Приложение 1 (рекомендуемое). Тест-вирусы и методы их культивирования

Приложение 1
(рекомендуемое)

Тест-вирусы и методы их культивирования

1. Тест-вирусы

Тест-вирусы получают из национальных или международных коллекций вирусов:

1.1. Вирус полиомиелита I типа (вакцинный штамм Sabin (LSc-2ab), РНК-содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства пикорнавирусов.

1.2. Аденовирус, тип V, штамм Аденоид 75 (АТСС VR-5),

ДНК-содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства аденовирусов.

1.3. Бычий парвовирус, штамм Хаден (АТСС VR-767).

1.4. Вирус гепатита А, штамм HAS-15, РНК-содержащий вирус, не имеющий оболочки, из семейства пикорнавирусов.

1.5. Вирус гепатита В уток (ВГВУ), штамм "УФА-04",

ДНК-содержащий, из семейства гепаднавирусов.

1.6. Вирус гепатита С человека, штамм Д1.

1.7. Вирус бычьей диареи (ВД-БС), РНК-содержащий вирус диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, из семейства пестивирусов, штамм ВК-1В1-N 28.

2. Культивирование вирусов

2.1. Исходный вирус - это вирус, полученный из Референс-центров (из национальных или международных коллекций вирусов), размноженный в объемах, достаточных для длительной работы с данным пассажем, при минимальных количествах пассажей. Хранится в малых объемах при -70°С или в жидком азоте (Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита, ВОЗ, Женева, М., 1998).

2.2. Тест-вирусная суспензия - вирусная суспензия, полученная из исходного вируса и используемая для определения вирулицидных свойств дезинфектанта.

2.3. Исходный вирус размножают в чувствительных клетках (лабораторных животных, утках и др.), продуцирующих вирус в высоких титрах. Клеточный детрит удаляют цетрифугированием при низких оборотах (1 000 об/5 мин). Этот материал называют "тест-вирусной суспензией". Ее используют не разведенной.

Предполагается, что минимальный титр вирусной суспензии по крайней мере . В любом случае он должен быть достаточно высоким, чтобы можно было получить снижение титра на 4,0 .

Полиовирус размножают в перевиваемой культуре клеток RD и HEp-2 или в других чувствительных клеточных культурах (4647, Vero и т.д.). Для получения ВС культуру клеток, инфицированную вирусом полиомиелита на стадии 100% поражения монослоя, вызванного цитопатическим действием вируса, трехкратно замораживают и оттаивают. После удаления разрушенных клеток центрифугированием, полученную суспензию используют в экспериментах.

Аденовирус размножают в перевиваемой клеточной культуре HEp-2, 4647 и в других чувствительных клеточных культурах. Методика получения ВС аналогична вышеописанной, за исключением того, что перед процедурой разрушения клеток методом замораживания-оттаивания, проводят замену культуральной среды на не содержащую сыворотки и добавляют ее в меньшем объеме.

Вирус гепатита А размножают в перевиваемой культуре клеток 4647. Для получения ВС флаконы инкубируют при 37°С в течение 21-28 дней с еженедельной сменой среды. По окончании инкубации из флаконов удаляют среду поддержания, монослой промывают раствором Хенкса, добавляют подогретый до 37°С раствор Версена, монослой обмывают диспергентом, раствор Версена сливают и добавляют 0,1М фосфатно-солевой буфер, рН 7,6.

Зараженные клетки ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, суспензию клеток пятикратно замораживают (-70°С) и оттаивают при комнатной температуре. Полученный клеточный лизат, содержащий 6,5-7,0 ВГА гомогенизируют и осветляют центрифугированием (3 000 об/5 мин), затем используют в качестве тест-вируса.

Супернатант аттестовывают на содержание антигена вирусного гепатита А методом ИФА. Оптическая плотность испытуемых образцов, обработанных ДС, должна соответствовать контрольных образцов, не содержащих ВГА.

Методика определения инфекционного титра основана на выявлении антигена ВГА при титровании методом конечного разведения. Готовят 10-кратные разведения анализируемого материала на среде Игла МЕМ х 2. Каждым разведением вируса, начиная с , заражают не менее 4 одинаковых емкостей с плотным монослоем культуры клеток 4647. После инкубации в течение 21-28 дней супернатант аттестуют на содержание вирусного антигена методом ИФА. Инфекционные титры вычисляют по методу Рида и Менча или по методу Спермана-Кербера (прилож. 3).

Вирус гепатита В уток. Метод моделирования инфекции ВГВУ in vivo. Источником вируса при моделировании инфекции является сыворотка крови домашней утки, инфицированной ВГВУ in vivo при экспериментальном заражении вирусом с известными инфекционными свойствами. Для тест-вируса ВГВУ, используемого в каждом опыте по оценке ДС, должен быть определен инфекционный титр.

Важным моментом при подготовке опыта по испытанию ДС с помощью моделирования ВГВУ-инфекции домашних уток является определение численности опытных групп. По причине довольно широкой распространенности естественной ВГВУ-инфекции и отсутствия скрининга на ВГВУ в хозяйствах - поставщиках эмбрионов и утят на территории Российской Федерации перед закладкой опыта необходимо предварительное тестирование на ДНК ВГВУ для отвода от участия в опыте уток с естественной инфекцией. Ввиду максимальной восприимчивости к инфицированию ВГВУ утят в возрасте 1-3 дней целесообразно работать с утятами именно этого возраста, однако предварительный скрининг может привести к задержке эксперимента и, как следствие, к снижению числа восприимчивых к инфицированию особей. Поэтому рекомендуется увеличение опытных групп до 10-15 голов каждая с учетом потенциального числа утят с естественной ВГВУ-инфекцией, взятие крови у всех утят непосредственно перед введением опытного материала, определение ДНК ВГВУ в течение ближайшего времени и выведение из опыта утят с выявленной естественной ВГВУ-инфекцией.

После определения числа опытных групп проводят непосредственно обработку вируса ДС. Обработка ДС должна проводиться непосредственно перед введением материала уткам, при необходимости обработанный ДС вирусный препарат может храниться не более суток при 4°С без снижения потенциальных инфекционных свойств.

Обработка вируса ДС проводится по стандартной методике с использованием суспензионного метода или метода батистовых тест-объектов.

Затем проводят нейтрализацию ДС по стандартной методике. Трехдневных утят размещают по 10 голов в изолированных клетках по числу групп эксперимента. Затем у всех утят берут кровь и используют для последующего ПЦР-анализа. После взятия крови уткам внутрибрюшинно вводят материал, полученный в результате обработки ВГВУ ДС. Показано, что внутрибрюшинное инфицирование ВГВУ так же эффективно, как и внутривенное, но при этом менее травматично для животных. Каждой утке вводят 200 мкл материала, в каждой опытной группе используют соответствующий материал, обработанный выбранной концентрацией ДС. В позитивной и негативной группах таким же образом вводят соответствующий контрольный материал.

После получения данных по выявлению естественной ВГВУ-инфекции среди задействованных в эксперименте уток, позитивных по ВГВУ особей удаляют. У всех участвующих в эксперименте уток проводят взятие крови через 3 недели после инфицирования. Взятие крови и отделение сыворотки крови проводят таким же образом, как и при предварительном тестировании на естественную ВГВУ-инфекцию. В отобранных образцах проводят определение ВГВУ-инфекции в ПЦР. Оценка результатов эксперимента проводится по системе "да/нет", т.е. появление даже одного случая ВГВУ-инфекции в опытной группе рассматривается как инфицирование ВГВУ и, как следствие, указывает на недостаточные вирулицидные свойства анализируемой концентрации ДС.

Вирус диареи крупного рогатого скота размножают в клетках КСТ - перевиваемой культуре клеток коронарных сосудов сердца плода коровы. Вирус имеется в музее ГУ "Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко".

Вирус гепатита С человека размножают в культуре клеток по методике, разработанной в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.