Приложение ДА (обязательное). Приготовление питательной среды

Приложение ДА
(обязательное)

Приготовление питательной среды

ДА.1 Приготовление питательной среды для методов А и В

ДА.1.1 Приготовление исходных растворов для питательной среды Прата

Исходные растворы N 1 - N 4 для питательной среды Прата готовят на дистиллированной воде (см. 5.2) из реактивов в массовых концентрациях, приведенных в таблице ДА.1.

Исходные растворы хранят при температуре 2°С - 4°С не более года.

ДА.1.2 Приготовление питательной среды Прата

Питательную среду Прата готовят следующим способом: в мерную колбу вместимостью 1000 вносят дистиллированной воды до метки, затем переливают в колбу вместимостью 2000  и добавляют по 1  исходных растворов N 1, N 2 и N 3 (см. таблицу ДА.1), перемешивают, плотно закрывают ватно-марлевой пробкой и колпачком, кипятят на водяной бане в течение 15 мин, после чего содержимое охлаждают. После охлаждения через 24 ч добавляют 1  исходного раствора N 4, снова перемешивают, плотно закрывают новой ватно-марлевой пробкой и колпачком.

Таблица ДА.1 - Питательная среда Прата для методов А и В

Номер исходного раствора	Реактив	Массовая концентрация реактива в исходном растворе,	Массовая концентрация реактива в питательной среде,
1	Азотнокислый калий по ГОСТ 4217 ()	100000	100,0
2	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523 ()	10000	10,0
3	Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный по ГОСТ 2493 ()	10000	10,0
4	Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147 ()	1000	1,0

Приготовленную питательную среду Прата хранят в условиях, исключающих воздействие света, при температуре (205)°С не более одного года.

ДА.2 Приготовление питательной среды для метода Б

ДА.2.1 Приготовление исходных растворов

Исходные растворы N 1 - N 4 для питательной среды готовят на деионизированной воде или воде альтернативной чистоты (см. 5.2). Состав исходного раствора и массовая концентрация реактивов приведены в таблице ДА.2.

Таблица ДА.2 - Питательная среда для метода Б

Номер исходного раствора	Состав раствора	Массовая концентрация реактива в исходном растворе,	Массовая концентрация реактива в питательной среде,
1	Аммоний хлористый по ГОСТ 3773 ()	1500	15,0
	Магний хлористый 6-водный по ГОСТ 4209	1200	12,0
	Кальций хлористый 2-водный	1800	18,0
	Магний сернокислый 7-водный по ГОСТ 4523	1500	15,0
	Кальций фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198	160	1,6
2	Хлорид железа 6-водный по ГОСТ 4147 ()	64	0,64
	Соль динатриевая этилендиамин-N,N,,-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б) по ГОСТ 10652	100	0,10
3	Борная кислота по ГОСТ 9656 ()*	185	0,185
	Марганец хлористый 4-водный по ГОСТ 612	415	0,415
	Цинк хлористый по ГОСТ 4529 ()	3,0	0,003
	Кобальт хлористый 6-водный по ГОСТ 4525	1,5	0,0015
	Медь двухлористая 2-водная по ГОСТ 4167	0,01	0,0001
	Натрий молибденовокислый 2-водный по ГОСТ 10931	7,0	0,007
4	Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201 ()	50000	50,0
* Борную кислоту растворяют при добавлении раствора гидроокиси натрия (NaOH) по ГОСТ 4328 молярной концентрацией 0,1 .

Приготовленные исходные растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

Примечание - Исходные растворы N 1 - N 3 допускается стерилизовать в автоклаве при температуре 120°С в течение 15 мин. Исходный раствор N 4 не стерилизуют в автоклаве, чтобы избежать потерь от разложения натрия углекислого кислого ().

Исходные растворы хранят при температуре 2°С - 4°С не более года.

ДА.2.2 Приготовление питательной среды

Питательную среду готовят следующим способом: е мерную колбу вместимостью 1000  вносят около 500  деионизированной воды (см. 5.2), добавляют 10  исходного раствора N 1 и по 1,0  исходных растворов N 2, N 3 и N 4 (см. таблицу ДА.2), после чего мерную колбу доводят до метки деионизированной водой.

Если необходимо автоклавирование раствора питательной среды, то исходный раствор N 4 добавляют после автоклавирования.

Питательную среду хранят в емкости из темного стекла с притертой крышкой (вместимостью до 10 ) при температуре (202)°С - не более года.

Перед использованием приготовленную питательную среду выдерживают на воздухе в течение 7 ч или аэрируют очищенным воздухом в течение 30 мин с использованием микрокомпрессора. Затем, при необходимости, доводят рН питательной среды до значения (8,10,2) путем добавления раствора соляной кислоты молярной концентрацией 1,0 или раствора гидроокиси натрия молярной концентрацией 1,0 .