Приложение 5. Генотипирование вируса денге

Приложение 5

Генотипирование вируса денге

Обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и амплификации, секвенирование продуктов амплификации осуществляют в соответствии с нормативными правовыми актами и методическими документами, регламентирующими требования к безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности) при использовании молекулярно-генетических методов исследования.

Выделение РНК вируса денге осуществляется из 100 мкл исследуемого образца. Обратная транскрипция проводится со статистической смесью гексануклеотидов (статзатравкой) в течение 1 часа при температуре 37°С. В случае использования коммерческих наборов реагентов для проведения реакции обратной транскрипции руководствуются инструкцией производителя.

Амплификацию фрагментов для секвенирования проводят с праймерами (таблица), специфичными для консервативного участка нетранслируемого региона 5'-UTR и гена capsid protein С.

Последовательности праймеров

Вирус денге	Праймеры	Структура олигонуклеотидной последовательности	Температура отжига,°С	Размер ампликона
Субтип 1-4	F1	AGTTGTTAGTCTRYGTGGACCG	51
Субтип 1	R398	AGCATRAGRAGCATGGTCAC	51	417
Субтип 2	R458	GATCATGTGTGGTTCTCCRTT	51	478
Субтип 3	R459	AATCATGCGCGGCTCTC	51	475
Субтип 4	R345	CCTATCTCCTTCCTGAATCCA	51	365

После обеззараживания исследуемого материала, выделения РНК и реакции обратной транскрипции проводят ПЦР в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):

кДНК	5 мкл
10xTaq буфер без	3 мкл
100 mM раствор	1 мкл
5 mM раствор dNTP	1 мкл
Смесь праймеров	5 мкл
(концентрация каждого 10 , конечная концентрация 0,3 )
SmartTaq ДНК-полимераза	0,3 мкл
Вода для ПЦР	до конечного объема 30 мкл

ПЦР проводят, используя программу амплификации, представленную в таблице:

Температурные и временные режимы при проведении ПЦР

Температура,°С	Время (минуты секунды)	Количество циклов
95	05:00	1
95	00:15	40
50	00:20
72	00:40
72	02:00	1
4	хранение

ПЦР-продукты разделяют в 2%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Фрагменты необходимой длины вырезают и выделяют из агарозного геля, используя наборы для выделения двухцепочечных молекул ДНК из продуктов ПЦР и агарозных гелей методом фильтрации на мембране.

Секвенирование ПЦР-продуктов проводят с помощью наборов реагентов в соответствии с протоколами производителей, используя прямые и обратные праймеры. Последующий анализ продуктов реакции проводят в автоматическом секвенаторе, использующем капиллярный электрофорез.

Анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей проводят сравнением с известными нуклеотидными последовательностями генотипов вируса денге, депонированными в международной базе данных NCBI/BLAST (http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).