Национальный стандарт РФ ГОСТ Р 54744-2011 "Продукция соковая. Определение хинной, яблочной и лимонной кислот в продуктах из клюквы и яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (утв. приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 919-ст)

Juice products. Determination of quinic, malic and citric acids in products from cranberry and apples by high-performance liquid chromatography

Дата введения - 1 января 2013 г.

Введен впервые

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения"

Сведения о стандарте

1 Разработан Академическим центром сертификации и стандартизации продуктов питания ОАО "Академсертификат"

2 Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 "Продукты переработки фруктов, овощей и грибов"

3 Утвержден и введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. N 919-ст

4 В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения:

- международного стандарта CODEX-STAN 247-2005 "Общий стандарт на фруктовые соки и нектары" (CODEX-STAN 247-2005 "Codex general standard for fruit juices and nectars") в части методов анализа и отбора проб соковой продукции;

- основные нормативные положения и метрологические характеристики документа АОАС 986.13 "Хинная, яблочная и лимонная кислоты в коктейлях из клюквенного сока и в яблочном соке" (АОАС Official Method 986.13 "Quinic, Malic and Citric Acids in Cranberry Juice Cocktail and Apple Juice")

5 Введен впервые

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию в части продуктов из клюквы и яблок и устанавливает метод определения содержания хинной, яблочной и лимонной кислот с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - метод ВЭЖХ).

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р 51239-98 Соки фруктовые и овощные. Метод определения L-яблочной кислоты

ГОСТ Р 51940-2002 Соки фруктовые и овощные. Метод определения D-яблочной кислоты

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочного стандарта в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Метод основан на предварительной твердофазной экстракции пробы с помощью одноразового картриджа для удаления соединений, мешающих определению, фильтровании и хроматографическом разделении в системе для проведения ВЭЖХ.

Хинная, яблочная, лимонная кислоты в ходе хроматографического определения разделяются с использованием двух обращенно-фазовых хроматографических колонок и регистрируются с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 214 нм. Расчет долей органических кислот, подтверждаемых хроматограммой, осуществляется путем сравнения с градуировочными растворами стандартных веществ.

4 Приборы и реактивы

4.1 Хроматограф для ВЭЖХ

Хроматографическая система для ВЭЖХ состоит из инжектора, спектрофотометрического детектора с возможностью регистрации фракций при длине волны 214 нм с разрешением 0,1 ед. оптической плотности, программно-аппаратного комплекса для обработки результатов хроматографического разделения (например, система Waters Associates, Inc., инжектор модель 7725i, детектор модель 2487, компьютерный интегратор Hewlett-Packard 3390 или эквивалентная система).

4.2 Колонка аналитическая

Для хроматографического разделения используют аналитическую колонку [1] модель Supelcosil LC-18 (или эквивалент) с размером частиц 5 мкм, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с последовательно подключенным картриджем модель Radial-Pak (Waters Associates, Inc. или эквивалент) с размером частиц 5 мкм, длиной 100 мм, с использованием радиального насосного модуля.

Картридж Radial-Pak допускается заменить на любую стандартную обращено-фазовую колонку из нержавеющей стали с размером частиц 10 мкм.

В системе перед колонкой [1] необходимо использовать предварительную обращенно-фазовую колонку модель Bio-Rad ODS-10 (или эквивалент). В качестве подвижной фазы используют фосфатный буфер. Скорость элюирования составляет 0,8 . Разрешение детектора должно составлять не менее 0,1 ед. оптической плотности.

4.3 Картридж для твердофазной экстракции

Для твердофазной экстракции используют одноразовые картриджи модель Sep-Pak (Waters Associates, Inc. или эквивалент).

4.4 Реактивы

4.4.1 Калий фосфорнокислый однозамещенный () по ГОСТ 4198, х.ч.

4.4.2 Кислота ортофосфорная массовой долей не менее 85%, х.ч.

4.4.3 Метанол (перед применением фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм), 95%, ч.д.а.

4.4.4 Фаза подвижная ВЭЖХ - раствор 0,2 М с 2,4 ед. рН

Для приготовления подвижной фазы (фосфатного буфера) для ВЭЖХ взвешивают 27,2 г

(4.4.1) в химическом стакане. В стакан добавляют дистиллированной воды (4.4.5) до объема 950 . С помощью рН-метра и ортофосфорной кислоты (4.4.2) доводят кислотность до 2,4 ед. рН. Раствор переносят в мерную колбу на 1000  и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм (4.7).

4.4.5 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

4.4.6 Кислота хинная (CAS-77-95-2), ч.д.а.

4.4.7 Кислота яблочная (CAS-6915-7), ч.д.а.

4.4.8 Кислота лимонная (CAS-77-92-9), ч.д.а.

4.4.9 Ацетонитрил, ч.д.а. (перед применением фильтруют через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм).

4.5 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336.

4.6 Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 и 1000 .

4.7 Фильтры мембранные размером 25 мм и размером диаметра пор 0,45 мкм.

4.8 Шприц медицинский вместимостью 10 .

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

5 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 26313.

6 Подготовка к определению

6.1 Перед подготовкой кондиционируют картридж (4.3) путем элюирования через него 10  смеси ацетонитрила (4.4.9) и дистиллированной воды в соотношении 50:50 с помощью медицинского шприца вместимостью 10 . После удаления шприца через картридж пропускают 10  воздуха. Затем проводят экстракцию 10  пробы. Отбрасывают первые 4 - 5  элюата и собирают следующие 4-5 . Полученную пробу фильтруют через мембранный фильтр и применяют для анализа методом ВЭЖХ.

6.2 Приготовление градуировочных растворов

В подходящей лабораторной емкости взвешивают с точностью 0,1 мг по 0,200 г хинную (4.4.6), яблочную (4.4.7) и лимонную кислоту (4.4.8). Переносят смесь кислот в мерную колбу на 100 . Объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через мембранный фильтр (4.7).

7 Проведение определения

7.1 Подготовка хроматографической системы

Хроматографическую систему последовательно кондиционируют метанолом (4.4.3) или смесью из метанола и дистиллированной воды в соотношении 70:30, затем дистиллированной водой и фосфатным буфером (4.4.4). В конце рабочего дня проводят очистку системы, используя перечисленные выше реактивы в обратном порядке.

Предупреждение: запрещен контакт метанола с фосфатным буфером!

7.2 Условия определения

Для проведения хроматографического разделения выполняют следующие условия:

- скорость потока 0,8 ;

- спектрофотометрическое детектирование фракций при 214 нм, комнатной температуре и разрешении детектора 0,1 ед. оптической плотности.

Система колонок считается подготовленной, если в соковой продукции из клюквенного сока и яблочном соке регистрируется видимое разделение между первым пиком сахарозы и хинной кислотой. В хроматографическую систему для проверки линейности измерений вводят от 5 до 20 мкл градуировочных растворов (4.1) после каждых двух разделений растворов проб, для хроматографического разделения проб используют по 5 мкл, полученных в ходе твердофазной экстракции (4.2). Проводят по два параллельных определения для градуировочных растворов и проб.

В хроматограмме регистрируется такая последовательность выхода кислот - хинная, яблочная, лимонная и фумаровая кислоты.

8 Обработка результатов определения

Процентную долю хинной, лимонной, яблочной или фумаровой кислоты в анализируемой пробе K, %, вычисляют по формуле

,

(1)

где РА - площадь пика, полученная при анализе пробы;

- площадь пика, полученная при анализе градуировочного раствора;

V - объем пробы;

- объем градуировочного раствора;

С - концентрация градуировочного раствора, %.

Примечание - Градуировочный раствор яблочной кислоты (L- или D,L-яблочной кислоты)* после разделения показывает в хроматограмме двойной пик, в котором второй - фумаровая кислота. Количество фумаровой кислоты, присутствующей в градуировочном растворе яблочной кислоты, настолько мало, что градуировочный раствор яблочной кислоты можно считать более чем на 99,9% свободным от фумаровой кислоты. Примеси не влияют на результаты определения.

_____________________________

* В связи с тем, что описанный в настоящем стандарте хроматографический метод не позволяет получить сведения об изомерах яблочной кислоты при необходимости идентификации продукции с целью выявления ее фальсификации путем добавления D-яблочной и/или D,L-яблочной кислоты, проводят дополнительное определение проб методом ферментативного анализа согласно ГОСТ Р 51239 и ГОСТ Р 51940.

Библиография

[1]	Journal of АОАС, 1986. - 69. - р. 594.