Приложение А (рекомендуемое). Правила надлежащей лабораторной практики (GLP) для выполнения ферментативного анализа пищевых продуктов

Приложение А
(рекомендуемое)

Правила
надлежащей лабораторной практики (GLP) для выполнения ферментативного анализа пищевых продуктов

А.1 Введение

Рекомендуемые правила GLP для выполнения ферментативного анализа менее известны, чем правила выполнения других химических анализов. Для получения результатов, имеющих удовлетворительные достоверность и точность, необходимо принять во внимание приведенные ниже правила GLP.

А.2 Реактивы

А.2.1 Следует использовать ферменты только установленного качества (удельной активности, специфичности действия, концентрации, отсутствие загрязнителей с ферментативной активностью, растворители).

А.2.2 Следует использовать коферменты только установленного качества (степени чистоты, кислотной или солевой формы, отсутствие загрязнителей).

А.2.3 Все реактивы, помимо ферментов и коферментов, должны быть аналитической степени чистоты.

А.2.4 Вода для приготовления растворов ферментов и других реактивов должна быть бидистиллированной, полученной в стеклянном оборудовании.

А.2.5 Вода для приготовления растворов пробы должна быть дистиллированной, полученной в стеклянном оборудовании, или деионизированной.

А.2.6 Реактивы и суспензии/растворы ферментов следует хранить в соответствии с инструкциями (обычно при температуре от 2°С до 8°С).

А.2.7 Не следует замораживать суспензии ферментов.

А.2.8 По истечении срока хранения качество реактивов проверяют путем исследования стандартных растворов с различным количеством анализируемого вещества. Изменения полученных значений оптической плотности должны быть пропорциональны изменениям концентраций анализируемых веществ.

А.2.9 Температура буферных растворов, взятых из холодильника, перед добавлением в анализируемую пробу должна быть доведена до комнатной.

А.3 Фотометрические и спектрофотометрические кюветы

А.3.1 Используют стеклянные или пластиковые кюветы с длиной оптического пути 1 см.

Примечание - Пластиковые кюветы имеют следующие преимущества по сравнению со стеклянными:

a) ниже стоимость (одноразовое применение);

b) возможно проведение большего числа анализов;

c) в рамках одной партии пластиковые кюветы удовлетворительно подходят с точки зрения измерений оптической плотности.

А.3.2 В тех случаях, когда используется новая партия кювет, необходимо проверить их длину оптического пути по сравнению с длиной прецизионных кювет (например, кварцевой кюветы) следующим образом.

Прецизионную кювету и пластиковые кюветы наполняют дистиллированной водой и измеряют оптическую плотность () воды в каждой кювете по сравнению с водой, находящейся в прецизионной кювете. После ополаскивания кюветы заполняют раствором НАДН (приблизительно 0,15 ) и повторно измеряют оптическую плотность () по сравнению с водой, находящейся в прецизионной кювете. Рассчитывают для прецизионной кюветы и пластиковых кювет. Если разница () между двумя видами кювет превышает 0,5% значения измерения фактической оптической плотности для прецизионной кюветы, рассчитывают средний процент разницы и учитывают его для длины оптического пути l в формуле (5).

А.3.3 Всегда используют кюветы чистые и без царапин. Просушивают или очищают оптические стороны кюветы, используя только мягкую ткань.

А.3.4 Не рекомендуется измерять оптическую плотность кювет с пробой для испытаний по сравнению с плотностью кюветы для контрольного определения, так как не будет получено никакой информации относительно оптической плотности самого контрольного определения. Оптическую плотность пробы и контрольного определения измеряют относительно воды и рассчитывают разницу.

А.3.5 Не следует измерять оптическую плотность пробы или контрольного определения относительно пустой кюветы (из-за диффузии света).

А.3.6 Перемешивают содержимое кюветы при помощи пластикового шпателя или плотно закрывают кювету и совершают легкие круговые движения.

А.З.7 Удаляют пузырьки воздуха со стенок кювет посредством пластикового шпателя. Следует избегать нанесения царапин на оптическую сторону кюветы.

А.3.8 Всегда используют один и тот же тип кювет для измерения оптической плотности пробы и контрольного определения.

А.3.9 Стеклянные или кварцевые кюветы всегда помещают в одинаковое положение в держателе кювет. Для этих целей помечают одну оптическую сторону кюветы. На грани пластиковых кювет, предназначенной для измерения оптической плотности, нанесена специальная метка.

А.4 Фотометры и спектрофотометры

А.4.1 Используют спектрофотометр (ширина спектральной полосы пропускания 10 нм) с монохроматором, фотометр, снабженный фильтрами (ширина спектральной полосы пропускания фильтров 10 нм), или спектральный фотометр, снабженный ртутной лампой. Измерения, проводимые с использованием спектрофотометра или фотометра, осуществляют при длине волны, соответствующей максимальной оптической плотности НАДН и НАДФН, т.е. при 340 нм. Измерения, проводимые с использованием спектрального фотометра с ртутной лампой, осуществляют при 365 или 334 нм.

Примечание - Коэффициенты оптической плотности (экстинкции) НАДН и НАДФН, измеренные при 334, 340 и 365 нм, являются следующими:

a) НАДН и НАДФН при 334 нм (Hg): 6,18 х ;

b) НАДН и НАДФН при 340 нм (Hg): 6,3 x ;

c) НАДФН при 365 нм (Hg): 3,5 х ;

d) НАДН при 365 нм (Hg): 3,4 х .

А.4.2 Технические характеристики спектрофотометра, фотометра или спектрального фотометра должны обеспечивать линейную зависимость между значениями оптической плотности (вплоть до 2,000 ед.) и концентрацией НАДН или НАДФН. Линейную зависимость проверяют следующим образом:

a) отбирают пипеткой 2,000 дистиллированной воды в кювету и измеряют оптическую плотность относительно воды;

b) отбирают пипеткой 0,100  раствора НАДН (0,5 ) в кювету, перемешивают содержимое кюветы и измеряют оптическую плотность .

Рассчитывают сниженную оптическую плотность по формуле

.

(А.1)

Повторяют процедуру проверки линейной зависимости 14 раз, как это описано выше.

После каждой пары измерений рассчитывают сниженную оптическую плотность по формуле

,

(А.2)

где - оптическая плотность при измерении n;

V - объем содержимого кюветы при измерении n, .

Для каждого измерения строят график значений объема раствора НАДН в кювете с соответствующими значениями сниженной оптической плотности. Значение корреляции измерений должно быть более 0,99. Для текущей поверки спектрофотометра, фотометра или спектрального фотометра может быть использована методика, опубликованная в [3].

А.5 Автоматические пипетки и другие дозирующие устройства

А.5.1 Используют автоматические пипетки и другие дозирующие устройства в соответствии с инструкциями производителя.

А.5.2 Используют надлежащие наконечники для каждой пипетки.

А.5.3 Необходимо периодически (например, ежемесячно) проверять технические параметры, касающиеся объема и повторяемости автоматических пипеток и других дозирующих устройств, как это указано ниже.

Взвешивают стеклянный химический стакан с дистиллированной водой при значении времени t. Отбирают пипеткой или дозирующим устройством один объем воды в стакан и точно взвешивают при (t+1) мин после первого взвешивания. Повторяют процедуру отбора объема воды пипеткой или дозирующим устройством девять раз. Взвешивают стакан без отбора объема воды пипеткой или дозирующим устройством в моменты (t+11), (t+12), (t+13), (t+14) и (t+15) мин. Рассчитывают из этих взвешиваний потери на испарение за минуту. Рассчитывают объем и повторяемость дозирования воды пипеткой или дозирующим устройством, принимая во внимание потерю воды при испарении.

А.5.4 Передача тепла от ладони руки во время продолжительного использования может повлиять на объем дозируемой пробы при использовании некоторых автоматических пипеток.

Необходимо проверить это явление путем процедуры, описанной в А.5.3, и избегать использования таких пипеток.

А.5.5 Непосредственно перед использованием следует ополоснуть наконечник пипетки несколько раз раствором/суспензией, которая будет использована для отбора и дозирования. Для каждого раствора пробы следует использовать новый наконечник.

А.5.6 Отбирают пипеткой растворы пробы, буфера, фермента и кофермента, опуская наконечник как можно ниже, в различные углы кюветы.

Малые количества растворов/суспензии фермента (10 - 50 мкл) можно отбирать и наносить пипеткой на поверхность пластикового шпателя, затем вносить в кювету и перемешивать с ее содержимым.

А.5.7 Следует избегать загрязнения.

А.6 Другая полезная информация

А.6.1 Следует проверить наличие возможных помех и суммарных погрешностей путем определения оптической плотности двух растворов с различными концентрациями анализируемого вещества. Полученные значения оптической плотности должны быть пропорциональны концентрации анализируемого вещества.

А.6.2 Следует использовать стандартные вещества как для проверки ферментативной реакции (реакций), так и для проверки качества работы лабораторного персонала. Этот стандарт необходимо рассматривать как рабочий.

Примечание - Стандартные вещества, имеющие сертифицированную чистоту, можно получить от организаций, таких как Национальный институт стандартов и технологии (NIST) или Бюро эталонов Европейского сообщества.

А.6.3 Следует проводить определение степени повторного нахождения стандартного вещества, используемого в качестве внутреннего стандарта в растворе пробы. Количество добавляемого в пробу стандартного вещества должно быть примерно таким же, что уже присутствует в растворе пробы. Степень повторного нахождения стандартного вещества, как правило, должна составлять (1005)%.

А.6.4 Используют один пластиковый шпатель на кювету или используют каждый шпатель только один раз.

Примечание - Количество жидкости, оставшееся на поверхности шпателя, можно рассматривать как несущественное.