Приложение ДВ (обязательное). Методы подсчета плотности (численности) клеток водорослей

Приложение ДВ
(обязательное)

Методы подсчета плотности (численности) клеток водорослей

ДВ.1 Определение плотности (численности) клеток водорослей методом прямого подсчета в камере Горяева

Подсчет плотности (численности) клеток водорослей в камере Горяева (см. рисунок ДВ.1) проводят следующим способом:

Содержимое колбы с водорослями перемешивают вручную, затем пипеткой отбирают суспензию водорослей (аликвоту) и наносят по одной капле на верхнюю и нижнюю части сетки счетной камеры Горяева. Затем камеру накрывают покровным стеклом, которое притирают по бокам до появления колец интерференции.

Примечания

1 Взятую в пипетку каплю суспензии водорослей необходимо очень быстро нанести на поверхность сетки, пока клетки водорослей не успели осесть в нижней части пипетки.

2 Нанесенную на поверхность сетки каплю суспензии водорослей следует быстро накрыть покровным стеклом и притереть его во избежание оседания клеток водорослей из капли.

3 После притирания покровного стекла и при подсчете клеток водорослей под микроскопом необходимо следить за тем, чтобы жидкость под покровным стеклом была распределена равномерно.

4 Камеры Горяева обычно имеют две сетки, разделенные желобком. В таких камерах наносят параллельно две капли суспензии водорослей.

Капли суспензии водорослей наносят не подряд из одной пипетки, а при двукратном взятии суспензии в пипетку из одной и той же колбы.

Через 1 - 2 мин после оседания клеток водорослей камеру Горяева помещают под объектив микроскопа и подсчитывают количество клеток водорослей во всех 25 больших квадратах сетки.

Примечания

1 После подсчета клеток водорослей камеру Горяева сразу же тщательно моют водопроводной водой и протирают мягкой тканью (например, фланелью).

2 Подсчет числа клеток водорослей в камере Горяева рекомендуется проводить при плотности (численности) клеток , так как при большей плотности (численности) клеток водорослей в суспензиях подсчет трудоемок и менее точен.

Допускается при подсчете численности клеток водорослей разбавление суспензии культуры водорослей питательной средой (например, разбавление в 10 раз при большой плотности клеток в исходной культуре, тогда численность клеток, полученную при подсчете в камере Горяева, умножают на коэффициент разбавления 10).

Рисунок ДВ.1 - Счетная камера Горяева

Плотность (численность) клеток водорослей X в 1  суспензии водорослей рассчитывают по формуле

,

(ДВ.1)

где m - суммарное количество клеток водорослей в учтенных больших квадратах сетки;

- коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.

Плотность (численность) клеток водорослей подсчитывают в каждой колбе, отбирая по две аликвоты.

За результат подсчета плотности (численности) клеток водорослей принимают среднеарифметическое значение не менее двух определений для каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы, в том числе и контрольной пробы, если абсолютная величина разности между ними не превышает 5% от среднего значения.

ДВ.2 Определение плотности (численности) клеток водорослей с использованием метода флуориметрии

ДВ.2.1 Приготовление проб

ДВ.2.1.1 Приготовление холостой пробы

Холостую пробу готовят следующим образом: в конические колбы вместимостью 250  вносят 100  питательной среды, приготовленной в соответствии с требованиями приложения ДА (для метода А - питательная среда Прата по ДА.1.2; для метода Б - питательная среда по ДА.2.2).

ДВ.2.1.2 Приготовление пробы контроля фона - по 5.3.3.

Для каждой анализируемой пробы подготавливают пробу контроля фона, представляющую собой концентрацию анализируемого вещества (кратности разбавления) по 5.3.2.6, но без добавления водорослей.

Примечание - При тестировании окрашенных или мутных проб может возникнуть мешающее влияние, обусловленное ослаблением светового потока, необходимого для роста клеток водорослей в анализируемой пробе. В таком случае измеряют интенсивность флуоресценции пробы без водорослей (фоновые растворы) и полученное значение вычитают из значения интенсивности флуоресценции, полученного при измерении пробы с водорослями.

ДВ 2.1.3 Приготовление контрольной пробы

Приготовление контрольной пробы проводят

- для метода А - по 5.4.3.2;

- для метода Б - аналогично 5.4.3.2, но с использованием питательной среды по ДА.2.2 (приложение ДА).

ДВ.2.2 Подготовка прибора к измерениям

Прибор готовят к работе в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации.

Устанавливают следующие параметры работы прибора:

- температура 20°С (при наличии термостатирования);

- область длин волн для возбуждения флуоресценции 400 - 500 нм; область длин волн для регистрации интенсивности флуоресценции 650 - 750 нм.

ДВ.2.3 Градуировка прибора

Градуировку прибора выполняют с использованием средств программного обеспечения прибора (или с использованием компьютерных систем обработки данных) с применением градуировочных растворов по ДВ.2.4. При этом коэффициент линейной корреляции полученных градуировочных характеристик должен быть не менее 0,99.

ДВ.2.4 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы готовят следующим образом: подготовленную культуру водорослей (см. приложение ДБ) вносят в колбы вместимостью 250  и разбавляют питательной средой, приготовленной в соответствии с требованиями приложения ДА (для метода А - среда Прата по ДА.1.2, для метода Б - питательная среда по ДА.2.2) в соотношении:

- 50  суспензии водорослей и 50  питательной среды (разбавление в два раза);

- 25  суспензии водорослей и 75  питательной среды (разбавление в четыре раза);

- 16,6  суспензии водорослей и 83,4  питательной среды (разбавление в шесть раз);

- 12,5  суспензии водорослей и 87,5  питательной среды (разбавление в восемь раз);

- 10  суспензии водорослей и 90  питательной среды (разбавление в 10 раз);

- 5  суспензии водорослей и 95  питательной среды (разбавление в 20 раз);

- 2,5  суспензии водорослей и 97,5  питательной среды (разбавление в 40 раз);

- 1,66  суспензии водорослей и 98,34  питательной среды (разбавление в 60 раз);

- 1,25  суспензии водорослей и 98,75  питательной среды (разбавление в 80 раз);

- 1,0  суспензии водорослей и 99  питательной среды (разбавление в 100 раз);

- 0,1  суспензии водорослей и 99,9  питательной среды (разбавление в 1000 раз).

ДВ.2.5 Установление градуировочной характеристики

Колбы с подготовленными по ДВ.2.4 градуировочными растворами закрывают ватно-марлевыми пробками, встряхивают, помещают в люмностат или климатостат и выдерживают 15 мин при температуре (202)°С и освещенности 3000 - 6000 лк (для метода А) или (232)°С и освещенности 6000 - 10000 лк (для метода Б), после чего содержимое каждой колбы (включая холостую пробу) тщательно перемешивают.

Затем, используя счетную камеру Горяева, под микроскопом подсчитывают (см. ДВ.1) в каждой колбе не менее чем в двух повторностях плотность (численность) клеток водорослей и рассчитывают их среднеарифметическое значение . После этого, в соответствии с инструкцией (руководством) по эксплуатации прибора, в каждой соответствующей колбе измеряют не менее трех раз значения интенсивности флуоресценции В, и подсчитывают среднеарифметическое значение.

Примечание - Измерения флуоресценции необходимо проводить сразу после подсчета клеток каждого заданного разведения (концентрации) в камере Горяева.

По полученным значениям и строят градуировочный график в виде функциональной зависимости от , используя компьютерную систему сбора и обработки данных.

При отсутствии компьютерных систем сбора и обработки данных функциональную зависимость от устанавливают по угловому коэффициенту (наклону) b , рассчитываемому по формуле

,

(ДВ.2)

где - плотность (численность) клеток водорослей в м градуировочной растворе, ;

- разница между значениями В, интенсивности флуоресценции i-го градуировочного раствора за вычетом среднеарифметического значения интенсивности флуоресценции холостой пробы;

i - число использованных градуировочных растворов (см. ДВ.2.4).

Примечание - Градуировочный график должен иметь линейную зависимость, в противном случае следует установить причину, заново приготовить градуировочные растворы и повторить градуировку.

ДВ.2.6 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Периодически, но не реже двух раз в год, проводят контроль градуировочной характеристики с использованием градуировочных растворов по ДВ.2.4.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если сохраняются угол наклона градуировочного графика и линейная зависимость интенсивности флуоресценции от плотности (численности) клеток градуировочных растворов.

ДВ.2.7 Проведение измерений

ДВ.2.7.1 Определение плотности (численности) клеток водорослей после культивирования

Колбу с подготовленными по приложению ДБ водорослями (для метода А - по ДБ.1.3; для метода Б - по ДБ.2.3), закрывают ватно-марлевой пробкой, встряхивают вручную, выдерживают 30 мин при температуре: (202)°С (для метода А) или (232)°С (для метода Б) и освещенности: 3000 - 4000 лк (для метода А) или 6000 - 7000 лк (для метода Б), затем снова перемешивают и из колбы автоматической пипеткой переносят в кварцевую кювету прибора аликвоту суспензии водорослей, равную объему кварцевой кюветы, кювету с аликвотой суспензии водорослей помещают в камеру прибора для измерения интенсивности флуоресценции суспензии водорослей.

Порядок проведения измерений - по ДВ.2.7.4.

Определение значений плотности (численности) клеток водорослей - по ДВ.2.8.

ДВ.2.7.2 Определение начальной плотности (численности) клеток водорослей перед тестированием

Конические колбы с пробами, подготовленными по 5.4.3.1 и 5.4.3.2, а также с пробами, подготовленными по ДВ.2.1, закрывают ватно-марлевыми пробками, встряхивают вручную, после чего помещают в климатостат и выдерживают 15 мин при температуре: (202)°С (для метода А) или (232)°С (для метода Б) и освещенности: 3000 - 4000 лк (для метода А) или 6000 - 7000 лк (для метода Б).

После выдерживания колб в климатостате, каждую колбу (включая колбы с холостой и контрольной пробами) встряхивают вручную. Затем из конкретной колбы отбирают автоматической пипеткой аликвоту пробы, равную объему кварцевой кюветы прибора, кювету с аликвотой пробы помещают в камеру прибора для измерения интенсивности флуоресценции клеток водорослей.

Порядок проведения измерений - по ДВ.2.7.4.

Определение значений плотности (численности) клеток водорослей - по ДВ.2.8.

ДВ.2.7.3 Определение плотности (численности) клеток водорослей после тестирования

После проведения тестирования каждую колбу (включая колбы с холостой и контрольной пробами) встряхивают вручную. Затем из конкретной колбы с пробой отбирают автоматической пипеткой аликвоту пробы, равную объему кварцевой кюветы прибора, кювету с аликвотой пробы помещают в камеру прибора для измерения интенсивности флуоресценции клеток водорослей.

Порядок проведения измерений - по ДВ.2.7.4.

Определение значений плотности (численности) клеток водорослей - аналогично ДВ.2.8.

ДВ 2.7.4 Порядок проведения измерений

Измерения интенсивности флуоресценции клеток водорослей в пробах проводят в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации прибора с учетом условий проведения градуировки прибора по ДВ.2.5.

Измерение значений интенсивности флуоресценции водорослей каждой аликвоты пробы проводят не менее трех раз в последовательности:

- измеряют значения интенсивности флуоресценции холостой пробы (см. ДВ.2.1.1);

- измеряют значения интенсивности флуоресценции клеток водорослей контрольной пробы (см. ДВ. 2.1.3);

- измеряют значения интенсивности флуоресценции клеток водорослей каждой заданной кратности разбавления (концентрации) анализируемой пробы, начиная с меньших концентраций (больших разбавлений);

- измеряют значения интенсивности флуоресценции пробы контроля фона (см. ДВ.2.1.2).

Примечание - После измерения интенсивности флуоресценции клеток водорослей контрольной пробы и затем после каждого измерения анализируемой концентрации (разбавления) пробы, кювету ополаскивают питательной средой.

ДВ.2.8 Обработка результатов измерений

ДВ. 2.8.1 При наличии компьютерной системы сбора и обработки данных порядок обработки результатов измерений устанавливают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации прибора или обработки данных на компьютере.

ДВ.2.8.2 При отсутствии компьютерной системы сбора и обработки информации значение интенсивности флуоресценции аликвоты пробы В рассчитывают по формуле

,

(ДВ.3)

где - среднеарифметическое измеренных значений интенсивности флуоресценции клеток водорослей анализируемой пробы, отн. ед.;

- среднеарифметическое измеренных значений интенсивности флуоресценции холостой пробы, отн. ед.

ДВ.2.8.3 Плотность (численность) клеток водорослей , , в аликвоте анализируемой пробы определяют по соответствующей градуировочной характеристике, используя значение В, рассчитанное по формуле (ДВ.3), либо рассчитывают по формуле

,

(ДВ.4)

где b - угловой коэффициент (наклон) градуировочной характеристики, рассчитанный по формуле (ДВ.2), .

ДВ.2.8.4 Если полученное значение, найденное по ДВ.2.8.3, превышает верхнюю границу диапазона градуировочной характеристики, то анализируемую пробу разбавляют так, чтобы значение в разбавленной пробе укладывалось в диапазон градуировочной характеристики, либо анализируют меньший объем пробы.

ДВ.2.8.5 Плотность (численность) клеток водорослей в анализируемой пробе X, , рассчитывают по формуле

,

(ДВ.5)

где - плотность (численность) клеток водорослей в аликвоте анализируемой пробы, рассчитанная по формуле (ДВ.4), ;

- вместимость мерной колбы, использованной для подготовки анализируемой пробы, ;

- объем аликвоты анализируемой пробы, ;

f - коэффициент разбавления анализируемой пробы, при этом, если пробу не разбавляли, то f принимают равным единице, если разбавляли (см. ДВ.2.8.4), то f рассчитывают по формуле

,

(ДВ.6)

где - вместимость мерной колбы, использованной при разбавлении анализируемой пробы, ;

- объем аликвоты анализируемой пробы, взятый для разбавления, .

ДВ.2.8.6 За результат измерений плотности (численности) клеток водорослей принимают среднеарифметическое результатов не менее двух определений, если абсолютная величина разности между ними не превышает 5% от среднего значения при доверительной вероятности 95%.

ДВ.3 Для определения плотности (численности) клеток водорослей допускается использовать турбодиметрию и фотометрию, при условии их достаточной чувствительности и корреляции с плотностью (численностью) клеток водорослей. При этом используемый прибор должен быть способен измерять такие низкие плотности (численности) клеток водорослей как , а также отличать эффект роста плотности (численности) клеток водорослей от эффекта мешающего воздействия, например, присутствия твердых частиц и цвета пробы. Спектрофотометры обладают достаточной чувствительностью для измерения плотности (численности) клеток водорослей при достаточной длине оптического пути (до 10 см), однако этот метод особенно чувствителен к мешающему влиянию суспендированного материала и окрашенных веществ при низких плотностях клеток водорослей. Для мутных проб предпочтительна флуориметрия (см. ДВ.2).