Приложение В (рекомендуемое). Количественный метод отбора проб

Приложение В
(рекомендуемое)

Количественный метод отбора проб

В.1 Отбор проб с использованием щелевого пробоотборника

В.1.1 Принцип отбора проб

Механизм захвата микроорганизмов с использованием щелевого пробоотборника (импактора для анализа воздуха) характеризуется простотой и надежностью. Воздух из установки сжатого воздуха проходит через специально сконструированный переходник и ускоряется при поступлении через узкую щель к влажной поверхности агаровой питательной среды (рисунок 1). Согласно закону инерции микроорганизмы (как более тяжелые) оседают на поверхность среды, а молекулы воздуха отклоняются от нее. При соответствующих условиях инкубации микроорганизмы вырастают в колонии, которые подсчитываются в предположении, что один микроорганизм вырастает в одну колонию.

Щелевой пробоотборник используется для бактерий, дрожжей или грибов; для вирусов и бактериофагов применяются специальные методы отбора проб. Поскольку оседание частиц происходит на большую поверхность агаровой питательной среды в чашке Петри диаметром 140 мм и пробоотборник расположен радиально относительно вращающейся чашки, то может быть подсчитано большее число микроорганизмов.

В.1.2 Методы работы в асептических условиях

Метод отбора проб предусматривает работу в асептических условиях. В качестве дезинфицирующего средства рекомендуется использование 70%-ного этилового спирта. Во время простоя пробоотборника следует принимать меры, ограничивающие рост микроорганизмов. Все операции, связанные с открытием щели, должны проводиться в минимальные сроки, чтобы избежать возможности попадания загрязнений из непосредственного окружения. Должны приниматься меры, исключающие сквозняки.

В.2 Методика отбора проб

Для отбора проб следует применять следующую методику:

a) оборудование, используемое для отбора проб, в т.ч. трубки и шланги, непосредственно перед использованием стерилизуется дезинфицирующим средством;

b) испытуемая проба воздуха пропускается через пробоотборник и соединенные с ним трубки и шланги (без чашки Петри с агаровой питательной средой). Это необходимо для испарения дезинфицирующего средства и настройки щелевого пробоотборника;

c) путем выполнения процедур по перечислениям d) - f) (при выключенном пробоотборнике) до и после контроля проводится "слепое испытание". Используемые при этом чашки Петри диаметром 140 мм, наполненные агаровой питательной средой, не должны показывать роста микроорганизмов;

d) на дне чашки Петри снаружи закрепляется этикетка с информацией о дате и начале испытания, адресе места проведения испытания, коде и т.д. Отмечается начальная позиция и направление вращения;

e) проверяется, что индикатор уровня и крышка в щелевом пробоотборнике для входа воздуха открыты. При открытой крышке проверяется правильность расположения держателя пластины и микропереключателя. Внутренние поверхности пробоотборника протираются дезинфицирующим средством;

f) чашка Петри вставляется в щелевой пробоотборник таким образом, чтобы ее радиус располагался вертикально под щелью для поступления воздуха. Крышка чашки Петри снимается и помещается в стерильный пластиковый пакет;

g) после снятия крышки чашки Петри крышка щелевого пробоотборника возвращается в исходное положение;

h) освобождается индикатор уровня и осторожно опускается к поверхности агаровой питательной среды. Крышка щелевого пробоотборника для входа воздуха опускается так, чтобы индикаторная стрелка указывала на нижний край направляющего желоба. Индикатор уровня пробоотборника возвращается в верхнюю позицию и закрепляется;

i) после нажатия клавиши "старт" начинается автоматический отбор пробы. Отмечается время начала и продолжительность отбора пробы, наименование и размещение испытательного оборудования и другие условия или явления, которые могут повлиять на результаты контроля;

j) отбор пробы завершается при выключении индикаторной лампы. При выключенной клавише "старт/стоп" поднимается крышка для входа воздуха;

k) крышка щелевого пробоотборника освобождается и осторожно сдвигается с одновременным извлечением крышки чашки Петри из стерильного пластикового пакета для последующего закрытия чашки Петри. Такие действия проводятся осторожно, чтобы не повредить агаровую питательную среду с пробой сжатого воздуха;

I) чашка Петри извлекается из пробоотборника, закрывается крышкой, заклеивается лентой и помещается в стерильный пакет, который также заклеивается;

m) чашки Петри инкубируются при комнатной температуре и через соответствующий период времени осматриваются (В.3). В центре и на внешнем крае поверхности агаровой питательной среды колониеобразующие единицы должны отсутствовать.

Примечание - Линия "старт/финиш" может содержать "дополнительные" колонии;

n) ручка активации держателя чашки передвигается и микропереключатель переводится в другую стартовую позицию;

о) внутренние поверхности щелевого пробоотборника протираются дезинфицирующим средством и закрываются крышкой;

р) для следующего отбора пробы приведенные действия повторяются.

Следует контролировать условия транспортирования чашек Петри от производителя, наполнившего их агаровой питательной средой, до места отбора пробы в лаборатории на предмет возможного загрязнения чашек при транспортировании. Чашки Петри после транспортирования не должны показывать роста микроорганизмов.

В.3 Инкубация загрязняющих жизнеспособных микроорганизмов

Наиболее подходящей температурой инкубации микроорганизмов в общем случае является температура окружающей среды, в которой они находились до отбора проб. Мезофильные бактерии или грибы культивируются при температуре от 20°С до 30°С. Для некоторых термочувствительных бактерий могут потребоваться другие температуры инкубации. Период инкубации обычно составляет для грибов 14 сут, для мезофильных бактерий - от 2 до 14 сут. Возможны и другие температуры инкубации микроорганизмов.

Для выделения отдельных видов бактерий (например граммотрицательных энтеробактерий) могут использоваться селективные среды (агаровые питательные). Число колониеобразующих единиц подсчитывается через заданный период времени (например 24 ч).

В.4 Подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ)

Неселективные среды анализируются на наличие роста колониеобразующих единиц, начиная с 24 ч после начала инкубации, с повторным подсчетом колоний каждые 24 ч в течение 14 сут. Для предотвращения неопределенности измерений при инкубации следует проводить регулярные наблюдения и подсчет колоний по мере их выявления и с учетом возможности перерастания.