Приложение В (обязательное). Методы культивирования тест-организмов

Приложение В
(обязательное)

Методы культивирования тест-организмов

В.1 Условия культивирования тест-организмов

В.1.1 Исходный материал для культивирования тест-организмов получают в лабораториях, занимающихся тестированием, имеющих культуру требуемой видовой принадлежности. Чувствительность культур к модельному токсиканту должна соответствовать установленному в настоящем стандарте диапазону за 48 ч (метод Б) или за 72 ч (метод А).

Тест-организмы культивируют и содержат в климатостате, в инкубаторе, на водяной бане или в помещении с регулируемой температурой (202)°С.

При этом обеспечивают естественное или искусственное освещение так, чтобы соблюдались следующие периоды выдержки: 16 ч - воздействие света при освещенности 500 - 1000 БК, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Nitocra spinipes Boeck и Tisbe battagliai Volkmann-Rocco необходимо защищать от воздействия прямого света. Acartia tonsa Dana может чувствовать себя лучше при освещенности среды с культурой тест-организмов до 2200 лк.

Тест-организмы и морская вода, в которой происходит их культивирование, должны содержаться в емкостях только из стекла или полимерного материала, изготовленного без использования пластификатора.

Примечания

1 Морские копеподы Acartia tonsa Dana, Tisbe battagliai Volkmann-Rocco и Nitocra spinipes Boeck имеют широкое географическое распространение, обладают коротким жизненным циклом и требуют минимум пространства и оборудования для культивирования и проведения тестирования. Организмы могут культивироваться постоянно в лабораторных условиях.

2 Развитие копепод (веслоногих раков) проходит через шесть науплиальных стадий и пять стадий копеподитов, после чего наступает взрослая стадия. При температуре 20°С развитие только что вылупившихся науплиев до взрослой стадии проходит за 10 - 14 сут. Науплии выпускаются непосредственно из яйцевого мешка женской особью Tisbe battagliai Volkmann-Rocco и Nitocra spinipes Boeck в течение 3 - 4 сут, Acartia tonsa Dana выпускает яйца в течение 2 - 3 сут.

3 Приведенная в данном приложении информация предназначена для использования только в качестве общего руководства.

В.1.2 Вода для культивирования тест-организмов - по 4.2 и 5.2 (далее - морская вода) в зависимости от метода тестирования; при необходимости корректируют минерализацию (соленость) воды в соответствии с условиями тестирования.

В.1.3 Емкости, применяемые для культивирования тест-организмов, должны быть оснащены свободными или перфорированными крышками, чтобы уменьшить испарение, но обеспечить газообмен. Потеря морской воды из-за испарения должна возмещаться путем добавления дистиллированной или деионизированной воды.

В.1.4 Емкости тщательно моют при каждой замене морской воды.

В.1.5 В качестве корма используют культуру морских одноклеточных водорослей (десятисуточную).

В.2 Условия подготовки к тестированию Artemia salina L.

В.2.1 Оборудование и процедура получения науплиев

Для тестирования используют науплиев Artemia salina L в возрасте одних суток (синхронизированная культура), которые получают в лаборатории из яиц.

Яйца хранят в холодильнике.

Каждую новую партию яиц проверяют на выклев. Используют яйца при выклеве не ниже 80%, что определяет в дальнейшем физиологическую чувствительность тест-организмов односуточных науплиев Artemia salina L.

Тест-организмы для тестирования получают следующим способом:

- в стакан вместимостью 500  помещают 0,1 г сухих яиц Artemia salina L., заливают водопроводной питьевой водой и выдерживают 30 мин.

Примечание - Водопроводную питьевую воду предварительно отстаивают и аэрируют в течение одних суток;

- через 30 мин, не взбалтывая содержимого стакана, сливают слой воды над яйцами, которые осели на дно стакана, удаляя таким образом всплывшие погибшие яйца и пустые оболочки. Процедуру повторяют не менее трех раз (заполняют стакан водой и сливают воду);

- отмытые яйца от пустых оболочек заливают морской водой (см. В.1.2) необходимой минерализации (солености), значением рН 8,0 - 8,3 и содержанием кислорода не менее 7  и при слабой аэрации выдерживают до выклева.

Выклев науплиев из яиц происходит через:

- 48 ч при температуре 20°С;

- 24 ч при температуре 25°С.

8.2.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции тест-организмов при подготовке науплиев к тестированию.

Первых выклюнувшихся науплиев тщательно отбирают из стакана пипеткой Пастера, концентрируя их возле одной из стенок направленным источником света (новорожденные науплии имеют положительный фототаксис).

В течение одного часа в стакане накапливаются новые науплии, их также переносят пипеткой в отдельный сосуд с морской водой и используют для тестирования.

Предварительную адаптацию науплиев Artemia salina L. к воде нужной минерализации (солености) не проводят, так как рачок эвригалинный и может переносить минерализацию (соленость) в широком диапазоне.

Вода для замачивания яиц Artemia salina L. должна быть той же минерализации (солености), что и анализируемая проба.

B.2.3 Кормление

Науплии Artemia salina L. в течение 3 - 4 сут после выклева из яиц не нуждаются в кормлении в связи с эндогенным питанием, поэтому при тестировании их не кормят.

В.3 Условия культивирования Acartia tonsa Dana

В.3.1 Оборудование и процедура культивирования

Базовые культуры Acartia tonsa Dana культивируют в емкости с объемом морской воды (см. 5.2), равным 10 - 12 . Аэрацию обеспечивают централизованно через отверстие возле дна емкости диаметром около 1,5 мм, со скоростью приблизительно один пузырек воздуха в секунду. Это обеспечивает мягкую циркуляцию морской воды, помогая поддерживать водоросли, являющиеся пищей, во взвешенном состоянии; при этом удобно использовать сферические емкости или емкости с плоским дном. Использование нескольких емкостей позволяет разделять культуры по возрастам.

Морскую воду обновляют, по меньшей мере, один раз в неделю. Использованную морскую воду пропускают через несколько нейлоновых сит с ячейками различного размера, в зависимости оттого, организмы какого возраста необходимо сохранить или отделить, в порядке, приведенном в таблице В.1.

Таблица В.1

Размер ячейки сита, мкм	Характеристика стадии удерживаемого организма
60	Удерживает все стадии
100	Удерживает все стадии, кроме яиц и науплиев в возрасте 2 сут
140	Удерживает копеподитов и взрослых особей
180	Удерживает только взрослых особей

Тест-организмы, которые необходимо сохранить для возобновления данной культуры, переносят из сита в свежую морскую воду (см. В.1.2). Невылупившиеся яйца собираются на дне емкости и их удаляют путем откачивания морской воды со дна емкости. Однако их трудно отделить от молодых науплиев, которые могут там находиться, так как на дне емкости собирается также осадок, включая остатки пищи, который систематически удаляют.

Обычно новые культуры возобновляют, используя молодь или взрослых особей, отделяя их во время еженедельной замены морской воды, с применением сит размером ячеек 180 и 60 мкм. Допускается проводить отделение молоди с меньшими интервалами времени, что позволяет получить более близкие возрастные группы, в том случае если, например, особей выращивают для использования при тестировании. Другим способом отделения взрослых особей от молоди является перенос взрослых особей в специальную клетку, которая позволяет яйцам падать сквозь ячейки сита в контейнер с водой.

В.3.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции, которая была начата особями в возрасте менее семи суток, до конца первой недели, когда плотность популяции обычно не превышает 25 - 50 особей на 1 . Когда копеподы достигают взрослой стадии, плотность, при необходимости, должна быть снижена до 25 особей на 1 . Рекомендуется избавляться от взрослых особей в возрасте 5 - 6 недель.

В.3.3 Кормление

Тест-организмы Acartla tonsa Dana питаются двумя видами одноклеточных водорослей, выращиваемых в лабораторных условиях, Isochrysis galbana и Rhodomonas reticulata. Эти водоросли выращивают с использованием асептической технологии, чтобы исключить заражение культуры бактериями, водорослями и простейшими организмами. Для выращивания водорослей Isochrysis galbana и Rhodomonas reticulata используют следующие питательные растворы:

а) Раствор А, состав которого приведен в таблице В.2. Раствор А хранят в холодильнике при температуре около 4°С не более года.

Таблица В.2

Состав раствора	Количество компонента
Азотнокислый натрий по ГОСТ 4168 ()	100,00 г
Натрий фосфорнокислый однозамещенный одноводный ()	20,00 г
Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147 ()	1,30 г
Марганец (II) хлористый 4-водный по ГОСТ 612 ()	0,36 г
Борная кислота по ГОСТ 9656 ()	33,60 г
Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652	45,00 г
Раствор В (см таблицу В.4)	1,00
Дистиллированная вода по ГОСТ 6709	1

b) Раствор В, состав которого приведен в таблице В.3. Раствор В хранят в холодильнике при температуре около 4°С не более года.

Таблица В.3

Состав раствора	Количество компонента
Витамин	0,02 г
Витамин (тиамин)	0,40 г
Дистиллированная вода по ГОСТ 6709	1

с) Раствор С, состав которого приведен в таблице В.4, используют для приготовления раствора А. Раствор С хранят в холодильнике при температуре около 4°С не более года.

Таблица В.4

Состав раствора	Количество компонента
Цинк хлористый по ГОСТ 4529 ()	2,1 г
Кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525 ()	2,00 г
Аммоний молибденовокислый 4-водный )	0,90 г
Медь (II) сернокислая 5-водная ()	2,00 г
Дистиллированная вода по ГОСТ 6709	100
Примечание -В приготовленный раствор добавляют соляную кислоту молярной концентрации 0,1 до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.

Питательную среду для выращивания водорослей готовят следующим способом:

Морскую воду фильтруют через сито с ячейкой размером 1,0 мкм и обрабатывают в автоклаве в течение 15 мин при температуре 120°С.

В колбу, содержащую 1 отфильтрованной и обработанной в автоклаве морской воды, добавляют 1,0  раствора А и 0,05  раствора В. Питательные вещества (растворы А и В) добавляют в морскую воду через стерилизующий фильтр.

Культивирование водорослей проводят в стеклянных колбах вместимостью 3 при температуре (202)°С с аэрацией среды. Естественное освещение имитируют, используя лампы дневного света, обеспечивающие освещенность от 3000 до 10000 лк, при соблюдении следующего режима: 16 ч - воздействие света, 8 ч - без воздействия света (в темноте).

Культивирование водорослей проводят следующим способом:

В колбу с питательной средой добавляют 15  суспензии водорослей из маточной культуры и выращивают водоросли в течение десяти суток. Через 10 сут, когда плотность клеток обычно достигает максимума ( клеток/ - для Isochrysis galbana и клеток/ - для Rhodomonas reticulata), культуры водорослей сгущают (концентрируют) с помощью центрифуги и размешивают до состояния суспензии, разбавляя морской водой. Таким способом получают суспензию водорослей, предназначенную для корма тест-организмов, плотность которой достигает примерно клеток/ для Isochrysis galbana и клеток/ для Rhodomonas reticulata. Суспензии водорослей хранят в холодильнике при температуре от 0°С до 4°С в течение 7 сут

В емкости для культивирования тест-организмов вносят корм: по 0,25  суспензии каждого вида водорослей на 1 морской воды, что обеспечивает плотность клеток клеток/( клеток для Isochrysis galbana и клеток/ для Rhodomonas reticulata). Тест-организмы кормят каждый день в одинаковом объеме при условии, что пища, заданная в предыдущий день, съедена полностью.

Существует альтернативный режим, когда корм из смешанных водорослей применяют только на науплиальных стадиях, на более поздних стадиях тест-организмы кормят только водорослями Rhodomonas reticulata.

В.4 Условия культивирования Tisbe battagliai Volkmann-Rocco

В.4.1 Оборудование и процедура культивирования

Tisbe battagliai Volkmann-Rocco культивируют в емкостях, содержащих от 2 до 5 морской воды (см. 5.2), без аэрации. Используют, как минимум, четыре емкости, чтобы можно было разделить тест-организмы по возрасту и обеспечить постоянное возобновление тест-организмов для тестирования.

Морскую воду, в которой выращивают тест-организмы, обновляют один раз в неделю: использованную морскую воду с тест-организмами пропускают через несколько нейлоновых сит с ячейками различного размера в зависимости от того, какого возраста тест-организмы должны быть отделены, в порядке, приведенном в таблице В.5.

Таблица В.5

Размер ячейки сита, мкм	Характеристика стадии удерживаемого организма
60	Удерживает все стадии
100	Удерживает все стадии, кроме науплиев в возрасте 0 - 2 сут
140	Удерживает копеподитов старше 5 сут и взрослых особей
180	Удерживает поздних копеподитов и взрослых особей
250	Удерживает большую часть взрослых особей

Тест-организмы, которые необходимо сохранить для возобновления данной культуры, переносят из сита в свежую морскую воду (см. В.1.2). Следует отметить, что копеподиты и взрослые особи прилипают к стенкам емкости, но их можно смыть на сито с помощью струи морской воды из пипетки или бутыли.

Для обычных целей новые культуры возобновляют путем отделения молоди от взрослых особей во время еженедельной замены морской воды с использованием сит с ячейками размером 180 и 60 мкм. Последующие отделения особей по стадиям жизненного цикла с более короткими интервалами используют для отделения тест-организмов с меньшей разницей в возрасте, если, например, эти тест-организмы выращивают для дальнейшего использования при тестировании.

В.4.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции, которая была начата особями в возрасте менее семи суток, до конца первой недели, когда плотность популяции обычно не превышает 100 особей на 1 . Рекомендуется избавляться от взрослых особей в возрасте 4 - 5 недель.

В.4.3 Кормление

Tisbe battagliai Volkmann-Rocco питаются морскими водорослями. Успешно зарекомендовала себя одна из водорослей, Isochrysis galbana, хотя смесь этой водоросли с Rhodomonas reticulata лучше усваивается тест-организмами. Культивирование водорослей и подготовка культур - в соответствии с требованиями В.3.3.

Если для корма используют только водоросли Isochrysis galbana, то на 1 свежей морской воды вносят 5  суспензии водорослей (плотность клеток/) (см. В. 1.2), чтобы обеспечить плотность водорослей, равную клеток/. Если используют оба вида водорослей, то на 1 воды вносят 3  суспензии водоросли Isochrysis galbana и 2  Rhodomonas reticulata (плотность клеток/) (что обеспечивает плотность клеток/ водоросли Isochrysis galbana и клеток/ водоросли Rhodomonas reticulata).

Обычно тест-организмы при культивировании кормят ежедневно. При содержании взрослых тест-организмов с более высокой плотностью популяции требуется соответственно и дополнительное питание в таком же объеме (указанном выше) один или два раза в неделю, но при условии, что предыдущая порция пищи съедена. Тест-организмы, состоящие из науплиев в возрасте одной недели и копеподитов ранних стадий, обычно не требуют дополнительного питания.

В.5 Условия культивирования Nitocra spinipes Boeck

В.5.1 Оборудование и процедура культивирования

Nitocra spinipes Boeck культивируют в емкостях, например в кристаллизаторах вместимостью 150 , содержащих по 100  морской воды (см. 5.2), без аэрации. Для обеспечения отделения культур по возрастам и обеспечения постоянного возобновления тест-организмов для тестирования требуется примерно 15 таких емкостей.

Каждую неделю необходимо обновлять культуру тест-организмов путем переноса 10 - 15 женских особей с видимыми яйцевыми мешками в кристаллизаторы, содержащие по 100  свежей морской воды. Для обновленных культур необходимо заменять 50% морской воды через две недели. После этого заменяют 50% морской воды не реже одного раза в неделю.

Для тестирования необходимо отбирать взрослых копепод без яичных мешков в возрасте 3 - 4 недели.

В.5.2 Регулирование плотности популяции

Как правило, нет необходимости регулировать плотность популяции тест-организмов при культивировании указанной культуры.

Рекомендуется избавляться от взрослых особей в возрасте 4 - 6 недель.

В.5.3 Кормление

Tisbe battagliai Volkmann-Rocco питаются молотым кормом для лосося, который приобретают в готовом виде. Шарики корма для молодых лососей диаметром около 1 мм высушивают при 50°С в течение 24 ч. После остывания шарики корма измельчают в ступке, затем помещают в пробирки с завинчивающимися крышками. Пробирки с кормом стерилизуют при 120°С в течение 24 ч. Хранят подготовленный корм также, как корм для лосося, в морозильнике.

Для кормления тест-организмов возобновленной культуры в емкости с водой для культивирования объемом 100  вносят около 20 г корма одновременно с 1  донных отложений из воды старой культуры. После этого кормление продолжают, внося по 10 г корма три раза в неделю. Следует добавлять не слишком много корма, поскольку может произойти уменьшение содержания кислорода, что может вызвать ухудшение условий выращивания тест-организмов.