышцы свиньи

10 мг суспензии L-лактатдегидрогеназы растворяют в 1  раствора глицерина (5.4). рН полученной суспензии должен быть около 7. Если удельная активность L-ЛДГ менее 5500 ед./, проводят повторное приготовление раствора фермента согласно вышеприведенным указаниям.

Раствор L-ЛДГ стабилен в течение 12 мес при хранении при температуре от 0°С до 5°С.

Во время использования раствора L-ЛДГ согласно разделу 8 емкость с ферментом охлаждают и выдерживают в ледяной бане.

5.9 D-лактатдегидрогеназа (D-ЛДГ) (из культуральной жидкости Lactobacillus leichmannii)

5 мг суспензии D-ЛДГ растворяют в 1  раствора сульфата аммония (см. 5.5). рН полученной суспензии должен быть около 6. Удельная активность D-ЛДГ должна быть не менее 1500 ед./ при 25°С.

Если это не так, приготовляют другую суспензию D-ЛДГ.

Суспензия D-ЛДГ стабильна в течение 12 мес при хранении при температуре от 0°С до 5°С.

Во время использования раствора L-ЛДГ согласно разделу 8 емкость с ферментом охлаждают и выдерживают в ледяной бане.

5.10 Глутамат-пируват-трансаминаза (ГПТ), из свиного сердца

20 мг суспензии ГПТ растворяют в 1,0  раствора сульфата аммония (см.5.5). рН полученной суспензии должен быть около 7. Удельная активность суспензии глутамат-пируват-трансаминазы должна быть не менее 1600 ед./ при 25°С. Если это не так, приготовляют другую суспензию ГПТ.

Добавляют 1,0  раствора сульфата аммония (см. 5.5) к 1  суспензии с 20 мг ГПТ и перемешивают. Центрифугируют полученные 2,0  суспензии, содержащей 10 мг ГПТ/, при радиальном ускорении 4000 g в течение 10 мин. Переносят 1,0  прозрачной надосадочной жидкости, удаляют оставшиеся раствор и осадок.

Суспензия D-ЛДГ стабильна в течение 12 мес при хранении в холодильнике при температуре от 0°С до 5°С.

Во время использования раствора L-ЛДГ согласно разделу 8 емкость с ферментом охлаждают и выдерживают в ледяной бане.

5.11 Раствор L-лактата лития

50 мг L-лактата лития () растворяют в воде. Разбавляют водой до 500  и перемешивают.

5.12 Раствор D-лактата лития

50 мг D-лактата лития () растворяют в воде. Разбавляют водой до 500  и перемешивают.

6 Оборудование и вспомогательные материалы

Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, перечисленное ниже.

6.1 Аналитические весы, имеющие точность взвешивания 1 мг, с ценой деления 0,1 мг.

6.2 Стеклянный химический стакан вместимостью 50 .

6.3 Мерный цилиндр вместимостью 50 .

6.4 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 10 .

6.5 Пипетки вместимостью 0,02; 0,05; 0,2; 1,0 и 2,0 .

6.6 Градуированные пипетки вместимостью 5 и 10 , с делениями 0,1 .

6.7 Стеклянный фильтр диаметром около 7 см.

6.8 Фильтровальная бумага со средним размером пор, диаметром около 15 см, не содержащая молочной кислоты и лактатов.

6.9 Стеклянная палочка.

6.10 Пластиковые шпатели, пригодные для перемешивания смеси проба-фермент в спектрометрической кювете.

6.11 Спектрофотометр или фотометр с шириной спектральной полосы пропускания не более 10 нм, относительной погрешностью измерений 1% в интервале оптических плотностей от 0,000 до 2,000, пригодный для проведения измерений при 340 нм.

6.12 Кюветы для фотометрических измерений с длиной оптического пути (шириной грани) 1 см из кварцевого стекла или полимерных материалов (полистирола или полиметакрилата), пригодные для измерения оптической плотности при 340 нм.

6.13 Допускается использование других средств измерений с метрологическими характеристиками, материалов и лабораторного оборудования с техническими характеристиками, не уступающими перечисленным выше.

7 Отбор проб и приготовление

7.1 В лабораторию необходимо доставить представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или модифицирована при транспортировании или хранении.

Отбор проб не является частью метода, устанавливаемого в настоящем стандарте.

Отбор проб - по ГОСТ 26809 и для экспортно-импортных операций - по [1].

Пробу хранят в условиях, в которых не допускается ее повреждение или изменение состава.

Пробу для испытаний переносят в емкость, имеющую вместимость примерно вдвое большую, чем объем пробы, и снабженную герметичной крышкой. Емкость незамедлительно закрывают. Пробу тщательно перемешивают путем многократного встряхивания и переворачивания емкости.

В процессе приготовления следует избегать воздействия атмосферного воздуха на пробу для испытаний, чтобы минимизировать поглощение воды.

7.2 Навеска

Взвешивают 1,0 г пробы для испытаний с точностью 1 мг в стеклянном химическом стакане вместимостью 50 .

7.3 Контрольное определение

Контрольное определение проводят, как это указано в 7.4 и 8.2, используя все реактивы, но без порции пробы.

7.4 Приготовление раствора и депротеинизация

7.4.1 Навеску пробы (см. 7.2) при перемешивании стеклянной палочкой (см. 6.9) или другими под ходящими средствами растворяют в 20  воды, предварительно нагретой до температуры от 40°С до 50°С.

Содержимое химического стакана количественно переносят в мерную колбу с одной меткой на 100  (см. 6.4), ополаскивая стакан водой. Содержимое колбы охлаждают примерно до 20°С.

7.4.2 К раствору (см. 7.4.1) добавляют в следующей последовательности - 5,0  раствора калия гексацианоферрата (II) (см. 5.1), 5,0  раствора сульфата цинка (см. 5.2) и 10,0  раствора II гидроксида натрия (см. 5.3.2), интенсивно перемешивая после каждого добавления. Разбавляют водой до метки 100 . Тщательно перемешивают и дают смеси отстояться при комнатной температуре в течение 30 мин.

7.4.3 Фильтруют через фильтровальную бумагу (см. 6.8), первую порцию фильтрата удаляют.

Вместо фильтрации можно использовать центрифугирование.

8 Порядок проведения испытания

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ! Следует избегать загрязнения, особенно продуктами испарения тела.

8.1 Проверка качества реактивов

8.1.1 Проверку качества реактивов по нижеприведенной процедуре проводят:

- во всех случаях при приготовлении новой партии реактивов (включая 5.6 - 5.10);

- после хранения реактивов в холодильнике без использования в течение более двух недель;

- в случае повторного использования после истечения периода аналитической неактивности;

- в любых случаях, когда этого требуют иные условия применения и/или хранения реактивов.

8.1.2 Отбирают пипеткой 10  раствора L-лактата лития (см. 5.11) в каждую из двух мерных колб с одной меткой на 100  (см. 6.4). Отбирают пипеткой 10  раствора D-лактата лития (см. 5.12) в каждую из двух других мерных колб с одной меткой на 100  (см. 6.4).

Определяют содержание L-молочной кислоты и L-лактатов и D-молочной кислоты и D-лактатов в растворах в двух парах колб на 100 , как это указано в 7.4.2, 7.4.3 и 8.2.

8.1.3 Концентрацию лактатов лития ; , , рассчитывают по одной из следующих формул:

a) для раствора L-лактата:

;

(1)

b) для раствора D-лактата:

,

(2)

где А - значение оптической плотности при 340 нм, рассчитанное в соответствии с 8.2.1 и 8.2.2;

341 - значение фактора, учитывающего молекулярную массу L-лактата лития ( = 96,1) и конечный объем ( = 2,24 ) в 9.1 при расчете концентрации L-лактата;

346 - значение фактора, учитывающего молекулярную массу D-лактата лития (= 96,1) и конечный объем ( = 2,27 ) в 9.1 при расчете концентрации D-лактата.

8.1.4 Принимая во внимание чистоту L- и D-лактата лития, используемых для приготовления растворов, степень повторного нахождения (ПН) L- или D-лактата лития в любой из колб (см. 8.1.2) должна быть в диапазоне (1005)%. Если ПН не находится в данном диапазоне, осуществляют проверку реактивов, метода выполнения работы, точности пипеток и параметров спектрофотометра. Для проверки реактивов и оборудования могут быть использованы методы текущей проверки, применяемые в биохимическом анализе пищевых продуктов. Принимают требуемые меры для получения надлежащих результатов. Данную проверку качества реактивов повторяют, пока не будут получены удовлетворительные результаты.

Примечание - Степень повторного нахождения (ПН) - доля измеренного количества.

8.2 Определение

8.2.1 Необходимые количества компонентов инкубационной смеси вносят, используя соответствующую пипетку (см. 6.5), в кювету (см. 6.12) спектрофотометра (см. 6.11) в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1 - Аналитическая схема ферментативного определения L- и D-молочных кислот (L- и D-лактатов)

Реактивы, дозируемые в кювету,	Обозначение кювет
	Контрольная проба	Стандарт D-лактата лития	Стандарт L-лактата лития	Проба
Дистиллированная вода	1,000	-	-	-
Стандарт (см. 8.1.2) ГАРАНТ: По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Вместо "Стандарт (см. 8.1.2)" следует читать "Стандарт (см. 8.2.1)"	-	1,000	1,000	-
Проба (см. 7.4.3)	-	-	-	1,000
Буферный раствор, рН 10 (см. 5.6)	1,000	1,000	1,000	1,000
Раствор (см. 5.7)	0,200	0,200	0,200	0,200
ГПТ (см. 5.10)	0,020	0,020	0,020	0,020
L-ЛДГ (см. 5.8)	0,020	-	0,020	0,020
D-ЛДГ (см. 5.9)	0,050	0,050	-	0,050

ГАРАНТ:

По-видимому, в тексте предыдущего абзаца допущена опечатка. Номер названного ГОСТа следует читать как "см. 8.2.1"

Содержимое всех кювет перемешивают при помощи пластикового шпателя (см. 6.10) или закрывают кювету и переворачивают несколько раз. После перемешивания кюветы выдерживают 5 мин при комнатной температуре перед тем, как измерить оптическую плотность ( и ) инкубационной смеси во всех кюветах относительно воды при длине волны 340 нм.

Через 45 мин измеряют повторно оптическую плотность инкубационной смеси во всех кюветах ( и ) относительно воды при длине волны 340 нм.

Следующее измерение проводят через 60 мин. Измеряют оптическую плотность инкубационной смеси во всех кюветах ( и ) относительно воды при длине волны 340 нм.

L- или D-молочную кислоту и L-/D-лактаты можно определять отдельно путем добавления либо L-ЛДГ (см. 5.8), либо D-ЛДГ (см. 4.9).

В случае измерений только L-молочной кислоты и L-лактатов оптическую плотность измеряют через 30 и 45 мин после перемешивания соответственно.

8.2.2 Фактическое значение оптической плотности А, которое будет использовано в вычислениях по 9.1, рассчитывают по формуле

,

(3)

где - оптическая плотность пробы через 60 мин по 8.2.1;

- оптическая плотность пробы по 8.2.1;

- оптическая плотность пробы через 45 мин по 8.2.1;

- оптическая плотность контрольной пробы через 60 мин по 8.2.1;

- оптическая плотность контрольной пробы по 8.2.1;

- оптическая плотность контрольной пробы через 45 мин по 8.2.1.

Иногда может иметь место медленно текущая побочная реакция. Влияние на оптическую плотность, оказываемое данной побочной реакцией, может быть устранено путем экстраполяции к оптической плотности при нулевом времени.

В случае определения только L-молочной кислоты и L-лактатов (см. 8.2.1) оптическую плотность измеряют через 30 и 45 мин соответственно по формуле

,

(4)

где - оптическая плотность пробы через 30 мин по 8.2.1;

- оптическая плотность контрольной пробы через 30 мин по 8.2.1.

8.2.3 Если увеличение оптической плотности, рассчитанное согласно 8.2.2, превышает 0,500 единиц, определение повторяют согласно 8.2.1 - 8.2.3, используя пробу с подходящей степенью разбавления (см. 7.4.3).

9 Правила обработки результатов

9.1 Расчет

Суммарное содержание L- и D-молочной кислоты или L- и D-лактатов, , мг/100 г, рассчитывают по формуле

,

(5)

где А - оптическая плотность при 340 нм, рассчитанная в соответствии с 8.2.2;

- относительная молекулярная масса L- и D-молочной кислоты ( = 90,1);

k - коэффициент оптической плотности (экстинкции) НАДН при 340 нм, равный 6,3 х ;

l - длина оптического пути кюветы для фотометрических измерений (l = 1 см), см;

m - навеска пробы (см. 7.3), г;

- общий объем инкубационной смеси в кювете (см. 8.2.1),  ;

- при определении L- и D-молочной кислоты и L- и D-лактатов = 2,29 ,

- при определении только L-молочной кислоты и L-лактата = 2,24 ,

- при определении только D-молочной кислоты и D-лактата = 2,27 ;

- объем пробы, ;

- объем пробы (см. 7.4.3), взятый для разбавления (см. 8.2.3), если это необходимо, ;

- объем раствора, полученного по 7.4.2 (т.е. = 100 ), ;

- объем, до которого проба была разбавлена (см. 8.2.3), при необходимости, ;

- содержание сухих обезжиренных веществ в пробе, выраженное в виде массовой доли, %.

Примечание - Определение массовой доли жира не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод определения жира в сухом молоке - по [2].

9.2 Выражение результатов

Результаты испытаний выражают в целых числах.

10 Прецизионность

Прецизионность метода и результатов измерений рассчитывают по ГОСТ ИСО 5725-1 и ГОСТ ИСО 5725-2.

Значения, полученные в ходе межлабораторных испытаний, могут не применяться к диапазонам концентраций и матрицам, отличным от тех, которые приведены в настоящем стандарте.

10.1 Сходимость (повторяемость)

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать:

a) для среднеарифметического значения содержания L- или D-молочной кислоты и L- или D-лактатов 60 мг на 100 г сухих обезжиренных веществ: r = 10 мг/100 г;

b) для среднеарифметического значения содержания L- или D-молочной кислоты и L- или D-лактатов > 60 мг на 100 г сухих обезжиренных веществ: r = 15% (относительных) от среднеарифметического значения.

10.2 Воспроизводимость

Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами испытаний, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному испытуемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5% случаев превышать:

a) для среднеарифметического значения содержания L- или D-молочной кислоты и L- или D-лактатов 100 мг на 100 г сухих обезжиренных веществ: R = 15 мг/100 г;

b) для среднеарифметического значения содержания L- или D-молочной кислоты и L- или D-лактатов > 100 мг на 100 г сухих обезжиренных веществ: R = 20% (относительных) от среднеарифметического значения.

Библиография

[1]	ISO 707:2007	Молоко и молочные продукты. Руководство по отбору проб
[2]	ISO 1736:2008	Молоко сухое и сухие молочные продукты. Определение содержания жира. Гравиметрический метод (Контрольный метод)
[3]	Колеснов А.Ю. Биохимические системы в оценке качества продуктов питания. - М.: Пищевая промышленность, 2000, 416 с.