Приложение 2 (справочное). Метод батистовых тест-объектов

Приложение 2
(справочное)

Метод батистовых тест-объектов

1. Подготовка эксперимента. Вирусной суспензией контаминируют батистовые тест-объекты (далее "тесты").

В качестве тестов используют кусочки батиста размером 1x0,5 см, предварительно простиранного (т.е. освобожденного от крахмала) и проглаженного. Тесты помещают в стерильную чашку Петри и заливают ВС из расчета 0,05-0,1 мл жидкости на один тест (без сыворотки или с добавлением 40% СКРС). Тесты подсушивают при комнатной температуре не менее 60 мин. Контаминированные ВС тесты используют в опытах. Тесты не следует заготавливать впрок, их контаминируют ВС ex tempore.

При исследовании вирулицидной активности готовят 3-5 концентраций раствора ДС на стерильной дехлорированной водопроводной воде из расчета 1,0 мл раствора на каждый тест.

2. Постановка эксперимента. В исследуемые растворы погружают контаминированные ВС тесты по 5 штук на каждую экспозицию.

Момент смачивания тестов раствором ДС является началом опыта и с этого момента отсчитывают экспозицию. Через 5, 15, 30, 45, 60 мин стерильным охлажденным пинцетом или петлей извлекают по 5 тестов, помещают их в пробирку с бусами (из стекла, пластика) с 5 мл стерильного раствора нейтрализатора, помещают в шуттель-аппарат на 10 мин.

2.1. По истечении каждой экспозиции смывной жидкостью заражают культуру клеток (мышей, уток). Культуру клеток, отмытую от ростовой среды, оставляют на контакт на 30-60 мин для адсорбции вируса. Затем клетки промывают раствором Хенкса и заливают поддерживающей средой с сывороткой. Клетки инкубируют в термостате при оптимальной для конкретного вируса температуре.

2.2. Критерием вирулицидной активности ДС является снижение количества вируса не менее, чем на 4 при времени дезинфекционной выдержки не более чем 60 мин.

3. Контроль культуры клеток. С этой целью оставляют незараженными пробирки с культурой клеток и наблюдают в течение максимального срока опыта. При работе с культурой клеток в контрольных пробирках также, как и в опытных, при необходимости меняют поддерживающую среду в зависимости от изменения рН.

4. Контроль вируса. С этой целью 5 штук тестов, контаминированных вирусом, помещают в пробирку с 5 мл раствора Хенкса, выдерживают максимальную экспозицию, используемую в эксперименте; переносят в пробирки с 5 мл нейтрализатора и бусами, встряхивают в шуттель-аппарате в течение 10 мин и заражают культуру клеток (или другой чувствительный биологический объект) соответствующей дозой (0,2 мл или менее) жидкости, отмытой с тестов. Для выяснения количества жизнеспособного вируса проводят титрование.

Неспецифический цитопатический эффект (ЦПЭ) может быть при неполной нейтрализации дезинфектанта или цитотоксическом эффекте смеси "дезинфектант + нейтрализатор". Исключить неспецифический цитотоксический эффект в некоторых случаях удается путем дополнительного отмыва монослоя раствором Хенкса после контакта клеток с внесенной пробой с нейтрализатором в течение 60 мин для адсорбции вируса на поверхности клеток. По истечении этого времени добавляют поддерживающую среду. Избежать неполной нейтрализации можно путем тщательной отработки условий нейтрализации или поиска другого нейтрализатора.

5. Контроль контаминации вирусом тестов. С этой целью 5 штук тестов, контаминированных вирусом, помещают в пробирку с бусами и 5 мл физиологического раствора, отмывают в шуттель-аппарате в течение 10 мин и соответствующей дозой (0,2 мл или менее, как в опыте) жидкости, отмытой с тестов, заражают культуру клеток (или другой биологический объект). Для определения степени контаминации тестов вирусом проводят титрование.

6. Контроль полноты нейтрализации ДС. С этой целью 5 штук тестов (без вируса) помещают на максимальную экспозицию, используемую в эксперименте, в 5 мл раствора максимальной концентрации ДС. После этого тесты переносят на 5 мин в 5 мл раствора нейтрализатора, отмывают с бусами в течение 10 мин и вносят (по 0,2 мл или менее) смыв, с тестов в культуру клеток (или другой биологический объект).